LUCRĂRI PRACTICE DE MUTAGENEZĂ ȘI IDENTIFICARE

A MUTAȚIILOR LA PLANTE

Mutaţia (noțiune introdusă de HUGO DE VRIES, în anul 1901) poate fi definită

ca fenomenul prin care se produc modificări ereditare în materialul genetic, modificări
ce nu sunt provocate de recombinări genetice sau de segregare.
Mutaţiile pot fi definite şi ca “modificări discontinue cu efect genetic” (MAYR, 1963).

CLASIFICAREA MUTAȚIILOR

În funcție de modul de apariție, mutațiile se clasifică în:

- mutaţii naturale sau spontane, care apar printr-un proces întâmplător
și necontrolabil sub influența diferiților agenţi mutageni din natură
(radiaţii, schimbări de temperatură etc.)
- mutaţii artificiale sau induse, provocate pe cale experimentală de către om,
prin utilizarea de agenți mutageni.
Frecvenţa mutaţiilor induse este mai mare decât a celor spontane, oscilând între 10 -3-
10-5/genă/generaţie. Unele gene pot fi afectate cu o frecvenţă mai mare decât altele. Astfel, în
funcție de frecvenţa mutaţiilor, pot fi evidenţiate:
- gene mutabile, care sunt mai instabile şi prezintă o frecvenţă mai mare
a mutaţiilor comparativ cu celelalte gene din organism,
- genele mutatoare care măresc frecvenţa mutaţiilor altor gene;
- gene stabile, care suferă foarte rar modificări structurale.
În funcție de unitatea materialului genetic care este afectată, mutaţiile pot fi clasificate
în :
- mutaţii genice, când afectează genele;
- mutaţii cromozomiale, când afectează cromozomii;
- mutaţii genomice, în cazul când este afectat întregul genom.
Mutaţiile genice pot modifica structura și funcția diferitelor tipuri de gene (structurale,
operatoare, reglatoare), care iau parte la realizarea reglajului genetic. De asemenea, atunci
când modificarea este limitată la o singură pereche de nucleotide sau la un singur codon,
aceste mutații intragenice sunt denumite mutații punctiforme.
Mutațiile cromozomiale sunt modificări structurale ale cromozomilor, afectând poziția
și numărul genelor în cromozomi. Cele mai importante mutații cromozomiale sunt delețiile,
duplicațiile, inversiile, translocațiile și aneuploidia.
Deleţia reprezintă pierderea de către un cromozom a unui fragment acentric,
cu una sau mai multe gene. Deleţiile au efecte dăunătoare sau pot fi letale, dacă sunt
de anvergură. La plantele superioare, deficienţele sunt transmise numai pe cale maternă nu şi
pe cale paternă, întrucât polenul afectat de deficienţă nu este viabil sau nu poate fecunda
oosfera.
Duplicaţia constituie fenomenul invers deleţiilor, prin care un fragment
de cromozom este ataşat la un cromozom omolog. Duplicaţiile se declanşează odată
cu deleţiile, ca efect al schimbului de fragmente între cromozomii omologi.
 Cromozomul omolog care cedează un segment sau o genă devine deficient pentru
genele respective, iar cromozomul acceptor are două seturi de gene pentru segmentul
duplicat.
Duplicaţiile afectează organismele în măsura mai mică decât deleţiile, neavând efect
letal. Deţin un rol important în evoluţia speciilor, putând sta la originea unora dintre sistemele
de gene multiple.
Inversia se realizează prin schimbarea cu 180º a poziţiei unui segment
de cromozom care a suferit două rupturi simultane.
Dacă fragmentul rotit conţine centromerul, inversia este pericentrică, iar dacă ruptura a
avut loc într-un singur braţ al cromozomului ea se numeşte paracentrică şi nu include
centromerul. În mod obişnuit, inversiile apar în profaza meiozei, în urma ruperii cromatidelor
sau cromozomilor.
Inversiile au şi ele un rol important în evoluţia unor specii, contribuind la amplificarea
variaţiei lor genetice.
Translocaţia reprezintă schimbul reciproc de fragmente cromozomiale între
cromozomii neomologi (translocație reciprocă). Un alt tip de translocație este reprezentat de
translocația robertsoniană, definită prin alipirea cap la cap a doi cromozomi întregi, omologi
sau neomologi. Translocaţia afectează conjugarea normală a cromozomilor în profaza I a
meiozei (zigoten), determinând apariţia de gameţi anormali în proporţie de până la 60-70%.
Translocaţiile s-au manifestat activ în procesul de evoluţie. Se consideră că la originea
apariţiei hominidelor a stat un fenomen de translocaţie care a facilitat trecerea de la 48 de
cromozomi la 46 de cromozomi, prin fuziunea a doi cromozomi acrocentrici.
Aneuploidia (de la gr. aneu = variabil) reprezintă o variație cromozomială noneuploidă
în sensul că, organismele afectate de acest fenomen prezintă în celulele somatice unul sau
mai mulți cromozomi în plus sau în minus față de celulele diploide normale.
Mutațiile genomice (poliploidia, haploidia) sunt modificări numerice ale cromozomilor,
comparativ cu numărul cromozomilor din cariotipul normal. Atunci când se modifică numărul
de seturi de cromozomi (un set de cromozomi reprezintă totalitatea cromozomilor dintr-un
complement haploid), fenomenul poartă denumirea de poliploidie (euploidie).
Atunci când un organism prezintă în nucleii celulelor somatice un singur set de
cromozomi, fenomenul poartă denumirea de haploidie.
După modul de exprimare fenotipică ele pot fi clasificate în:
- mutaţii dominante;
- mutații recesive.
La organismele haploide, ca urmare a prezenței unui singur set de cromozomi
în nucleii celulelor somatice, mutațiile se manifestă indiferent de dominanța sau recesivitatea
lor. La organismele diploide sau poliploide, cel mai uşor se pot evidenţia mutaţiile dominante,
care se manifestă fenotipic şi în stare heterozigotă, dar frecvența acestora este, în general,
redusă. Marea majoritate a mutațiilor sunt recesive și acestea pot să se menţină într-o
populaţie timp îndelungat, atât timp cât genele respective se găsesc în stare heterozigotă.
Când genele devin homozigote mutaţiile pot să se exteriorizeze, putând fi utile purtătorului, în
condiţiile unui mediu schimbat. Atunci când mutaţiile induc un efect negativ la purtător, ele sunt
eliminate în procesul selecţiei naturale sau artificiale.
În funcţie de utilitatea lor pentru organism, mutaţiile pot fi:
- folositoare (avantajoase);
- nefolositoare (dezavantajoase);
 - neutre.
Având în vedere că în natură, procesul mutaţional este aparent întâmplător
şi necontrolabil, majoritatea mutaţiilor sunt considerate neutre, fără să afecteze în mod pozitiv
sau negativ individul purtător. Pe de altă parte, selecţia naturală favorizează mutaţiile care sunt
avantajoase purtătorilor lor. Aceste mutaţii au un rol important în evoluţia speciilor, constituind
o sursă inepuizabilă de variabilitate genetică.
Dacă mutaţiile afectează celulele liniei germinate, atunci ele pot fi transmise ereditar
prin gameţi la noua generaţie.
Atunci când mutațiile afectează materialul genetic din nucleii celulelor somatice,
acestea nu se transmit în descendenţă decât în cazul în care ţesutul sau organul respectiv
este utilizat pentru regenerarea de indivizi, care au apoi posibilitatea să se reproducă
pe cale vegetativă.
În funcţie de locul unde sunt plasate genele, mutaţiile pot fi:
- autozomale, plasate pe autozomi;
- heterozomale, plasate în heterozomi (mutaţii care manifestă sex-linkage);
- citoplasmatice (ale genelor extranucleare).
În funcție de influența lor asupra viabilității organismului, mutațiile sunt:
- viabile, care nu modifică viabilitatea organismului;
- letale, care afectează gene de importanţă majoră în organism, prin a căror blocare se
realizează moartea individului înainte de maturitatea sexuală;
- semiletale, care determină în procent mai mare sau mic de supraviețuire a
indivizilor.
În funcție de sensul modificării, mutațiile pot fi:
- directe, când gena normală, dominantă se transformă într-una alelă (mutantă), recesivă;
- de reversie (back-mutation), când gena mutantă, recesivă, se transformă într-
una normală, dominantă;
- polialele, când o genă suferă transformări repetate în mai multe gene mutante alele, de
regulă, recesive.

FACTORII MUTAGENI

Factorii mutageni care intervin în declanşarea mutaţiilor pot fi de natură fizică, chimică
şi biologică.
Factorii mutageni fizici sunt radiațiile și șocurile de temperatură.
Radiaţiile pot fi ionizante şi neionizante, producând modificări genice şi structural
cromozomiale prin ruperea legăturilor chimice din molecula de ADN.
Radiaţiile ionizante, electromagnetice (razele X şi razele gamma) şi corpusculare
(razele beta, alfa, protonii, neutronii rapizi şi lenţi) produc efecte mutagene puternice
prin fenomenul de ionizare. Ele induc mutaţii proporţional cu creşterea cantităţii de energie sau
cu intensitatea iradierii ţesuturilor vii. Radiosensibilitatea celulelor se dovedeşte direct
proporţională cu capacitatea lor de înmulţire şi invers proporţională cu gradul lor
de diferenţiere.
Doza de radiații primită de un organism se măsoară cu ajutorul contoarelor
Geiger-Müller, iar unitatea de măsură este denumită röentgen. Un röentgen (r) reprezintă
cantitatea de radiații capabile să producă 2,08x10 9 perechi de ioni într-un cm3 de aer
la 00C și la presiunea atmosferică de 760 mm Hg.
Unitatea de măsură pentru doza de radiații absorbită de 1 g de materie vie sau nevie
este Gray (Gy) sau o unitatea de măsură mai veche, denumită rad (radiation absorbed dose),
1 rad = 0,01 Gy.
Influența radiațiilor ionizante asupra organismelor este apreciată cu ajutorul dozelor
letale.
Doza letală 100 (DL100) reperezintă cantitatea de radiații care determină moartea
tuturor indivizilor supuși iradierii. Deci, frecvența mutațiilor induse la DL100 este foarte mare și
afectează gene de importanță majoră în organism.
Doza letală 50 (DL50), respectiv cantitatea de radiaţii ce provoacă moartea a cel puţin
50% din indivizii expuşi iradierii variază de la 450 r la om, 10.000 r la Pisum sativum, Hordeum
vulgare, Secale cereale, Zea mays, 15.000 r la Triticum vulgare, 20.000 r la Vitis vinifera,
30.000-40.000 la Solanum lycopersicum etc.
Pentru inducerea mutațiilor se optează adesea pentru doze de iradiere sub DL50, care
compensează frecvența redusă a modificărilor apărute la nivelul materialului genetic cu o rată
de supraviețuire mai ridicată a materialului biologic supus iradierii.
Radiaţiile neionizante sunt radiaţiile ultraviolete (UV). Fiind caracterizate
de o capacitate penetrantă redusă, radiațiile neionizante sunt utilizate, în general, pentru
inducerea de mutaţii la microorganisme şi la polen.

Factorii mutageni chimici. Efectul mutagen al substanţelor chimice depinde

de natura lor şi de starea ADN din celulă în momentul acţiunii acestora.
Substanţele chimice mutagene au o structură chimică extrem de variată, de aceea o
clasificare a lor după acest criteriu este extrem de grea. După P AMFIL (1980) agenţii chimici
pot fi clasificați în două grupe mari:
 agenţi mutageni care acţionează în perioada de biosinteză replicativă a acizilor
nucleici;
 agenţi mutageni chimici care acţionează direct asupra acizilor nucleici
în repaus.
Din prima categorie fac parte:
- azaserina, metiluretanul, cofeina, teobromina, care sunt inhibitori de concurenţă ai
precursorilor acizilor nucleici;
- substanţe analoage bazelor purinice şi pirimidinice (2-aminopurina (2-AP), 5-
ioduracilul (5-IU), 2-oxipurina (2-OP) etc.), care pot fi incorporate în molecula de ADN, în locul
bazelor azotate naturale, conducând la apariţia de mutaţii.
Din a doua categorie fac parte: acidul nitros (HNO2), hidroxilamina şi hidrazina
şi substanţele alkilante (dietilsulfatul, etilmetansulfonat), cu acţiune directă asupra acizilor
nucleici în repaus. Etilmetansulfonatul (EMS) este unul dintre cei mai utilizați agenți chimici
mutageni, dar are și un puternic efect carcinogen, necesitând utilizarea sa cu maximă
precauție.
Substanţele chimice mutagene prezintă câteva caracteristici care le deosebesc, sub
aspectul acţiunii lor, de mutagenii fizici:
- au o eficienţă mutagenică mai mare (de 2-100 ori mai mare) decât radiaţiile;
- majoritatea mutaţiilor provocate nu sunt letale;
- produc frecvent mutaţii somatice.
 Factorii mutageni biologici sunt toxinele animale și vegetale, virusurile şi
micoplasmele, care acţionând asupra materialului ereditar din celulă pot provoca mutaţii
genice şi aberaţii cromozomiale.
În plus, alte tehnici biologice de provocare experimentală a mutațiilor presupun cultura
de calus pentru inducerea variației somaclonale și stimularea transpoziției.
Elementele genetice transpozabile sau transpozonii sunt segmente de ADN
de 750-40.000 perechi de baze, capabile să circule în cadrul genomului atât la procariote, cât
şi la eucariote şi să se insere în diverse locusuri, determinând mutaţii genice, restructurări
cromozomiale, activarea unor gene silenţioase sau inactivarea unor gene etc.

INDUCEREA MUTAȚIILOR LA PLANTE

Diversele metode aplicate pentru inducerea mutațiilor la plante se deosebesc prin

natura agentului mutagen utilizat, în funcție de specie, respectiv soi și de sensibilitatea
acestora la acțiunea factorilor mutageni, precum și de momentul în care se realizează
experimentul. De asemenea, metodele de tratament se deosebesc prin doza de iradiere și
debitul radiațiilor, intervalul de variație al temperaturii (în cazul agenților fizici), concentrația,
pH-ul, temperatura, durata tratamentului și concentrația de O2 (în cazul agenților chimici).
Lucrările de mutageneză fizică, folosind surse diferite de radiații, se realizează numai
de către personal autorizat, în condiții stricte de securitate. Manipularea materialului biologic
ulterior iradierii, nu implică nici un risc.
Pentru inducerea experimentală a mutațiilor poate fi folosit orice organ vegetativ
purtător de țesuturi meristematice, precum semințe (uscate, umede sau în curs
de germinare), plantule, lăstari, muguri vegetativi sau floriferi, bulbi, tuberculi, rizomi).
Țesuturile meristematice se formează prin diviziunea mitotică a celulelor
meristematice. Astfel, mutația sau mutațiile induse într-o celulă meristematică
vor fi transmise tuturor celulelor rezultate prin diviziune mitotică și implicit țesuturilor sau
structurilor vegetale care se vor diferenția din acestea. Este recomandat ca tratamentul cu
agenți mutageni să se realizeze în stadiile timpurii ale formării mugurilor vegetativi, pentru a
evita apariția himerelor (propagarea celulelor mutante doar în anumite sectoare tisulare).
Materialul biologic ideal pentru inducerea mutațiilor este reprezentat însă
de semințe, deoarece utilizarea lor permite un control relativ ușor al factorilor de mediu,
precum umiditatea, temperatura, concentrația de O2, care pot influența eficiența tratamentului.
În plus, un număr mare de semințe pot fi suspuse simultan tratamentului mutagen, oferind
posibilitatea selecției ulterioare a unui număr mai mare de mutante, ce vor putea fi analizate.
Concentrația agentului chimic sau doza radiațiilor administrate trebuie să determine
moartea a aproximativ 50% dintre semințe, pentru a obține o frecvență maximă a mutațiilor.
Stimularea regenerării de lăstari din celule sau fragmente de țesuturi somatice,
menținute in vitro pe medii nutritive sterile, cu o compoziție adecvată de fitohormoni
și regulatori de creștere, reprezintă o altă sursă de variație genetică. Mutațiile induse prin
cultura in vitro de celule și țesuturi somatice poartă denumirea de variație somaclonală.
Apariția variației somaclonale în procesul multiplicării clonale a fost raportată
la numeroase specii vegetale, ca de exemplu porumb, grâu, ovăz, orez, cartofi, vița de vie,
căpșun etc.
 Inducerea mutațiilor la plante s-a dovedit extrem de utilă în obținerea de soiuri
și varietăți importante din punct de vedere economic. Astfel, mutante valoroase au fost induse
la Malus domestica, Prunus avium și Prunus cerasus, la diferite specii de Citrus, la Oryza
sativa, Sorghum bicolor, Glycine max (SLEPER și POEHLMAN, 2006). În general, prin
stimularea mutagenezei se urmărește obținerea de mutante cu toleranță crescută la condiții
nefavorabile de mediu, la boli și dăunători, cu productivitate sporită sau mutante caracterizate
de o consistență sporită a fructelor, absența semințelor etc.
La plantele ornamentale s-a urmărit inducerea de mutații care să influențeze favorabil
numărul florilor sau inflorescențelor, perioada de înflorire, culoarea petalelor și a frunzelor,
forma florilor și a frunzelor etc.

IDENTIFICAREA MUTAȚIILOR LA PLANTE

Apariția unor modificări în fenotipul plantelor tratate cu agenți mutageni facilitează

detectarea mutațiilor induse. Mutațiile care induc modificări morfologice la nivelul diverselor
organe ale plantei (culoarea petalelor, forma frunzelor, conținutul redus de clorofilă, reducerea
habitusului, dezvoltarea rudimentară a unor organe) sunt mai ușor de identificat comparativ
cu modificările fiziologice și biochimice (productivitatea, capacitatea sporită sau redusă de
producție a substanțelor proteice, glucidelor, vitaminelor, rezistența sporită la condiții
nefavorabile de mediu, la boli și dăunători).
În funcție de factorul mutagen utilizat, plantele regenerate din semințele sau organele
tratate se notează utilizând diferite simboluri. Astfel, litera X simbolizează aplicarea unui
tratament cu raze X, R se folosește ca indiciu pentru aplicarea unui tratament cu radiații
ionizante, C pentru agenții mutageni chimici, iar M este un simbol general, ce poate fi folosit
pentru a indica utilizarea unui agent mutagen. Pentru generațiile succesive de plante obținute
după aplicarea tratamentului cu un agent mutagen, se utilizează simbolurile X1, X2… Xn sau
R1, R2 … Rn sau C1, C2 … Cn sau M1, M2 … Mn.
În general, plantele M1 obținute prin germinarea semințelor tratate vor avea
o vigoare redusă și un procent însemnat dintre cele care vor ajunge la maturitate vor
fi sterile și nu vor forma semințe.
La plantele autogame selecția mutantelor dominante se face în prima generație (M1)
obținută după acțiunea agentului mutagen asupra celulelor embrionare inițiale sau asupra
zigotului, iar selecția mutantelor recesive se realizează în generațiile segregante M2 și M3.
Marea majoritate a mutațiilor (spontane sau induse) sunt recesive. În consecință, astfel
de mutații se exprimă fenotipic numai dacă sunt în stare homozigotă și pot fi identificate la
indivizii recesivi homozigoți din generațiile segregante. Atunci când plantele autogame supuse
tratamentului mutagen sunt heterozigote pentru caracterul afectat de mutația unei gene
recesive, modificarea expresiei sale fenotipice este evidență chiar în prima generație.
La plantele alogame mutațiile dominante se exprimă fenotipic în prima generație (M1)
dacă agenții mutageni acționează asupra celulelor mamă ale gameților sau în cea de-a doua
generație (M2) dacă tratamentul este aplicat zigotului imediat după fecundare. Exprimarea
mutației recesive se realizează prin consangvinizare, în urma căreia gena recesivă afectată
de mutație ajunge în stare homozigotă. Mutația se exprimă fenotipic în M1 dacă gena afectată
se găsește în stare homozigotă sau în generația M2 dacă gena transformată prin mutație se
află în stare heterozigotă.
 APLICAȚIE

Utilizând plante de Hordeum vulgare din herbar, se vor identifica diversele mutante
clorofiliene. Acestea au fost clasificate de către botanistul și geneticianul suedez G USTAFFSON
(1940) în următoarele categorii:
- albina – frunzele sunt caracterizate de absența clorofilei;
- xantha – la nivelul frunzelor se remarcă excesul de caroten;
- virescens – frunzele sunt de culoare verde deschis;
- chlorina - frunzele sunt de culoare verde-gălbuie;
- alboviridis – vârful frunzelor este alb, iar baza verde;
- alboxantha - vârful frunzelor este alb, iar baza galbenă;
- tigrina – frunzele prezintă benzi transversale, brune sau galbene;
- striata – benzi longitudinale, albe sau galbene;
- maculata – absența clorofilei pe porțiuni foliare mai mici sau mai mari.