lOMoARcPSD|8315514

LP 13 Imunoglobuline, complement seric, CRP

Biochimie LP Anul 1 (Universitatea Dunarea de Jos din Galati)

StuDocu nu este sponsorizat sau avizat de nicio universitate

Desc?rcat de Ale Alex (botalexandru@yahoo.com)
 lOMoARcPSD|8315514

LP 13. Imunoglobuline. Complement seric. Proteina C reactivă-

metoda dublei difuzii Ouchterlony; metoda latex / 3 ore

Imunologia clinică foloseşte numeroase tehnici pentru studiul proteinelor care

mediază imunitatea umorală, ca şi pentru studiul celulelor care iau parte la imunitatea
celulară.

Reacţia dintre un antigen (Ag) şi un anticorp (Ac) presupune legarea grupării

determinante a Ag (epitop) de situsul de combinare al Ac (paratop). Legarea este
dependentă de complementaritatea sterică a Ag şi Ac şi se realizează cu participarea
unor forţe de legătură necovalente (forţe van der Waals, forţe electrostatice, legături
de hidrogen şi legături hidrofobe) care asigură stabilitatea complexului Ag-Ac.
Metodele aplicate pentru evidenţierea reacţiei Ag-Ac se pot împărţi în reacţii de
precipitare, aglutinare, neutralizare, reacţii care folosesc complement sau reactivi
marcaţi (fluorocromi, izotopi, enzime).

IMUNOGLOBULINELE

Imunoglobulinele sunt un grup de glicoproteine cu structură asemănătoare care

îndeplinesc funcţia de anticorpi. Anticorpii sunt imunoglobuline care se sintetizeazã
în organism dupã pãtrunderea unui antigen şi au proprietatea de a se cupla specific cu
antigenul inductor şi de a-i anihila acţiunea nocivã.

În 1970, prin consens între specialişti, OMS a stabilit ca substanţele cu proprietãţi de

anticorp, sã fie grupate în categoria imunoglobulinelor, pornind de la faptul cã toate
substanţele din acest grup au funcţie imunitarã şi sunt cuprinse în fracţia globulinicã a
serului.

La electroforeza proteinelor imunoglobulinele migrează în zona γ (gamma). Orice

modificare a valorii gamma a electroforezei ar trebui completată de dozarea
imunoglobulinelor. Anticorpii nu sunt numai gamaglobuline. Existã şi alte
globuline cu funcţie de anticorp, dupã cum existã şi gamaglobuline care nu au
activitate de anticorp (de exemplu, proteinele patologice Bence-Jones).
Deşi sunt asemãnãtoare ca structurã, moleculele de imunoglobuline formeazã o familie
de o diversitate imensã, neîntâlnitã la nici o altã proteinã. Diversitatea lor uriaşã este
ordonatã în clase şi subclase, în primul rând pe baza compoziţiei în aminoacizi. Exista
astfel, 5 clase de imunoglobuline: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, care sunt împărțite la
rândul lor în subclase.

Creşterea patologică a imunoglobulinelor poate fi difuză (policlonală) sau discretă

(monoclonală) iar scăderea acestora este dată de cauze primare (ereditare) sau
secundare (apar în cursul a diferite boli).

Desc?rcat de Ale Alex (botalexandru@yahoo.com)

 lOMoARcPSD|8315514

Imunoglobulinele sunt formate din:

Imunograma înseamnă dozarea împreună a imunoglobulinelor de tip IgA, IgG si IgM,

acestea putând fi prescrise si separat. De asemenea, imunoglobulinele de tip E (IgE)
se dozează separat, având semnificaţie diagnostică diferită.

Dozarea imunoglobinelor se face prin imunodifuzie radială simplă sau metoda

Mancini.

Imunodifuzia radială simplă sau imunodifuzia simplă bidimensională a fost imaginată

de Mancini, Carbonara şi Heremans în 1965.

Această metodă presupune difuzia unui reactant (în faza lichidă) într-un gel în care
este înglobat celălalt reactant. În această tehnică Ac trebuie să fie în stare pură.

Dimensiunea haloului de precipitare este direct proporţională cu concentraţia Ag ce

difuzează şi invers proporţională cu concentraţia şi înălţimea de gel în care sunt
înglobaţi.
Pentru obţinerea unei dimensiuni convenabile a zonei de precipitare şi un contur bine
delimitat, concentraţia Ac înglobat în gel trebuie aleasă în funcţie de titrul antiserului
şi concentraţia Ag testat. Cantitatea de Ag introdusă în godeuri nu trebuie să
depăşească capaciatea de legare a Ac înglobat. Timpul necesar difuziei complete este
în funcţie de temperatura la care are loc reacţia (370C), de greutatea moleculară şi
concentraţia Ag.
Concentraţia Ag (proteinei) se stabileşte în funcţie de curba etalon trasată cu trei
diluţii ale serului de referinţă. Rezultatele metodei se exprimă în mg/dl.
Aplicaţii posibile sunt determinările cantitative pentru: imunoglobuline (IgG, IgA,
IgM), complement (C3), alfa-1 antitripsină, siderofilină, proteina C-reactivă (CRP),
etc.

Desc?rcat de Ale Alex (botalexandru@yahoo.com)

 lOMoARcPSD|8315514

Valori de referinţă

IgA: 60-400 mg/dl (miligrame la decilitru)

IgG: 700-1500 mg/dl
IgM: 60-300 mg/dl

Valorile de referinţă variază funcţie de metoda sau aparatul folosit.

Variaţii patologice

Creşteri difuze (policlonale)

 Infecţii acute şi cronice: IgA creşte mai ales în infecţii tegumentare, intestinale, urinare,
pulmonare iar IgM în infecţii virale primare, boli tropicale şi infecţii intrauterine;
 Infecţii bacteriene cronice: cresc toate imunoglobulinele;
 Afecţiuni hepatice: în ciroza biliară primară creşte considerabil IgM, în hepatita cronică
creşte IgG şi uneori IgM, în ciroza portală creşte IgA şi uneori IgG;
 Boli autoimune: Lupus, sindr. Sjögren, tiroidita cronică, creşte în principal IgG dar şi alte
tipuri;
 Boli alergice şi astm: creşte IgE

Creşteri discrete (monoclonale)

Imunoglobulinele monoclonale (numite şi paraproteine) sunt molecule cu structură identică

secretate de o singură clonă de celule în curs de multiplicare anarhică (asemănătoare proceselor
neoplazice); concentraţia plasmatică a acestora creşte foarte mult, electroforetic se traduc printr-un
peak (vârf) monoclonal (aspect caracteristic al electroforezei). Aceste creşteri monoclonale pot fi de
cauze benigne sau maligne.

 Infecţii acute ( creşteri tranzitorii);

 Tumori benigne ale limfocitelor B (creşteri persistente);
 Mielom multiplu şi plasmocitom;
 Superproducţie a limfocitelor B din limfoame, leucemie limfatică cronică,
macroglobulinemia Waldenström sau boala lanţurilor grele;
 Crioglobulinemii;
 Amiloidoză.

Scăderi ale imunoglobulinelor apar în:

 Agamaglobulinemii şi hipogamaglobulinemii - afecţiuni rare, genetice, deficitele sunt

globale (IgG, IgM, IgA);
 Disgamaglobulinemii - deficitul uneia sau mai multor clase de imunoglobuline în diferite
combinaţii;
 Prematuri şi sugari
 Leucemie limfatică cronică;
 Boala Hodgkin;
 Mielom multiplu;
 Diabet;
 Insuficienţă renală;
 Pierderi anormale de proteine (sindrom nefrotic, arsuri, enteropatii).

Desc?rcat de Ale Alex (botalexandru@yahoo.com)

 lOMoARcPSD|8315514

SISTEMUL COMPLEMENT

Sistemul complement este un set de proteine şi glicoproteine plasmatice, care

reprezintã circa 10% din globulinele serului normal uman şi al vertebratelor, cu rol
esenţial în apãrarea organismului. Majoritatea componentelor sale sunt proteine cu
acţiune enzimaticã (proteaze). Ele nu sunt imunoglobuline şi concentraţia lor
plasmaticã nu se modificã dupã imunizare.

Proteinele complementului C se gãsesc în plasma tuturor vertebratelor. Ele acţioneazã

nespecific şi completeazã efectele imunitare specifice ale anticorpilor.

Se cunosc 11 proteine ale căii clasice, 3 proteine suplimentare ale căii alterne şi 6
proteine cu efect reglator (inhibitorii). Componentele cãii clasice sunt numerotate cu
cifre arabe, în ordinea descoperirii lor, de la 1 la 9 şi se activeazã în secvenţa 1, 4, 2,
3, 5 – 9. Majoritatea lor sunt beta-globuline (beta-1, beta-2).

Proteinele complementului sunt alcãtuite din 1-2 catene peptidice, reunite prin punţi
S-S, cu excepţia lui C4, care are 3 catene, iar C1q are o structurã particulară unică.

Unele componente ale cãii alterne sunt notate cu litere mari: B, P, D.

Fragmentele peptidice derivate din proteolizã sunt notate cu sufixele a, b etc. (de
exemplu, C3a, C3b). Fragmentele b sunt mai mari şi se combinã direct cu o ţintã
membranarã, iar fragmentele a sunt mai mici, se elibereazã în soluţie şi stimuleazã
rãspunsul inflamator. Starea activatã a factorilor C se marcheazã cu o barã: de
exemplu C1.

PROTEINA C REACTIVA - CRP

Metoda Ouchterlony – metoda imunochimică bazată pe reacția de precipitare in

mediu solid – imunodifuzie radiala dubla.
Metoda latex – metoda imunochimica bazata pe reactia de aglutinare.

PROTEINA C REACTIVA - CRP

Definitie

Este o proteină “clasică“ de fază acută a inflamației, care apare ca răspuns rapid la
bolnavii cu:
- diferite infectii microbiene (cu streptococ, pneumococ etc.)
- in inflamatii (reumatism),
- in infarctul miocardic, in tumori, etc.

Desc?rcat de Ale Alex (botalexandru@yahoo.com)

 lOMoARcPSD|8315514

Rolul
Proteina C reactiva este sintetizată in ficat si inițiază opsonizarea și fagocitoza
celulelor care pătrund in organism, dar

- rolul ei principal rezida in fixarea si neutralizarea substanțelor toxice

endogene provenite din leziunile celulare.

Proteina C reactiva este o proteina care nu exista in mod normal in serul uman.

Semnificație clinică

- Ea are importanță alături de alte teste cum ar fi VSH și fibrinogen.

- Toate cele trei teste indică prezența unui sindrom inflamator (este marker al
inflamatiei).
- Prin proteina C reactiva se poate măsura și riscul ca un pacient să prezinte o
boală cardiovasculară. Astfel, dacă el are o concentrație de sub 1mg/l CRP
atunci riscul este practic 0, iar dacă are peste 3mg/l CRP atunci riscul este
foarte ridicat.

Dozarea CRP e utilă in:

 depistarea proceselor inflamatorii sistemice (cu exceptia lupusului eritematos

diseminat, si a rectocolitei hemoragice)
 aprecierea eficacitatii tratamentului antiinfectios, sau antiinflamator
 detectia precoce a unor complicatii postoperatorii (infectii ale plagii, tromboze,
pneumonie)
 diferentierea intre infectie si reactie de rejet dupa transplant de maduva osoasa

Reactia prin care se pune in evidenta proteina C reactiva este o reacție in urma
caruia are loc un fenomen de precipitare (imunodifuzia dublu radiala-Ouchterlony)
sau aglutinare (metoda latex).
Proteina C reactiva precipita prin testarea serului de cercetat cu un antiser specific
in caz de boli inflamatorii.

Testul de imunodifuzie dublă radială (Ouchterlony)

Principiul metodei
Această metodă se bazează pe difuzia antigenului şi a anticorpilor unul către celălalt,
într-un mediu gelozat, care iniţial nu are încorporat nici un reactant (Răpuntean,
1994). În două godeuri alăturate, decupate dintr-un gel de agar se umplu, unul cu
proteină anticorp şi unul cu proteină antigen omoloagă. Ag şi Ac vor difuza unul spre
celălalt iar la locul de întâlnire va apărea o linie de precipitat

Materiale și reactivi:
- ser de examinat, proaspăt sau păstrat la –20oC.
- ser de referinţă (conţine PCR – Ag – standard)

Desc?rcat de Ale Alex (botalexandru@yahoo.com)

 lOMoARcPSD|8315514

- gel de agar
- lamă de microscop
- Antiser monospecific

Mod de lucru
- Agarul topit se toarnă pe lama de microscop în cantitate de 3,5 ml gel.
- După solidificare s-au decupat godeuri de 3 mm diametru, în model radial,
unul central şi 6 periferice.
- Godeurile se umplu cu reactanţi cu ajutorul micropipetei, astfel: în godeul
central se pune antiser iar în celelalte se repartizează: în I şi IV ser de referinţă iar în
II, III, V şi VI serurile de cercetat.
- Placile au fost puse la termostat, în cutii umede, pentru a se împiedeca
uscarea agarului.
- Citirea se face în cameră obscură, la o sursă de lumină, (după 2 ore sunt
vizibile, după 4 ore sunt clare, după 24 ore sunt mult întărite).

Rezultatele se exprimă în prezent sau absent

Determinarea proteinei C-reactivă (CRP) prin metoda LATEX

Este un test calitativ sau semicantitativ.

CRP este o α-globulină, al cărui nivel creşte în procesele inflamatorii, în faza acută a
unor afecţiuni şi după operaţii chirurgicale.

Principiul metodei
Reactivul CRP-Latex este o suspensie de particule de polistiren sensibilizate cu
anticorp uman de proteină C-reactivă. Când reactivul ajunge în contact cu serul care
conține anticorpi de CRP, are loc o reacţie antigen-anticorp ușor de vizualizat, fiind o
reacție de aglutinare a latexului.

Reactivi şi materiale
- Reactiv CRP Latex: 2 sau 4 ml de reactiv latex
- Control pozitiv: 0,5 ml ser uman, CRP>15mg/l
- Control negativ: 0,5 ml ser uman, CRP≤1mg/l
- Lame şi baghete de unică folosinţă
- Plăci de reacţie cu 6 locuri

Proba: ser proaspăt sau conservat, nehemolizat, fără impurități

Mod de lucru
- Se aduc reactivii şi serurile de analizat la temperatura camerei
- Se pune o picătură (40-50μl) de probă şi 1 picătură din fiecare control în
godeuri separate de pe placă
- Se adaugă 1 picătură reactiv latex
- Se amestecă cu bagheta picăturile

Desc?rcat de Ale Alex (botalexandru@yahoo.com)

 lOMoARcPSD|8315514

- Se observă prezenţa sau absenţa aglutinării în 3 min

Rezultate
1. Rezultat pozitiv – apare aglutinare vizibilă a particulelor de latex
Aceasta reprezintă un nivel de CRP ≥6mg/l în serul testat
2. Rezultat negativ – nu apare aglutinare în interval de 3 min
Aceasta reprezintă un nivel de CRP <6mg/l în serul testat

Proteina C reactivă nu este prezentă în serul pacienţilor aparent sănătoşi.

Determinarea CRP poate servi la monitorizarea activităţii inflamatorii, fie ca rezultat
al terapiei, fie al remisiunii spontane

Valori normale: <6 mg/l

Valori crescute:
I. În faza iniţială a inflamaţiei în
-infecţii bacteriene: pneumonii
-infarct miocardic, stări postoperatorii, afecţiuni maligne, mielom
multiplu, lupus eritematos sistemic (LES)
II. Alte afecţiuni
-febre reumatice, afecţiuni reumatice diverse, colagenoze, tuberculoza
activă

http://www.scribd.com/doc/39480672/Lucrari-Practice-Imunologie-Mg-2008

Desc?rcat de Ale Alex (botalexandru@yahoo.com)