Reacția de polimerizare în lanț a ADN

PCR = Polymerase Chain Reaction

Detectia ampliconilor
 INTRODUCERE

Obiectivul acestui experiment este de a face cunoscute studentului principiile,

tehnica si aplicatiile PCR.
PCR este o metoda de amplificare a ADN, o abordare alternativa la
experimentele de clonare.
Necesita un amestec de reactie care sa contina:
•ADN tinta sau gena ce urmeaza a fi amplificate
•o ADN-polimeraza termostabila (Taq-polimeraza)
•2 primeri (20-45 nucleotide) sintetizati chimic, in concentratii intotdeauna in
exces fata de gena tinta; prezinta o clema G/C la capatul 3’
•4 tipuri de dNTP
•Mg2+
Intr-o solutie tampon
Reactie ciclica ce cuprinde 3 etape:
1.Denaturarea (94oC)
2.Alinierea amorselor (42 - 60oC)
3.Extensia amorselor sau elongarea (72oC)
Aceste cicluri se repeta de regula de 20 – 40 ori.
Produsii PCR (ampliconii) sunt apoi separati si identificati prin
electroforeza in gel de agaroza.
 PROTOCOL DE LUCRU

Prepararea gelului de agaroza

1. Diluaţi tamponul concentrat (50x) cu apă distilată pentru a obţine tampon
1x, Tab).
2. Intr-un flacon Erlenmeyer cu capacitatea de 250 ml amestecaţi pulberea de
agaroză cu tamponul 1x conform Tab.
Prepararea gelului de agaroza 0,8%

Dimensiunea Cantitatea Tampon Apa Volumul

gelului de agaroza conc. (50X) distilata total (ml)
(cm) (g) (ml) (ml)

7x7 0,23 0,6 29,4 30

3. Dizolvaţi pulberea de agaroză prin fierbere în cuptorul cu
microunde timp de 1 min. Scoateţi cu grijă flaconul Erlenmeyer şi
amestecaţi prin rotire. Continuaţi încălzirea încă 15 sec. până
când agaroza se dizolvă complet (soluţie clară).
4. Răciţi agaroza la 60oC. In acest timp securizaţi capetele
matriţei cu profilele din cauciuc şi aşezaţi pieptenii.
5. Turnaţi soluţia de agaroză în matriţă şi aşteptaţi solidificarea
gelului (20 min).
6. Apoi, eliminaţi capetele matriţei şi îndepărtaţi pieptenii.
7. Plasaţi matriţa cu gelul pe platforma cuvei de electroforeză.
Acoperiţi gelul cu tamponul de electroforeză 1x (în Tab. este redat
volumul recomandat). ! Gelul trebuie să fie submers.

Tamponul de electroforeza pentru M6+

Volumul total Dilutie

necesar
Tampon concentrat 50x (ml) Apa distilata (ml)
(ml)
300 6 294
8. Încărcaţi întreaga probă (35-38 µl) în godeuri în ordinea indicată în
Tab. !Inainte de încărcarea probelor asiguraţi-vă că gelul este corect
orientat în cuva de electroforeză. Probele de ADN vor migra catre polul
pozitiv (rosu).
Incarcarea gelurilor

Banda 1 Tub A Martor ADN de referinta

Tub B Control 0 cicluri

Banda 2

Tub C Proba dupa 10 cicluri

Banda 3

Tub D Proba dupa 30 cicluri

Banda 4

Tub E Proba dupa 50 cicluri

Banda 5

Banda 6 Tub F Proba mentinuta peste noapte

9. Conectaţi electrozii la transformator şi porniţi electroforeza (stabiliţi
voltajul şi timpul conf indicatiilor primite)

Relatia timp-puterea curentului electric

(pentru un gel cu 0,8% agaroza)

Volti Minute (min./max.)

150 15/20

125 20/30

70 35/45

50 50/80
10. După ce electroforeza este completă, scoateţi gelul cu matriţa şi
treceţi la etapa de colorare cu InstaStainRBlue.
11. Aşezaţi cu grijă gelul prin alunecare într-o tavă mică curată care să
conţină minim 75 ml apă distilată sau tampon de electroforeză. Gelul
trebuie sa fie complet acoperit.
12. Plasaţi usor cardul InstaStainRBlue deasupra lichidului cu fata
colorata (partea albastra) catre gel. Eliminati cardul dupa 30 secunde.
Acoperiţi tăviţa cu o folie de plastic pentru a preveni evaporarea. Lasaţi
gelul să absoarbă lichidul colorat cel puţin 3 ore. Dacă este necesar
poate să rămână peste noapte.
13. Vizualizaţi rezultatele cu un sistem de vizualizare în lumină albă.
ADN va apărea sub formă de benzi de culoare albastru închis pe un
fond de lumină albastru deschis.
 INTERPRETAREA REZULTATELOR

Măsurarea şi înregistrarea distanţelor de migrare

Măsuraţi distanţa parcursă de fiecare fragment standard de ADN de la
marginea cea mai de jos a godeului până la marginea cea mai de jos a
fiecărei benzi. Notaţi distanţa în mm. Repetaţi pentru fiecare fragment
de ADN standard (6751; 3652; 2827; 1568; 1118; 825; 630 p.b.). In
acelaşi mod măsuraţi şi notaţi distanţele de migrare pentru fiecare
dintre fragmentele probelor necunoscute.
Trasarea curbei standard
Deoarece viteza de migrare este invers proporţională cu log10 din lungimea
fragmentelor, datele înregistrate sub forma unui grafic semilogaritmic vor
forma o linie dreaptă ceea ce ne permite să analizăm un interval exponenţial
al mărimii fragmentelor.
Primul ciclu pe axa y corespunde la lungimea 100-1000 p.b., al doilea la 1000
– 10000 p.b., ş.a.
Pentru a crea o curbă standard pe hârtia semilogaritmică, înregistraţi distanţa

fiecărui fragment ADN standard migrat pe axa x (în mm) comparativ cu

mărimea lui pe axa y (în p.b.). După ce toate punctele au fost înregistrate,

utilizaţi o riglă pentru a trasa o linie dreaptă între puncte. Linia trebuie să aibă

un nr. aproximativ egal de puncte de o parte şi de alta. Este în regulă dacă

linia trece prin puncte.

Determinarea lungimii fragmentelor necunoscute

•Marcaţi distanţa de migrare a fragmentului necunoscut pe axa x a

graficului. Trasaţi o linie verticală ce se întinde de la punct până la locul

unde intersectează curba standard.

•De la punctul de intersecţie, trasaţi o a doua linie, de această dată

orizontală, către axa y. Valoarea la care această linie intersectează axa y

reprezintă mărimea aproximativă a fragmentului în p.b.

•Repetaţi pentru fiecare fragment din proba necunoscută.

 REZULTATE si DISCUTII

Nr. godeului Tubul Proba Lungimea (pb)

1 A Martor ADN standard -
2 B Control 0 cicluri

3 C Proba dupa 10 cicluri

4 D Proba dupa 30 cicluri

5 E Proba dupa 50 cicluri

6 F Proba mentinuta peste noapte