DETERMINAREA POTENŢIALULUI UREAZIC AL SOLULUI

Principiul metodei este după Kuprevici V. F. (1951 - Biologhiceskaia aktivnost pocivî I

metod ee opredeleniia. Dokl. Akad. Nauk, L XXIX, 5: 863 - 866), dar amoniul rezultat se
determină cantitativ pe cale colorimetrică, cu reactivul Nessler.

Mersul analizei
Prepararea amestecului de reacţie: 5 g de sol proaspăt, cernut, se introduc într-un flacon de
100 de ml. Se adaugă 10 ml de soluţie de uree 1 %, preparată într-o soluţie de azidă de sodiu
0.015%, care are rol de antiseptic nevolatil. Flaconul se închide etanş cu un dop, se agită în
mână, pentru omogenizarea solului şi soluţiei şi se introduce în termostat, la 28 0C, pentru 24 de
ore.
Determinarea cantităţii de amoniu eliberat enzimatic din uree se face adăugând în fiecare
flacon, după scoaterea sa din termostat, câte 70 de ml de soluţie de sulfat de potasiu 0,1 n
(0,78%). Se agită 15 minute şi se filtrează prin hârtie de filtru calitativ. Filtratul trebuie să fie
perfect limpede. Din filtrat se iau 1-10 ml, se introduc în flacon cotat de 50 de ml, se adaugă 2 ml
de soluţie de sare Seignette 25%, se adaugă apă de conductă până la 2/3 din flacon, apoi se
adaugă 1 ml de reactiv Nessler, se aduce la volum de 50 de ml (la cotă) tot cu apă de conductă,
se agită, pentru omogenizare şi după 30 de minute se colorimetrează. Nu se întârzie
colorimetrarea peste 20 de minute, pentru că soluţia se tulbură şi nu mai poate fi colorimetrată
corect. Atenţie! Este bine să se lucreze cu apă de conductă sau apă distilată produsă fără fierbere
cu electrozi. Sub influenţa electrolizei apare o oarecare cantitate de amoniu care poate fi
evidenţiată cu reactiv Nessler; la colorare cu reactiv Nessler, este bine să se lucreze cu cantităţi
mici de filtrat pentru că filtratele de la unele soluri (mai ales acide) contribuie la tulburarea
soluţiei colorate cu reactiv Nessler. Dacă se face colorimetrarea cu fotocolorimetru FEK, care
lucrează cu cuve de diferite dimensiuni, la colorare slabă este preferabil să se lucreze cu cuve
largi, capabile să asigure citirea extincţiei, decât să se mărească volumul filtratului introdus la
colorare.

Prepararea reactivilor şi a etalonului de NH4+

Prepararea reactivului Nessler: I. Clorură mercurică (HgCl 2) - 17 g se dizolvă în 300 de ml
de apă distilată. II. Iodură de potasiu (KI) - 35 g se dizolvă în 100 ml de apă distilată. Soluţia se
toarnă apoi într-un balon de 1500 ml, marcat pentru 1000 ml. Se toarnă apoi încet soluţia I în
soluţia II până când nu se mai dizolvă precipitatul roşu de mercur care se formează. Mai departe,
reactivul se aduce la volum de 1000 ml cu o soluţie de NaOH 20% şi se adaugă din nou din
soluţia I, până nu se mai dizolvă precipitatul care se formează. Culoarea soluţiei limpezite trebuie
să fie slab gălbuie. Dacă soluţia este incoloră, se adaugă iar puţină soluţie I şi se lasă iar să se
limpezească. Reactivul gata preparat se decantează într-o sticlă brună cu dop etanş şi se păstrează
la întuneric.
Prepararea etalonului de NH4+
Se cântăresc 0,2966 g de clorură de amoniu (NH 4Cl) se dizolvă în apă şi se aduce la volum
de 100 ml, tot cu apă de conductă. Din această soluţie se iau 10 ml şi se trec într-un flacon cotat
de 1000 de ml şi se completează la cotă, cu apă de conductă. Aceasta este soluţia de lucru (SL) şi
conţine 0,01 mg/ml de NH4+. Din aceasta se iau 10 ml (adică 0,1 mg/ml de NH 4+) care se
transferă în flacon cotat de 50 ml. Se adaugă apă de conductă până la 2/3 din flacon, apoi se
adaugă 2 ml de soluţie de sare Seingette 25% şi după agitare se mai adaugă 1 ml de reactiv
Nessler. Se agită iar şi se lasă 30 de minute pentru maturarea culorii galbene a lichidului. În
următoarele 20 de minute trebuie să se efctueze colorimerarea, cu filtru albastru (pentru
fotocolorimetru) şi la 425 nm lungime de undă pentru spectofotometru, extincţia corespunzând la
concentraţia de 0,002 mg NH4+/ml în flacon (0,1 mg NH4+ ml din SL: 50 ml (flacon) = 0,002
mg).
Calcularea rezultatelor analizei
Nivelul potenţialului ureazic al solului se exprimă prin activitatea ureazică pe timpul a 24
de ore, la 280C, după formula:
Ep∗C∗F∗100∗KU
AU mg NH4+ /100 g sol s.u. = Eet∗V ∗5

În care:

AU reprezintă activitatea ureazică;

Ep - extincţia de la probă;

F - cantitatea totală de lichid filtrat (80 ml);

C - concentraţia etalonului (0,1 mg NH4+ /ml);

100 - coeficient de raportare la 100 g de sol proaspăt;

Eet - extincţia citită la etalonul de NH4+;

V - volumul de lichid introdus în flaconul de 50 ml luat pentru colorare (ml);

5 - grame de sol luat la analiză (g);

KU - coeficient de raportare a rezultatului analizei la sol complet uscat (s.u.).

Prin introducerea valorilor din legendă apare formula:

Ep∗0,1∗80∗100∗KU
AU mg NH4+ /100 g sol s.u. = Eet∗V ∗5

După simplificările posibile formula devine:

Ep∗160∗KU
+
AU mg NH4 /100 g sol s.u. = Eet∗V
DETERMINAREA POTENŢIALULUI FOSFATAZIC AL SOLULUI

Principiul metodei după Ştefanic G., Jarnea, S., Tomescu, E. (1965 - (Total phosphatasic
capacity. Symp on Methods in Soil Biology. Bucharest: 145-149., SNRSS), cu perfecţionarea
adusă de Irimescu, M. şi Ştefanic, G. (1998 - A new method for determining soil phosphatasic
capacity. NEWSLETTER, 3+4: 3-8, European Soc. Soil Conservation, Carnfield Univ. Pres).
Metoda se bazează pe existenţa substraturilor cu fosfor, originare în sol şi enzimele fosfatazice
acumulate, de asemenea, în sol. Pentru evaluarea activităţilor fosfatazice se administrează, în
amestecul de reacţie enzimatică, o cantitate de glucoză, cu rol de capcană pentru a se combina cu
ionii fosfaţi eliberaţi enzimatic sau existenţi în sol în momentul efectuării analizei. În loc de a se
determina cantitatea ionilor de fosfat liberi şi eliberaţi în sol prin diferite activităţi biotice şi
enzimatice, se determină cantitatea de glucoză necombinată, după combinarea acesteia cu ionii
fosfatici eliberaţi enzimatic, în timpul analizei. Această tehnică indirectă de evaluare a cantităţii
ionilor fosfatici a avut în vedere că ei se pot combina în sol cu ionii de calciu, de fier, aluminiu
etc. şi nu mai pot fi identificaţi prin metodele curente de evidenţiere a ionului fosfat. Cantitatea
de glucoză necombinată în amestecul de reacţie (cu sol activ şi inactiv enzimatic) se scade din
cantitatea de glucoză găsită necombinată în amestecul de sol în care nu au activat enzimele,
obţinându-se, prin echivalenţă chimică, cantitatea de ioni fosfatici eliberaţi enzimatic.
Convertirea glucozei în fosfor se face cu ajutorul unui indice care reprezintă câtul raportului de
combinare a fosforului cu glucoza, determinat experimental de autorii metodei, în limitele de
concentraţii posibile ale fosforului eliberat enzimatic + fosforul liber în sol şi glucozei adăugate
în amestecul de reacţie (P mg/glucoză mg = 0,04).

Mersul analizei
Amestecul inactiv enzimatic. Într-un flacon de plastic de 100 ml, care se poate închide
etanş, se introduc 5 g de sol proaspăt, cernut. Se adaugă 10 ml de soluţie de glucoză de 0.25
g/100 ml, preparată în soluţie antiseptică de azidă de sodiu de 0,015%. După 15 minute se
adaugă 40 ml de soluţie de alaun de potasiu (0,3%), se agită 15 minute şi se filtrează prin hârtie
de filtru calitativ. Din filtratul perfect limpede se transferă 1 ml într-o eprubetă gradată, de 25 ml,
se adaugă reactivul de culoare RDNS (pentru dozarea glucozei necombinate), se omogenizează,
se introduce în apă clocotind şi se ţine exact 5 minute, după care se răceşte brusc, în apă rece
curentă, se completează cu apă distilată la cota de 25 ml, se omogenizează şi se măsoară extincţia
la 540 nm, la spectofotometru.
Amestecul activ enzimatic. Într-un flacon de plastic de 100 ml, care se poate închide etanş,
se introduc 5 g din aceiaşi probă de sol, din care se realizează amestecul inactiv de reacţie. Se
adaugă 10 ml de soluţie de glucoză de 0.25 g/100 ml, preparată în soluţie antiseptică de azidă de
sodiu de 0,015% se omogenizează prin scurtă agitare în mână şi se introduc la termostat la 28 0C,
pentru 24 de ore. La scoaterea din termostat, se adaugă 40 ml de soluţie de alaun de potasiu
0,3%, restul operaţiunilor decurgând la fel ca la amestecul inactiv enzimatic, inclusiv colorarea şi
măsurarea extinţiei la spectrofotometru.

Prepararea etalonului de glucoză. Se prepară o soluţie de glucoză (A) de 1% în azidă de

sodiu de 0,015 %. Etalonul de glucoză se realizează cu 2 ml din soluţia A (în 3 repetiţii) + 8 ml
de apă distilată, conţinând 2 mg de glucoză/ml. Din acest etalon se ia 1 ml, se colorează cu
RDNS şi se măsoară extincţia la spectrofotometru, la fel ca la amestecul inactiv enzimatic şi cel
activ.

Calcularea rezultatelor analizei

După măsurarea extincţiilor la: etalon, amestecuri inactive şi active enzimatic, se
procedează la scăderea extincţiei probei active (a fiecăreia din repetiţiile variantei experimentale)
din extincţia medie a repetiţiilor probei inactive a variantei corespunzătoare celei active
enzimatic:
Media Epi - Epa 1, 2 sau 3 (repetiţii) = ΔE. Calculul se face conform formulei:
ÄΕ∗C∗F∗100∗0 ,04∗KU
P mg/100 g sol s.u. = Eet∗V ∗5
În care:
C - reprezintă 2 mg glucoză/ ml etalon;
F - volumul soluţiei pentru filtrare (50 ml);
100 - coeficient de raportare la 100 g sol s.u.;
0,04 - coeficient de echivalare a glucozei în fosfor (P);
Eet - extincţia de la etalon;
V - volumul de filtrat (ml) introdus la colorare;
5 - g de sol luat în analiză;
KU - coeficient de raportare la 100 g de sol uscat.
După simplificări, formula devine:
ÄΕ∗80∗KU ÄΕ
=
P mg/100 g sol s.u. = Eet Eet *80*KU
Determinarea respiraţiei potenţiale al solului

Determinarea cantitativă a respiraţiei potenţiale a solului s-a realizat conform principiului

luat din lucrarea: Dommergue, 1960 – La notion de coefficient de mineralisation du carbon dans
les sols, cu respirometrul Ştefanic Gh. (1988 – Determinarea nivelului potenţial al solurilor în
condiţiile întreţinerii concentraţiei oxigenului în respirometru. Probleme de agrofitotehnie
teoretică şi aplicată, X, 4: 327-332; Bilogical definition, quantifying method and agricultural
interpretation of soil fertility. Romanian Agricultural Research, 2: 107-116).

Descrierea respirometrului
Dispozitivul constă dintr-un flacon pentru sânge (de 150 ml) în care se introduc pe rând: 20
ml soluţie de NaOH 0,2 n; un pahar cilindric prevăzut cu două orificii, la partea superioară (2a),
care conţine, aşezat oblic, un tub din sticlă sau plastic pentru asigurarea drenajului aerului la
fundul paharului; un alt pahar, identic (2b), aşezat deasupra paharului 2a, conţinând 0,200 g
MnO2 (cu rol de catalizator pentru descompunerea apei oxigenate); un tub comunicant (4) se
introduc, înainte de montare în respirometru, 2,5-3 ml de apă oxigenată 20% v/v şi apoi se
montează în aparat.
Mersul analizei
Se iau 20 g de sol reavăn, cernut, se amestecă cu 0,4 g de pulbere de paie de grâu, prealabil
sterilizate, şi se introduc în paharul 2a, în jurul tubului. Solul este tasat prin 10 lovituri uşoare.
Prin tubul de drenaj se introduc 3-4 ml apă distilată pentru a aduce solul la umiditatea de 40-60%
din capacitatea totală (capilară) pentru apă, optimă pentru procesul de respiraţie a microflorei
aerobe din sol. Paharele cu sol se ţin la incubat, la 28 0C, 3 zile, pentru declanşarea proceselor
biologice stimulate de adaosul de pulbere de paie. În flaconul de sânge se introduc 15 ml de
soluţie de NaOH 0,2 n, apoi, paharul cu sol este introdus în flaconul de sânge, cu ajutorul
pensetei speciale, ale cărei vârfuri îndoite spre exterior intră în orificiile de la partea superioară a
paharului. Peste paharul cu sol se introduce paharul cu catalizator, iar în acesta se introduce tubul
comunicant, care conţine apă oxigenată şi odată cu acesta se fixează etanş dopul de cauciuc prin
care trece spre exterior coada tubului comunicant. Astfel montat, respirometrul este introdus în
termostat, la 280C şi se pune în funcţie şi micul ventilator de uniformizare a temperaturii din
termostat. După o incubare de 24 ore, flaconul este scos din termostat, se extrage apa oxigenată
rămasă în tubul comunicant cu ajutorul unui ac lung de seringă. Dacă acul de seringă este ataşat
printr-un tub de cauciuc la un vas de vid (Kitasato sau Bunzen) racordat la o trompă de apă, sau
dacă acul de seringă este cuplat cu o pară piriformă, operaţia de scoatere a excesului de apă
oxigenată este mult uşurată. Apa oxigenată poate fi utilizată imediat pentru a doua montare a
respirometrului. Se continuă operaţiile inverse, de demontare a respirometrului, scoţând dopul cu
tubul comunicant, apoi paharul cu catalizator (care se introduce într-un termostat la 1000C pentru
a se evapora apa şi astfel paharul cu catalizator se poate refolosi), apoi cu ajutorul pipetei
speciale se scoate, pe jumătate, paharul cu pământ, şi în poziţia aceasta, cu ajutorul unui jet mic
de apă distilată-fiartă (liberă de CO2), este spălat de urmele de soluţie de NaOH. Apele de spălare
sunt recuperate cantitativ în flaconul de sânge. După îndepărtarea paharului cu sol, (care va fi
folosit pentru a doua determinare, de alte 24 de ore, a respiraţiei), se va proceda la determinarea
cantităţii de CO2 respirată. Pentru aceasta, în flaconul de sânge, care conţine soluţia de NaOH, se
introduce o baghetă magnetizabilă. Flaconul este aşezat pe un agitator magnetic şi în timpul
rotirii baghetei se pipetează 2 ml de soluţie de clorură de bariu (20%) şi o picătură de soluţie de
timolftalein 1% în alcool care va colora lichidul din flacon în albastru. Clorura de bariu va
reacţiona cu hidroxidul de sodiu, formând clorura de sodiu, carbonatul de bariu şi va fi şi un
exces (mai mare sau mai mic, depinzând de nivelul respiraţiei) de hidroxid de sodiu. Cu ajutorul
unei biurete de precizie se va începe titrarea excesului de NaOH cu ajutorul unei soluţii de HCl
0,1 n, cu factor cunoscut. Titrarea este foarte sensibilă, astfel încât virajul culorii se produce cu o
singură picătură de acid clorhidric.
Calcularea rezultatului
1 ml de HCl 0,1 n corespunde la 0,1 m.e. de CO 2, adică, la 2,2 mg CO 2. Pentru a elimina
eroarea produsă de cantitatea necontrolată de CO2 pe care o absoarbe NaOH din atmosfera
flaconului de sânge în timpul manipulării, sau pe care îl conţine NaOH, se introduc, în paralel, o
dată cu montarea flacoanelor de sânge cu probele de sol şi 3 flacoane asemănătoare, montate
identic, deci 3 repetiţii, dar în loc de sol se pune un volum egal de apă distilată, fiartă şi răcită
(liberă de CO2), ca să se asigure acelaşi volum de aer în flaconul de sânge. Din numărul de
mililitri de acid clorhidric consumaţi la titrare în flacoanele de control (cu apă în loc de sol) se va
scădea numărul de mililitri de acid clorhidric folosiţi la titrare în flacoanele cu sol, obţinându-se
astfel cantitatea de CO2 respirată de proba de sol, conform formulei de calcul:
CO2 mg/ 100 g sol s.u. = (A-B)*f*2,2*5*KU, adică (A-B)*11*KU
 A reprezintă nr. ml de HCl 0,1 n cu care s-au efectuat titrările (media celor 3 repetiţii) la
flacoanele de control;
B - nr. ml de HCl 0,1 n cu care s-a efectuat titrarea conţinutului de NaOH necombinat din
respirometrul cu sol (separat pentru fiecare repetiţie a probei de sol);
2,2 - echivalentul CO2 în mg pentru 1 ml HCl 0,1 n cu care se calculează cantitatea de CO 2
respirată.;
f - factorul soluţiei HCl 0,1 n;
5 - coeficient de raportare a celor 20 g de sol luate în analiză la 100 g de sol;
KU - coeficientul de corecţie pentru umiditatea solului (proba cu care s-a lucrat).
Determinarea factorului de corecţie de normalitate a HCl 0,1 n
Se cântăresc 1, 9011 g de borax (Sörensen) cu 10H2O şi se dizolvă în 100 ml de apă
distilată fiartă. Se distribuie câte 10 ml de soluţie borax în 5 baloane conice, se adaugă 1-2
picături de indicator mixt şi se titrează cu HCl preparat ca să conţină 0,1 n HCl. Se calculează
media consumului de acid la titrare şi rezultatul se introduce în formula:

0 , 019011∗10
f = 0 ,019011∗ml
în care:
0,019011 reprezintă g de acid boric;
10 - ml de soluţie borax;
ml - ml de HCl preparat pentru 0,1 n