LP 22. Examenul bacteriologic al puroiului.

Identificarea bacililor gram-negativi non-fermentativi

Obiective. La sfârşitul lucrării practice studenţii vor fi capabili să:

1) Precizeze agenţii etiologici implicaţi în producerea supuraţiilor.
2) Definească termenii: puroi, supuraţie.
3) Prezinte modalităţile corecte de prelevare şi transport al puroiului.
4) Enumere etapele examenului de laborator al puroiului.
5) Descrie testele utilizate pentru identificarea bacililor gram-negativi non-fermentativi.

I. Examenul bacteriologic al puroiului.

Puroi = exsudat fibrinos care conţine leucocite şi microorganismul implicat.

Supuraţie = formarea puroiului. O supuraţie este cauzată de evoluţia spontană a unei infecţii cu germeni
piogeni (care provoacă apariţia puroiului). Ea poate proveni dintr-o colecţie purulentă (abces, cu localizare
superficială sau profundă), putând fi localizat într-un organ (ex. ficat, plămân, creier, rinichi). O supuraţie se
elimină dintr-un abces fie spontan, prin intermeidul unei fistule (canal patologic), fie prin incizie chirurgicală.

Etiologie bacteriana (mai frecvent):

Staphylococcus aureus
Streptococcus pyogenes
Escherichia coli
Klebsiella spp.
Enterobacter spp.
Pseudomonas aeruginosa
Acinetobacter baumannii
Mycobacterium tuberculosis
Anaerobi: Clostridium, Porphyromonas, Prevotella, Fusobacterium

Prelevarea puroiului:
Prelevarea din colecţii purulente.
- se recoltează prin puncţie aspiraţie cu un ac suficient de gros adaptat unei seringi etanşe;
- puroiul se transportă la laborator în maximum 1-2 ore;
- in suspiciunea de infectie determinată de anaerobi puroiul se transferă în flacoane cu atmosferă anaerobă sau
în tuburi cu bulion tioglicolat;
- “seringa anaerobă”- asigură supravieţuirea bacteriilor anaerobe maximum 30 minute; este folosita doar în
absența flacoanelor cu atmosferă anaerobă.

Fig. 6 – Transportul probelor de puroi – suspiciune anaerobi

https://www.slideshare.net/Shilpak23/non-sporing-anaerobes-65044854
 Prelevarea cantitativă cu tamponul
- se face toaleta plăgii: se îndepărtează ţesutul necrotic şi se spală cu ser fiziologic pentru îndepărtarea
exsudatului stagnant sau a eventualelor urme de antibiotic;
- învârtim tamponul umezit cu soluţie Ringer pe o arie de 1 cm 2, până la sângerare uşoară (pentru a avea
certitudinea că prelevăm din ţesutul viabil; se poate preleva din mai multe puncte ale leziunii);
- se introduce tamponul într-un mL de bulion tioglicolat şi se transportă imediat la laborator.

Fig. 7 - Recipient transport proba – suspiciune anaerobi

https://www.google.ro/search?q=swab+anaerobic&rlz=1C1AWUA

Prelevări biopsice
- indicate când conduita terapeutică impune cunoaşterea concentraţiei bacteriene în ţesuturile viabile
afectate prin arsuri sau traumatism şi extinderea leziunilor;
- se face toaleta plăgii;
- prelevarea se face cu perforatorul dermic;

Fig.8 – Recoltarea probelor cu perforatorul dermic

https://myhealth.alberta.ca/Health/pages/conditions.aspx?hwid=zm2550

- proba se expediază la laborator într-un tub închis ermetic.

A. Examenul macroscopic (pentru puroiul prelevat în seringă):

- consistenţa: cremos – infecţii stafilococice, lichid – infecţii streptococice;
- culoare: galben, roşu-brun (e.g. Serratia), verzui, albastru-verzui (e.g. Pseudomonas);
- miros: fetid, fecaloid - anaerobi.

B. Examenul microscopic:
În cazul prelevării cu tamponul - efectuarea frotiului se face de către persoana care a recoltat proba: pe o
lamă de microscop se rulează tamponul pentru a obţine un frotiu subţire şi uniform. Frotiurile şi tamponul
introdus în mediul de transport vor fi trimise împreună la laborator.
- coloraţie Gram şi/sau Ziehl Neelsen
Examenul citologic:
- prezenţa şi tipul leucocitelor
Examnul bacterioscopic :
-se apreciază semicantitativ prezenţa bacteriilor
 foarte rare : 1/50-100 câmpuri
 rare 1/10-20 câmpuri
 numeroase 1-10/câmp
- categoria microscopică a bacteriilor observate

C. Cultivarea probelor
Izolarea calitativă din puroi
Medii utilizate:
 geloză-sânge
 mediu cu selectivitate joasă pentru bacili Gram-negativi (MacConkey)
 bulion tioglicolat (în cazul probelor necontaminate)
Incubare:
 temperatură 37 °C,
 atmosferă cu 5-10% CO2,
 timp de 24-48 ore.

Izolarea cantitativă din plăgi şi arsuri

- se obţine suspensia mamă prin rotirea şi stoarcerea insistentă a tamponului în bulion tioglicolat pentru
descărcarea conţinutului, apoi îl stoarcem prin presare insistentă pe peretele tubului;
- se realizează diluţii zecimale în bulion tioglicolat şi etalăm câte 0,1 ml pe câte o placă cu geloză sânge pentru
incubare in aerobioza şi una pentru incubare in anaerobioza (in cazul probelor recoltate din plagi profunde);
- facem citirea la 24-48 de ore pentru placa incubată in aerobioza şi la 48-72 ore, pentru cea incubată in
anaerobioza;
- se calculează concentraţia bacteriilor de pe tampon după formula:
Nr UFC/tampon=NxDx10, unde N= nr coloniilor de pe placă
D = inversul diluţiei
10 - pentru că am însămânţat 0,1 mL

Interpretarea rezultatelor:
a) izolatele în cantitate >106 UFC/tampon au semnificaţie clinică;
b) streptococii beta hemolitici au semnificaţie clinică indiferent de cantitatea în care sunt izolaţi;
c) izolatele în cantităţi de 103-4 UFC/ g ţesut au semnificaţie clinică dacă examenul histopatologic confirmă
prezenţa infiltratului inflamator, a leziunilor de vasculită şi tromboză.

D. Identificarea agentului etiologic pe baza caracterelor: microscopice, de cultură, biochimcie și antigenice.

E. Testarea sensibilitatii la antibiotice, în funcție de categoria microscopică observată, dar și de alte criterii
(lozalizarea supurației, starea fiziologică/patologică a pacientului, etc.)
 II. Identificarea bacililor gram-negativi non-fermentativi

Bacili Gram-negativi

fermentarea glucozei

(-)
BGN non-fermentativi

testul
oxidazei

(+) (-)

mobilitate mobilitate

(-)
(+) (-) (+)
Acinetobacter spp
Pseudomonas spp Burkholderia mallei Stenotrophomonas
Flavobacterium spp maltophilia
Burkholderia cepacia
B. pseudomallei 
Alcaligenes spp

Caractere microscopice:
 bacili Gram negativi
- lungi, fini (Pseudomonas spp)
- scurti, groși până la cocoizi (Acinetobacter spp, Flavobacterium spp)
 unele specii sunt mobile
 pot fi capsulați

Caractere de cultura:
 aerobi,
 nepretențioși nutritiv
 unele specii produc pigment (Pseudomonas aeruginosa, Flavobacterium spp)
Caractere biochimice:
 nu fermentează glucoza
 unele specii sunt oxidazo-pozitive

Testul oxidazei:
- se depun 2 - 3 picături de reactiv pentru oxidază (diclorhidrat de tetrametil-p-fenilendiamina) pe o
banda de hârtie de filtru; cu o ansă de plastic se etalează un fragment din colonia selectată;
- reacţie negativă: absenţa schimbării culorii reactivului după 10 secunde.
- reacţie pozitivă: schimbarea culorii reactivului în violet sau albastru închis.

Fig 1 – Testul oxidazei: negativ (stanga); pozitiv (dreapta)

https://www.slideshare.net/drmalathi13/oxidase-test

1. a. Pseudomonas aeruginosa
Caractere microscopice: bacili gram-negativi, drepţi sau uşor încurbaţi, fini, dispuşi izolat, în perechi sau
scurte lanţuri.

Fig. 2 – Pseudomonas aeruginosa - Frotiu colorat Gram

http://textbookofbacteriology.net/pseudomonas.html

Caractere de cultivare:
 cresc la temperaturi între 5-42ºC,
 colonii cu tendinţă de invadare a mediului, cu miros caracteristic (flori de tei sau iasomie),
 produc pigmenţi fluorescenţi difuzibili în mediu (piocianină, pioverdină, piorubrină, piomelanină),
 tulpini nepigmentate (frecevent mucoide), in cazul celor izolate de la pacienti cu fibroză chistică
(mucoviscidoză).
 Fig. 3 – Pseudomonas aeruginosa cultura – producere de pigment
http://jb.asm.org/content/183/21/6454/F3.expansion.html

 culturile au luciu metalic şi plaje de liză,

 pe geloză-sânge, coloniile sunt hemolitice.

Fig. 4 – Pseudomonas aeruginosa cultura – luciu metalic si hemoliza pe agar sange

https://www.pinterest.com/pin/345580971376128050/

Caractere biochimice
Sensibilitate naturala la antibiotice: piperacilina, ticarcilina, penicilinele cu inhibitori de beta-lactamaza,
cefepim, ceftazidim, imipenem, meropenem, aztreonam, ciprofloxacina, levofloxacina, amikacina,
gentamicina, netilmicina, tobramicina, colistin

1. b. Genul Acinetobacter
Caractere microscopice:
 bacili gram-negativi, scurţi şi groşi, chiar cocoizi, cu dispoziție neregulată sau în diplo.
 Fig 5 – Acinetobacter spp – Frotiu colorat Gram
https://www.gettyimages.ie/detail/news-photo/this-gram-stained-photomicrograph-depicts-numerous-gram-news-
photo/509391900?

 frecvent capsulaţi,
 imobili

Caractere de cultivare:
 nepigmentogeni

Caractere biochimice

Sensibilitate naturală la antibiotice: imipenem, meropenem, aztreonam, ciprofloxacină, levofloxacină,

amikacină, gentamicină, netilmicină, tobramicină, colistin, trimetoprim-sulfametoxazol.

In sala se gasesc:
- frotiuri din cultura (BGN – Pseudomonas)
- frotiuri din cultura Acinetobacter
- frotiuri din puroi (BGN)
- cultura bacil piocianic pe geloza-sange, geloza-simpla
- cultura de Acinetobacter pe geloza-simpla
- insamantare cantitativa puroi pe geloza-sange si MacConkey (bacil piocianic)
- testul oxidazei pentru bacilul piocianic (reactiv/benzi oxidaza, betisoare plastic, lame sticla)
- testul catalazei (H2O2, lame de microscop, beţişoare, pipetă)
- recipient dezinfectant
- antibiograme pentru bacilul piocianic si pentru Acinetobacter, tabele de interpretare, rigle.

Bibliografie:
Buiuc D.: Microbiologie Medicală, ed. a VI-a, Editura “Gr. T. Popa” Iaşi, 2003, cap 13, pag 216-211, cap 42,
pag 383-386