Genul Staphylococcus

Specia tip: S. aureus

Diagnosticul de laborator al infectiilor stafilococice

l. Diagnosticu bacteriologic: consta in izolarea si identificarea germenilor potentiali patogeni din

produsul recoltat de la pacient

-parcurge 7 etape

1. Recoltarea produselor patologice

-se lucreaza cu materiale si instrumente sterile

-se respeca atat normele generale de recoltare, cat si normele specifice fiecarui produs patologic

-produsele patologice care se recolteaza se aleg in functei de localizarea infectiei, sugerata de obicei
de simptomatologia pacientului

2. Transportul probelor la laborator

-trebuie sa fie cat mai rapid, de obicei max. 1-2h

-daca nu este posibil, se pot folosi medii de transport:

 Mediul Stuart

 Mediul Amies

-se respecta normele de securitate microbiologica pe perioada transportului

-se asigura identiatea probei

3. Examenul macroscopic

-consta in examinarea cu ochiul liber a produsului recoltat

-se poate observa in cazul stafilococilor, caracterul purulent al produselor recoltate

-puroiul stafilococic este consistent, galben-auriu

4. Examenul microscopic direct

-consta in efectuarea unui frotiu colorat Gram din pp

-acest examen are un caracter orientativ

-frotiurile se examineaza microscopic si se pot observa urmatoarele caractere morfo-tinctoriale ale

stafilococilor:

˗ dimensiuni: 0,8-1 μm

˗ forma: coci sferici

 ˗ mod de grupare: pot fi izolati sau grupati in diplo , in lanturi scurte de 3-4 coci sau in gramei cu
aspect de ciorchine de strugure (gruparea in gramezi cu aspect de strugure= aranjarea
specifica)

˗ de obicei, nu prezinta capsula; tulpinile virulente pot prezenta uneori capsula, mai ales pe
frotiurile efectuate din pp

˗ nu formeaza spori

˗ localizare: extracelulari

˗ tinctorialitate: Gram + (violet)

5. Cultivarea in vitro

-sunt nepretentiosi nutritiv, crescand cu usurinta chiar si pe medii uzuale

-medii utiizate:

 Geloza-sange: se foloseste pt. ca este un mediu ieftin, cu proprietati nutritive bune si permite
observarea proprietatii de hemoliza, importanta pt. identificarea unor germeni

-specia S. aureus produce β-hemoliza (clara, completa)

-restul speciilor stafilococice de importanta medicala nu produc in general hemoliza

-s-a descris la unele specii de SCN „hemoliza cald-rece”= dupa 24h de incubare la 37 0C, apare in
jurul coloniilor o hemoliza incompleta, care devine completa dupa inca o noapte la frigider la +4 0C

 Mediul hiperclorurat lichid

 Mediul hiperclorurat solid „Chapmann” = mediu selectivo-diferential pt. stafilococi

-agentul selectiv este NaCl 7,5g%, care permite cresterea exclusiva a stafilococilor

-agentul diferential: manita (zahar), care permite diferentierea stafilococilor in 2 categorii

o Stafilococi manito-pozitivi: fermenteaza manita producand schimbarea culorii mediului

prin virajul indicatorului de pH, de la roz la galben (ex. S. aureus)

o Stafilococi manito-negativi: nu fermenteaza manita si formeaza colonii incolore, ce par

roz, deoarece imprumuta culoarea mediului

-mediile hiperclorurate pot fi folosite pt. stafilococie, deoarece acestia sunt halotoleranti
(tolereaza C% crescute de NaCl)

-mediile insamantate se incubeaza in urmatoarele conditii:

˗ Aerobioza (stafilococii cresc si in anaerobioza, deoarece sunt aerobi, facultativ anaerobi)

˗ 370C, 24h

Pe geloza sange:
-tulpinile virulente de stafilococ formeaza colonii de tip „S” (smooth), care sunt: bombate, bine
delimitate, cu suprafata neteda, cremoase, opace/mate, pigmentate in galben-auriu in cazul
speciei S. aureus, sau albe (la celelalte specii care nu produc pigment)

-la 24h dupa incubare de obicei nu e vizibil pigmentul (de obicei este vizibil la 48h)

-pigmentul NU apare in conditii de anaerobioza

-pe acest medu, S. aureus produce colonii β-hemolitice, iar restul speciilor nehemolitice

-raportul intre diametrul coloniei si diametrul zonei de hemoliza din jurul ei este mare in cazul
stafilocoilor, comparativ cu streptococii, ceea ce reprezinta un criteriu de diferentiere intre acestia

In mediul hiperclorurat lichid

-stafilococii cresc in acest mediu, tulburandu-l omogen

Mediul Chapmann -folosit de rutina

-initial are o culoare roz; coloniile de S. aureus sunt manita-pozitive prin urmare sunt galbene si
ingalbenesc mediul din jurul lor

-celelalte specii formeaza de obicei colonii incolore, care par roz pe acest mediu

6. Identificarea

-are drept scop stabilirea genului si a speciei bacteriene (dac este posibil)

-se poate baza pe teste biochimice sau serologice

-la stafilococ principalel teste/criterii de identificare, sunt:

o prezenta/ absenta β-hemolizei

o prezenta/absenta piggmentului galben-auriu

o Reactia catalazei – se foloseste cand trebuie facuta diferentierea intre stafilococi (catalaza +)
si streptococi (catalaza -); catalaza este o enzima stafilococica, care elibereaza oxigenul din
H2O2

Tehnica: pe o lama se pune o picatura de H 2O2 si o mica cantitate din cultura bacteriana
suspectata a fi stafilococ;

-se amesteca pt omogenizare cu o ansa bucla sterila de plastic sau o bagheta de plastic steril

-reactia +  apare efervescenta lichidului

-reactia –  lichid tulbure

-pt. aceasta reactie nu se ia cultura de pe geloza sange, ci de pe alt mediu, deoarece hematiile
au propria catalaza si dau reactii fals +
 o Reactia coagulazei (enzima produsa de specia S. aureus, care permite diferentierea acestuia
de celelalte specii stafilococie, numite generic SCN)

Coagulaza coaguleaza plasma unor specii de animale; tehnica se poate realiza pe lama sau in
tuburi (metoda in tuburi este mai buna, deoarece evidentiaza coagulaza legata, pe care
bacteria o pierde mai greu)

 Metoda pe lama: pe o lama se pune plasma peste care se adauga cultura bacteriana
suspectata de a fi S. aureus

-se amesteca pt. omogenizare

reactia +  coaguli fini, albi, in lichid limpede

reactia -  lichid tulbure

 Metoda in tuburi: intr-o eprubeta se pun 5 ml de plasma, diluata 1/10 cu apa distilata
sterila; se adauga cateva colonii suspecte identice

-se acopera eprubeta cu dop de vata steril si se incubeaza la 37 0C, min. 8h

-reactia + are 3 variante:

a.) coaguli mici in lichid limpede

b.) coagulare „in meduza” – cheag mare care pluteste in lichidul limpede

c.) coagulare „in masa” – tot lichidul se incheaga

Obs. pt. aceasta reactie, plasma trebuie recoltata pe un alt anticoagulant decat citratul de sodiu,
deoarece bacteriile consuma citratul ca sursa de C si pot aparea reactii fals +

 Evidentierea proteinei A sau a polizaharidului A din peretele celular al speciei S. aureus,

prin reactii de aglutinare cu truse comerciale

Metode moderne: permit stabilirea specilor de stafiococi

o Galerii API STAPH

o Aparate automate de bacteriologie: Sistemele Vitek sau Microscan

7. Antibiograma

-este obligatorie in cazul tulpinilor stafilococice, cu precadere in cazul celor de spital, care pot
dobandi rezistenta inalta la multe clase de antibiotice (!MRSA; tulpinile de S. aureus cu rezistenta de
clindamicina, indusa de eritromicina –amandoua sunt macrolide
ll. Diagnosticul serologic

-consta in evidentierea Ac specifici in serul pacientului

-in cazul stafilococilor, nu se poate utiliza, deoarece contin in peretele celular un mozaic de Ag care
determina reactii incrucisate