Disciplina de Microbiologie UMF Tg.

Mureş
LP4

Diagnosticul hepatitelor virale

- Hepatita virală A -

Produs patologic
• sânge, salivă - pentru evidenţierea anticorpilor
• materiile fecale, biopsie din ficat – pentru evidenţierea virusului

Examen direct – nu se practică de rutină

• evidenţierea virusului din materii fecale prin ME
• evidenţierea antigenelor virale
• din biopsie hepatică prin reacţii imunohistochimice
• din materii fecale prin reacţii antigen-anticorp - greu evidenţiabile la începutul
bolii

Izolare
• nu se practică de rutină
• deşi virusul poate creşte pe linii celulare, nu produce efect citopatic

Diagnostic serologic
• Dinamica apariţiei anticorpilor:
o IgM: apar odată cu primele simptome de boală – ajung la titru maxim în 1-3
săptămâni, dispar în 3-6 luni
o IgG: apar după aproximativ o lună de la infecţie, ajung la titru maxim în 3-6
luni, apoi persistă la un nivel detectabil toată viaţa
o anticorpii se detectează prin ELISA

-1-
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP4

- Hepatita virală B -

Produs patologic
• sânge pentru detectarea markerilor virali (antigene şi anticorpi)
• ţesut hepatic – detectarea antigenelor virale
• virusul se mai elimină prin secreţii genitale, salivă.

Izolare
• virusul nu este cultivabil

Diagnostic
• Markeri virali detectabili din sânge prin ELISA:
o Ag HBs, Ac anti HBs
o Ag HBe, Ac anti HBe
o Ag HBx, Ac anti HBx (cercetare)
o Ac anti HBc
o din sânge se mai poate evidenţia ADN-ul viral prin PCR, polimeraza (cercetare).

• Markeri virali detectabili din biopsie hepatică prin imunohistochimie

o Ag HBs
o Ag HBc
o AgHBx (markerul cronicizării şi al malignizării - cercetare)
o ADN viral

Dinamica apariţiei markerilor virali în sânge:

1. AgHBs:
• se evidenţiază primul, apare în perioada de incubaţie (la 1-2 săptămâni de la
infecţie), scade în convalescenţă;
• dispare odată cu apariţia anticorpilor antiHBs;
• detectarea lui după 6 luni de la infecţie semnifică cronicizare.

2. AgHBe:
• se evidenţiază încă din perioada de incubaţie, imediat după apariţia AgHBs;
• dispare în convalescenţă odată cu apariţia anticorpilor antiHBe;
• detectarea lui indică infectivitatea persoanei.

-2-
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP4

3. Anticorpi antiHBc
• primii anticorpi produşi, apar odată cu simptomele bolii şi persistă mai mulţi ani;
• se determină IgM sau Ig totale (IgG+IgM);
• detectarea IgM indică replicare virală.

4. Anticorpi antiHBe
• apar după anticorpii antiHBc

5. Anticorpi antiHBs
• apar la câteva luni sau ani de la infecţie, după anticorpi antiHBe;
• detectarea lor indică instalarea imunităţii.

Ac anti HBc (IgG)

AgHBs Ac anti HBs

AgHBe Ac anti HBe

Ac anti HBc
(IgM)

2-3 săpt 3-6 luni > 20 ani

Profiluri serologice posibile în hepatita virală B

• Prezenţa AgHBs = infectivitate
o AgHBs + IgM antiHBc = hepatită acută
o AgHBs + Ig totale antiHBc (> 6 luni) = infecţie persistentă
o AgHBs + Ig totale antiHBc + AgHBe (> 6 luni) = hepatită cronică

• Prezenţa Ac anti HBs = vindecare

o Ac anti HBs + IgM anti HBc (titru crescut) = infecţie recentă, vindecată
o Ac anti HBs + Ig totale antiHBc (titru scăzut) = infecţie în antecedente,
vindecată
o Ac anti HBs (fără alţi markeri) = imunitate postvaccinală

• Persistenţa AgHBs după 6 luni = infecţie persistentă

-3-
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP4

- Hepatita virală C -

Produs patologic
• sânge
• ţesut hepatic

Examen direct
• evidenţierea acidului nucleic din sânge (viremie) sau din ficat prin PCR.

Izolarea nu se practică

Diagnostic serologic
• detectarea anticorpilor anti VHC prin ELISA, metode radioimune, folosind antigene
recombinate
• detectarea imunoglobulinelor prin metode Western-blot

- Hepatita virală D -
Produs patologic
• sânge
• ţesut hepatic
Virusul hepatitei D este un virus defectiv, infecţia apare doar în prezenţa virusului hepatitei B.

Examen direct
• evidenţierea virusului în nucleul hepatocitelor prin ME, metode imunohistochimice;
• evidenţierea ARN-ului viral din sânge, după tratarea serului cu detergenţi pentru a
îndepărta AgHBs care înveleşte virusul.

Diagnostic serologic
• evidenţierea anticorpilor anti VHD prin ELISA.

-4-
Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP4

- Hepatita virală E -
• Virusul hepatitei E se transmite enteral, determinând forme uşoare de boală, cu
excepţia femeilor gravide la care boala poate avea o evoluţie letală.
• Boala evoluează epidemic în Asia, în nord-vestul Africii şi în Mexic. Foarte rar apare
în SUA. Nu s-au descris cazuri la noi în ţară.
• Nu se fabrică reactivi comerciali pentru diagnosticul de laborator de rutină.
• În scop ştiinţific:
o se evidenţiază antigenele virale din celula hepatică prin IME;
o se evidenţiază ARN-ul viral prin PCR;
o se evidenţiază anticorpii anti VHE.

-5-
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP4

Diagnosticul de laborator în infecţia HIV

Produs patologic

• Sânge (pentru examen direct şi serologie)

o ser
o plasmă pe EDTA
o sânge integral
• Virusul se poate identifica în secreţii genitale, salivă, urină, LCR, lapte de mamă.
• Anticorpii se mai găsesc în laptele de mamă şi în salivă.

În cursul diagnosticului infecţiei cu HIV se evidenţiază:

• Antigene virale
• ARN viral, ADN proviral
• Anticorpi: Ac. anti core, Ac. antienvelope

Dinamica producerii markerilor virali

Antigenul p24
• se găseşte în serul persoanei infectate
• detectabil în infecţiile recente, înainte de apariţia anticorpilor
• dispar după apariţia anticorpilor anti p24
• reapar în stadiile tardive de boală (SIDA), semnificând replicare virală intensă şi un
prognostic grav

Anticorpii anti p24

• apar la 3-12 săptămâni de la infecţie. Perioada de la infecţie până la apariţia lor se
numeşte “fereastră imunologică”.

Anticorpii anti gp120

• nu au rol protector
• sunt folosiţi ca marker de diagnostic

-6-
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP4

Infecţie HIV
SIDA
Fereastră imunologică

ARN-HIV
Ac anti GP120

Ac anti P24
P24
P24

Luni Ani
Dinamica producerii markerilor virali

Diagnostic
Protocolul standard de diagnostic:

• se evidenţiază anticorpii prin metoda ELISA

• ELISA reprezintă prima etapă de diagnostic a infecţiei HIV (screening), având
sensibilitate de aproape 100%
o generaţia I: se foloseşte lizatul total viral de pe culturi de limfocite („whole
virus”)
o generaţia II: se folosesc antigene clonale
o generaţia III: se folosesc antigene recombinate
o generaţia IV: metode combinate care testează simultan prezenţa anticorpilor
anti HIV şi a antigenului P24
• metodele de generaţie III şi IV au sensibilitate şi specificitate ridicată
• este posibilă apariţia rezultatelor false:
o fals negative („fereastra imunologică”, diferite tipuri virale (HIV-1, HIV-2) şi
subtipuri (HIV-1-N, HIV-1-O, HIV-1-M))
o fals pozitive (probe de sânge alterate, incorect etichetate sau schimbate, greşeli
de laborator, contaminarea probelor)
• rezultatul pozitiv al testării ELISA se raportează ca „ser reactiv”, şi NU confirmă
diagnosticul pozitiv de infecţie HIV

-7-
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP4

• în cazul pozitivării se face o retestare prin printr-o metodă cel puţin la fel de sensibilă
din aceeaşi probă de sânge (determinare ELISA la centre de referinţă)

• după retestare, probele reactive trebuie confirmate prin metoda Western-blot

o se detectează proteine specifice virale:
- glicoproteine de înveliş („env”): gp41, gp120, gp160
- proteine nucleare („gag”): p18, p24/25, p55
- endonucleaze-polimeraze( „pol”): p34, p40, p52, p68
o se consideră pozitive probele care prezintă:
- 2 benzi pentru antigene din grupul „env” (după World Health Organization
WHO)
- 1 bandă (glicoproteină) + 1 bandă (altă proteină specifică HIV) (după
Deutsches Institut für Normung - DIN)
- benzi pentru P24, p34, gp41, gp120/160 (după Food and Drug Administration)
Interpretarea Western-blot

Proba 1: HIV+ (control pozitiv)

Proba 2: HIV- (control negativ)

Proba A: Pacient A

Proba B: Pacient B

Proba C: Pacient C

* pacientul C prezintă un pattern sugestiv

pentru infecţie HIV

* pacientul B – rezultat intermediar după

WHO, dar pozitiv după DIN

Teste rapide de diagnostic („point-of-care”, „bedside” tests)

• Se bazează pe 4 principii: aglutinare, immunodot, immunofiltration sau immune
chromatography
• Se poate efectua din sânge capilar/venos
• Rezultatele se obţin în 15-30 min.
• Ex: OraQuick™, Reveal™, Uni-Gold Recombigen™
• au specificitate şi sensibilitate înaltă

-8-
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP4

Diagnostic direct
• nu se face de rutină
• detectarea AN virali:
• ADN proviral din limfocite sau ARN viral
• Reprezintă marker de infecţie
• Se foloseşte în situaţii speciale:
o Calitativ: suspiciune de infecţie primară, când Ac lipsesc (fereastra
imunologică); nou născut din mamă infectată cu serologie pozitivă (Ac
materni)
o Cantitativ (încărcătura virală): marker de prognostic; monitorizarea
tratamentului. NU se foloseşte ca metodă de diagnostic
• PCR (polymerase chain reaction), b-DNA (branched DNA), NASBA (nucleic acid
sequence-based amplification), LCR (ligase chain reaction)

Izolarea virusului
• rezervată pentru cazuri speciale, se face în laboratoare specializate
• pe culturi de limfocite umane stimulate cu fitohemaglutinină, în prezenţa
interleukinelor
• efect citopatogen în 2-3 săptămâni

-9-
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP4

Protocol de diagnostic şi management al infecţiei HIV

Screening
(ELISA generaţia 3 sau 4)

Ser nereactiv Ser reactiv

Retestare prin metode de screening sau

Expunere recentă printr-o metodă cel puţin la fel de sensibilă
Semne şi simptome din aceeaşi probă de sânge
sugestive pentru HIV

Repetarea probei peste

7-10 zile (Ag, Ac din ser Reactiv Nereactiv
şi PCR din sânge pe
EDTA)

Trimiterea probei Eroare de

Fără expunere recentă pentru confirmare lucru
Fără semne şi simptome
sugestive pentru HIV

Urmărire prin Calibrarea aparatelor

recoltare de noi şi reevaluarea
probe cât mai rapid modalităţilor de lucru
Infecţie absentă

Urmărire periodică la
persoanele cu risc

-10-