UNIVERSITATEA PETROL-GAZE PLOIETI FACULTATEA: TEHNOLOGIA PETROLULUI I PETROCHIMIEI SPECIALIZAREA: MANAGEMENTUL I CONTROLUL CALITII PRODUSELOR I A FACTORILOR DE MEDIU GRUPA: B

ANTOCIANI

MASTERAND: GRIGORE CTLINA-ANDREEA PROFESOR: CONF. DR. ING. BOMBOS DORIN

2010 Capitolul I Antocianii din fructe i legume

I.1. Introducere Consumul de fructe a fost asociat cu un risc sczut de a dezvolta cancer. Cei mai abundeni constituieni flavonoizi ai fructelor sunt antocianii (antocianine, glicozide, antocianidine), care cauzeaz coloraii intense. n aceast lucrare, vor fi descrise dovezile epidemiologice fr s se fac aluzie la activitatea de prevenire a cancerului provocat de coninutul de antociani prezeni n alimente i rezultatele studiilor chemiopreventive fcute pe roztoare cu antociani sau cu antociani coninui n fructe/extracte vegetale, precum i proprietile farmacologice ale antocianilor. Antocianidinele s-au dovedit a inhiba supravieuirea celulei maligne i a confunda multe evenimente oncogene de semnalizare, n intervalul concentraiei de 10-6 - 10-4 M. Studiile farmacocinetice ale antocianilor, dup consumul lor ca unic agent, sugereaz c antocianii ating nivelul de 10-8 -10-7 n sngele uman. Literatura de specialitate disponibil n prezent ofer indicii despre posibila utilitate a antocianilor sau a amestecurilor de antociani la interveniile chemiopreventive ale cancerului. Cu toate acestea, sunt necesare studii suplimentare pentru a favoriza dezvoltarea lor clinic. Unele rapoarte media pe teme de sntate implic faptul c o diet bogat n fructe i legume colorate este panaceul nutriional ntr-o societate marcat de probleme, cum ar fi obezitatea, ateroscreloza i cancerul. Nu exist un interes n creterea rolului de nutriie i constituienilor dietetici specifici n cauzarea i prevenirea cancerului. Proeminent n constituienii dietetici alimentari sunt flavonoidele. Exemplele includ izoflavonii care apar n soia, ceap i legumele cu frunze. Antocianii apar n regnul vegetal i confer coloraie luminoas roie sau albastr fructelor de pdure sau altor fructe i legume. Ce face antocianii deosebit de interesani fa de alte flavonoide este faptul c acetia apar n diet la concentraii relativ ridicate. Aportul zilnic de antociani n dieta din SUA a fosr sugerat a fi 180-215 mg/zi, n timp ce aportul zilnic de flavonoide dietetice (genisteina, quercetin i apigenina) este estimat la doar 20-25 mg/zi. Antocianidinele gsite n plantele superioare sunt cianidin, delfinidin, malvidin, pelargonidin, peonidin i petunidin (figura 1), cu o distribuie n natur de 50%, 12%,12%, 12%, 7% i 7%. Figura 1 Structura antocianidinelor

I.2. Dovezi epidemiologice Care este dovada care s susin ideea c fructele i legumele colorate, adic alimentele care conin niveluri ridicate de antociani, posed proprieti de ntrziere sau de prevenire a cancerului? Dei datele epidemiologice nu sunt abundente, exist rapoarte care fac aluzie la potenialul lor de anti-carcinogenitate. ntr-un grup de persoane vrstnice, care au consumat cantiti mari de cpuni, aportul adugat de a dezvolta cancer a fost de 0,3 comparativ cu subiecii care s-au abinut de la consumul mare fructe. Consumul de fructe i legume colorate a fost, de asemenea, asociat unui risc redus de cancer mamar uman i reapariia polipului colorectal. Antocianii coninui de produsele alimentare au fost asociai cu un risc sczut de boli cardiace coronariene. S-au dovedit a avea efecte benefice n mai multe pri ale organismului, inclusiv sistemului nervos central i ochi, i au fost suspectate de a semna cu paradoxul francez, adic scderea riscului de boli cardiovasculare n ciuda unei diete bogate n grsimi la persoanele care triesc n Frana. I.3. Proprietile chimice Componentele antocianilor sunt glucoza, galactoza i arabinoza care, de obicei, sunt conjugate cu molecula antocianidinei prin intermediul gruprii hidroxil. Unele antocianine cuprind mai multe pri de zahr care implic funciunile hidroxil din molecula de aglicon. Antocianii sunt extrem de solubili n ap i apar n conformaii diferite dependente de pH , cu variaii de culori sau intensiti de culoare (figura 2). La pH<3, inelul din mijloc confer culoarea intens a moleculei. Dei stabilitatea cationului flavilium, aa cum a fost judecat prin spectrofotometrie UV-VIS, este compromis de creterea pH-ului, manifestrile conformaiilor ale antocianilor pentru aciunea farmaceutic sunt neclare. Figura 2 Dependena pH-ului

I.4. Proprietile chemopreventive ale cancerului la animale Exist opt rapoarte n care abilitatea/capacitatea antocianilor sau amestecurilor care conin antociani interfer cu carcinogeneza la animale.. n cadrul unei anchete comparative pe oareci, animalele au primit fiecare un amestec de antocianine la 800 mg/l, sau cianidin pur la 200 mg/l cu ap potabil, tart de ciree sau viine adugat la diet (200g/kg diet). Aceste sume corespund la doze de aproximativ 2,4 i 0,6 mg antociani/animal/zi sau 600 mg de tart de ciree/animal/zi, bazndu-se pe aportul mediu zilnic de alimentaie i ap. oarecii care au primit aceste intervenii, numrul adenomului cecal a fost redus comparativ cu animalele care au avut o diet controlat sau cele care au primit droguri antiinflamatorii. Numrul de adenoame intestinale nu a fost influenat semnificativ de antociani. Un studiu recent efectuat n laborator sugereaz o moderare, dar o reducere semnificativ n numrul mic de adenom intestinal ApcMin la oarecii care au primit antocianin coninut n extractul din afine sau cianidin-3glucozid pur la 0,1% n dieta lor. Aceast concentraie se traduce ntr-o doz de aproximativ 3 mg antocianin/oarece/zi. Animalele care au primit o diet de antocianin coninut n orezul rou cleios au prezentat eficiene anti-tumorale, n ceea ce privete timpul de supravieuire a crescut n comparaie cu animalele cu o diet controlat sau cu o diet normal de orez. La obolanii femel, tumorile mamare au fost induse de expunerea la 7,12-dimetil benzen antracen, prin consumarea de suc de struguri. Animalele care au consumat suc, incidena, multiplicitatea i greutatea final a tumorilor mamare au fost reduse. Coloranii derivai din cartofii dulci, varz roie i porumb, care sunt bogate n antociani, inhib carcinogeneza indus chimic la obolani. Adenoamele de colon i adenocarcinoamele au fost induse de tratamentul cu 1,2 dimetil hidrazin (DMH) i incidena tumorii a fost majorat prin complexarea dietei cu cancerigen amine heterociclice 2-amino-1-metil-6-fenilimidazo piridina (PhIP). S-a dovedit, de asemenea, c antocianii previn cancerul de piele la roztoare. Aplicarea antocianinei coninut n extractul de rodie determin o ntrziere a debutului i scderea incidenei i a sarcinii de tumori cutanate. I.5. Efecte farmacologice n vitro 4

Studiile n care efectele antocianilor asupra creterii celulare sau pe evenimentele celulare care au legtur cu promovarea sau progresia tumorii au fost investigate i sumarizate n tabelul 1 i 2. n ceea ce privete inhibarea de supravieuire a celulelor neoplazice, antocianidinele au demonstrat poten mai mare dect omologii lor glicozilici. Antocianidinele compromit durata de supravieuire a celulelor atunci cnd se gsesc n concentraii de 10-5 - 10-4 M. Antocianidinele s-au dovedit a inhiba creterea fibroplastelor embrionare i a celulelor canceroase maligne derivate din esuturile umane. Dintre antocianidine, delfinidina posed cea mai mare cretere a activitii inhibitoare. Antocianina coninut n extractele din struguri, afine sau fructe de pdure, la 25-75 lg/ml inhib dezvoltarea celulelor maligne de cancer la colon. Delfinidina, cianidina i malvidina inhib activitatea receptorilor factorului de cretere epidermic (EGFR) tirozin kinazeic obinut din celulele A431 cu IC5. Antocianinele s-au dovedit a fi antioxidani puternici i pot interfera cu carcinogenitatea prin angajarea acestei proprieti. Utilizarea metodei feerice de reducere a capacitii plasmei pentru a reflecta activitatea antioxidant, 3-glucozidele de delfinidin, petunidin i malvidin s-au dovedit a fi antioxidani de 2-2,5 ori mai puternici dect acidul ascorbic. Structura activitii antioxidant emergent din aceasta i din alte studii, sugereaz c activitatea antioxidant puternic este asociat cu prezena grupelor hidroxil n inelul antocianinelor. Capacitile antioxidante a cianidinei au fost similare cu cele ale tocoferolului n sistemele de testare care utilizeaz acid linoleic, lipozomi, membrane eritrocitare. Capacitatea antioxidant a fost de asemenea demonstrat n vitamina E deficitar la obolani. obolanii care au avut o diet suplimentar bogat n extracte cu coninut mare de antocianin, capacitatea antioxidant a plasmei a fost superioar i nivelele hepatice ale 8-hidroxi-20oxiguanosin au fost inferioare comparativ cu dieta obolanilor care nu au primit extracte cu coninut de antocianin. I.6. Farmacologia clinic i pre-clinic O ntrebare crucial n ceea ce privete proprietile farmacocinetice ale antocianinelor este dac acestea sunt supuse metabolic de glucozilare n organismul mamiferelor. S-a sugerat c vilozitile intestinale pot cataliza antocianinele hidrolizate pentru a genera agliconul, dar pn la dovezi concludente pentru acest ipotez, rmne incert. Dou studii recente efectuate pe obolani sprijin ideea c hidroliza s-ar putea produce i n vivo. ntr-un studiu, animalele au primit fiecare cianidin-3-glucozid fie pe cale oral, fie intravenos. Doar obolanii care au primit doza pa cale oral au artat prezena cianidin-3-glucoronidei n plasm. Prezena glucoronidei implic formarea intermediar a agliconului. Absena cianidin-3-glucoronidei din plasm, dup administrarea intravenoas, sugereaz c formarea agliconului este o consecin a metabolismului lor, fie de ctre microflora intestinal, fie a mucoasei intestinale. ntr-un alt raport recent, cianidina a fost identificat n plasm prin spectrometria de mas. Metabolic, conjugatele antocianinelor, altele dect 3-glucoronidele, au fost de asemenea raportate, inclusiv speciile o-metilate. Glocoronidele au fost de asemenea gsite la obolanii care au primit delfinidin-3-glucozid i la porcii cu o diet pe baz de boabe. Metabolismul antocianinelor, cnd se administreaz sub form de extracte de boabe, la om a primit o atenie deosebit. Serul i urina voluntarilor sntoi, care au ingerat extract de boabe neccioase coninnd 4-cianidin-3-glicozide, au fost analizate pentru sursele de fitochimicale i conjugai metabolici. Concentraia maxim total de antocianine n ser a ajuns la 0,59 IM n termen de 2 ore de la consum. n urin, concentraia de antocianine totale a atins pragul de 18 IM n termen de 5 ore i un nivel persistent dup 24 ore. Metaboliii au fost identificai ca glucoronide conjugate, precum i ca derivai metilai i oxidai din cianidin-3-glucozid. ntr-un studiu efectuat pe adulii care au primit un amestec de 4-cianidin-3-glucozid n suc concentrat de soc, majoritatea speciilor de antocianine au fost constatate din compuii originali. Excreia maxim de urin a fost observat dup o or. Dup 5 ore, 0,053% din doza administrat a fost eliminat, din care 6,2% au fost metaboliii glucoronidelor. Rezultatele duc la concluzia c dozele mici de antocianine urmeaz metabolismul n mucoasa intestinal, n timp ce la doze mari metabolismul hepatic prezint importan, o diferen care ar putea afecta profilul de eliminare a antocianinelor. Alte studii umane ale biodisponibilitii i ale farmacocineticii antocianinelor au fost efectuate la femeile vrstnice. ntr-un studiu, extractele de afine i soc au fost comparate. Concentraia antocianinelor n urin, dup 5

consumul de afine, a fost mult mai mic dect cea dup consumul de extract de soc, iar antocianinele nu au fost detectate n plasm. La voluntarii de sex masculin, care au ingerat praf de afine slbatice uscate, farmacocinetica antocianinei a fost corelat cu capacitatea serului antioxidant. 13 ng/ml de antocianine au fost detectate n ser dup 4 ore. Rezultatele obinute cu ajutorul testului ORAC, care reflect proprietile antioxidante, sugereaz o corelaie pozitiv ntre coninutul de antocianine serice de dup prnz i statutul antioxidant. ntr-un alt studiu, voluntarii au primit diferite buturi bogate n mavidin-3-glucozid. Nivelele nalte ale plasmei de malvidin-3-glucozid au fost atinse dup 50 minute, 90 minute sau 120 minute de la consumarea de vin rou, vin rou dezalcolizat sau suc de struguri roii. La femeile care au primit extract de soc, concentraiile nivelului plasmei de cianidin-3-sanbubiozid i cianidin-3-glucozid au fost 39nM, respectiv 43 nM.

Capitolul II Determinarea pigmenilor n legume

II.1. Introducere Pigmenii din plante sunt responsabili pentru culoarea strlucitoare din esuturile plantelor. Acetia sunt, de asemenea, gsii n esuturile animalelor i, eventual, n produsele alimentare transformate ca aditivi. Aceti pigmeni au un impact important asupra valorii comerciale a produselor, deoarece culorile stabilesc primul contact cu consumatorii. n plus, pigmenii din plante pot avea o influen asupra sntii consumatorilor. Pigmenii pot fi uor modificai i chiar distrui. Procesele analitice au fost dezvoltate pentru a determina compoziia pigmentului. Scopul acestei lucrri este de a oferi o scurt prezentare a acestor metode. Un numr mare de legume poart culori strlucitoare. Aceste culori sunt conferite de pigmenii coninui n celule. Pe baza structurilor lor chimice, pigmenii pot fi clasificai n patru clase: tetrapiroli (clorofila), carotenoide (carotena), compui polifenolici (antocianina) i alcaloizi (betalanii). Un exemplu de structur chimic a unui membru din fiecare clas este prezentat n figura 3. Numrul de molecule care aparin fiecrei clase este destul de mare i, n consecin, ar fi necesare cteva volume pentru a descrie proprietile lor particulare. Figura 3 Structura chimic a unui membru din fiecare clas

Dei esuturile animale conin pigmeni din plante, cum ar fi carotenoidele, aceste esuturi, de obisei, nu pot fi sintetizate. Prin urmare, pigmenii trebuie s fie obinui din alimente. Odat asimilai, pigmenii intr pe cile biochimice, de-a lungul crora pot fi modificai n cele din urm. De exemplu, -carotena este mprit n dou, una din acestea servind ca un precursor al vitaminei A (o molecul important). O cretere a numrului de studii indic faptul c pigmenii plantelor au roluri positive asupra sntii umane. Deoarece consumul de alimente proaspete a sczut, n timp ce alimentele procesate au crescut, culorile alimentelor au devenit aspecte importante n procesul de formare al alimentelor. n scopul de a restabili nivelul natural al pigmenilor n produsele proceste, pigmenii extrai sunt ncorporai n produsele alimentare finale. n mod similar, prepararea produselor fortificate necesit adugarea de pigmeni n produse. Indiferent de tipul de produse finale, pigmenii sunt ncorporai n conformitate cu apariia lor natural sau n cadrul unui produs modificat chimic. Ca o consecin a acestor nevoie de adugare de pigmeni, cererea n coloranii naturali izolai a crescut n comparaie cu coloranii sintetici. Cu toate acestea, aceast necessitate nu poate fi ntotdeauna ndeplinit datorit limitrii n furnizarea de materii prime, deoarece producia de pigmeni utilizeaz metodele convenionale de cultivare a plantelor, care sunt influenate de condiiile climatice, de cultivatorii de plante i de soiuri. n consecin, o parte a cercetrii pigmenilor din plante este orientat n gsirea unor noi surse de pigmeni. Aceast cutare nu este orientat doar n gsirea de alternative naturale pentru coloranii sintetici, ci i cu scopul de a descoperi noi specii i noi proceduri pentru producerea de pigmeni, de exemplu din celule i/sau culturile esutului, sau ingineriei genetice. 7

Din toate aceste motive menionate mai sus, analiza pigmentului constituie o adevrat provocare analitic, deoarece pigmenii sunt adesea parte din structura complecilor lor i/sau amestecuri. Prin urmare, abordarea acestor probleme nu este niciodat simpl. Pentru a prelua aceast provocare, este necesar s se aib la dispoziie un numr diversificat de proceduri analitice, capabile s cuantifice rapid i precis diferiii pigmeni i, eventual, degradarea lor n produsele prezente n prob. Dezvoltarea puterii metodelor analitice este, de asemenea, o prim importan n controlul calitii. Metodele de extracie a pigmenilor i de separare sunt revizuite pe scurt, apoi sunt descrise modalitile de identificare i de cuantificare a pigmenilor. II.2. Extracia pigmentului Pregtirea probelor din esuturile biologice este deseori plictisitoare i consumatoare de timp, deoarece exactitatea analizelor depinde de mai muli parametrii legai de pregtirea probei. n plus, extracia complet a pigmenilor necesit adesea mai multe etape i poate utiliza un amestec de mai muli solveni. Acest lucru este valabil n cazul n care proba conine pigmeni de diferite polariti i/sau sunt prezeni ntr-o matrice complex. n cazurile rare, pigmenii pot fi extrai ntr-o singur treapt. Scopul urmtoarei discuii nu este de a face o list complet a extraciei i a metodelor analitice descrise n literatura de specialitate, ci de a oferi exemple reprezentative selectate, care pot fi apoi utilizate ca referin. II.2.1. Moleculele de clorofil i de carotenoide Moleculele de clorofil i de carotenoide sunt mai degrab compui hidrofobi i, prin urmare, acestea pot fi extrase cu un singur solvent organic sau cu un amestec de solveni organici folosii ca omogenizator. De exemplu, Thompson a extras licopenul din roii folosind un amestec de hexan, aceton i etanol (50:25:25). Extracia a fost repetat pn cnd nu a mai fost observat nici o culoare n esuturi. Toate fraciile au fost colectate ntr-o plnie de separare i tratate cu dietil eter. O soluie de NaCl 10% poate fi adugat pentru a asista transferul pigmenilor n faza nepolar. Faza apoas este aruncat i stratul pigmentat este uscat cu Na2SO4 anhidru. Atunci cnd este necesar, pigmenii pot fi splai cu KOH i agitai periodic. Pigmenii sunt apoi transferai n dietil eter prin adugare de ap distilat i faza organic este splat cu ap pn cnd se ajunge la un mediu neutru. n final, faza apoas este eliminat. Faza organic este filtrat pe Na2SO4 anhidru pentru a usca pigmenii. Cteva carotenoide, cum ar fi cele coninute n ofran, sunt solubile n ap. Pentru a extrage carotenoidele din ofran, esuturile plantelor se agit timp de 30 minute n ap rece. Soluia este nclzit la 60 oC timp de 30 minute i apoi lsat la ntuneric timp de 24 de ore. Stratul limpede de la suprafa conine pigmenii. Metodele cele mai uzuale de extracie a carotenoidelor i a clorofilelor utilizeaz solveni organici. Cei mai muli dintre aceti solveni sunt toxici i costisitori. Cteva metode, cum ar fi extracia de lichid supercritic, au fost sugerate ca metode alternative pentru extracia carotenoidelor, deoarece acestea sunt netoxice i necostisitoare. II.2.2. Antocianinele Antocianinele sunt pigmeni solubili n ap, deoarece scheletul de baz este adesea acilat cu una sau mai multe lanuri laterale polare, cum ar fi glucozidele. n funcie de pH, atomul de oxigen din heterociclu poate fi ncrcat pozitiv (figura 1). Este recomandat extracia cu ap, aceton sau cloroform. Adugarea unei mici cantiti de acid clorhidric sau de acid formic este recomandat pentru a prevenii degradarea compuilor neacilai. O comparaie a eficacitii extraciei cu diferii solveni indic faptul c cel mai bun solvent este HCl 1% n metanol. Cu toate acestea, atenia ar trebui orientat spre scderea valorii pH-ului atunci cnd extractele sunt concentrate prin evaporare. Raportul lui Revilla compar diferitele protocoale pentru extracia antocianinei din strugurii roii. Autorii au concluzionat c aceti solveni care conin pn la 0,12 molL HCl poate provoca hidroliza parial a antocianinelor acilate. Dup extracie este recomandat s se prepurifice extractul prin extracia n faz solid pe Sephadex sau Amberlite XAD-7 sau metanol activat. Antocianinele sunt absorbite pe faz, n timp ce zaharurile, acizii sau alte molecule solubile n ap sunt splai cu soluie apoas de HCl 0,01%. 8

Adaosul de acetat de etil elueaz compuii fenolici, alii dect antocianinele, care sunt eluate utiliznd metanol acidifiat (HCl 0,01%). II.2.3. Betalainele Aceti pigmeni sunt, de asemenea, solubili n ap i de obicei localizai ntr-un singur loc n celula plantei: vacuol. Pn acum, sinteza betalainei a fost observat doar n plantele care aparin grupului taxonomic centrospermeae (sfecla roie). Deoarece betalainele i antocianinele sunt relatate chimic (nu biochimic), metodele de extracie i de prepurificare utilizate pentru antocianine, pot fi de asemenea aplicate i la prepararea betalainelor. II.3. Separarea cromatografic a pigmenilor din legume Pigmenii sunt capabili s absoarb lumina vizibil, deoarece cromoforul (parte din molecule, care este implicat n absorbia de lumin) este compus din mai multe legturi duble conjugate. Aceast proprietate unic, cu toate acestea, are o latur negativ: pigmenii sunt foarte sensibili la acid, baz, oxigen, cldur i lumin. Prin urmare, o atenie deosebit ar trebui s fie acordat n timpul i dup extracia pigmentului. II.3.1. Coloana deschis Diferite faze precum pudra de zaharoz, DEAE-Sepharose, celuloz sau MgO/Hyflosupercel au fost utilizate pentru a realiza separarea clorofilei i a carotenoidei. Toate trans--carotenele pot fi separate din izomerii cis-9 i cis-13-carotenele folosind o coloan deschis umplut cu NaOH. Pentru ficobiline, o coloan hidroximineral poate fi utilizat. Antocianinele sunt capabile s se auto-agregheze. Sub aceast form, ele sunt mult mai stabile, fiind mpiedicat izomerizarea luminii lor. Pentru a separa aceste agregate s-a folosit filtrarea pe gel. n zilele noastre, dei cromatografia pe coloan deschis este cea mai folosit pentru a cura extractele sau n scopuri de preparare, aceasta mai poate fi nc folosit pentru metodele analitice. De exemplu, Somers i Evans au raportat c formarea agregatelor de antocianine glucizidice este tipic pentru nvechirea vinului i se refer la stabilitatea culorii. Acest proces natural poate fi puternic accelerat prin adugarea de acetaldehide. Prin urmare, la adugarea acestui compus la un vin tnr, l face s par vechi. ntr-o ncercare de a gsi o metod analitic, capabil s stabileasc vrsta real a vinului, Jhonson i Morris au folosit o coloan cu silicagel, mpreun cu un gradient de acid formic, pentru a separa diferitele agregate ale antocianinelor glucozidice din vinurile roii. Folosind aceast tehnic, antocianinele au fost eluate n patru fracii. Primele dou fracii conin antocianine libere, iar celelalte dou conin antocianine polimerizate i condensate. Comparnd valorile antocianinelor n fiecare fracie din vinul tratat i cel netratat apare o diferen clar, deoarece vinul tratat conine mai multe agregate de antocianine monoglucozidice dect n cel netratat. Acest lucru poate fi explicat prin faptul c acetaldehidele accelereaz preferenial condensarea pigmenilor monoglucozidici , pigmenii diglicozidici fiind accelerai mai uor. II.3.2. Cromatografia n strat subire Cromatografia n strat subire este adesea utilizat ca o metod rapid, efectiv i relativ necostisitoare. De exemplu, Hornero-Mendez i Minguez-Mosquera au separat carotenoidele din Capsicum annuum pe plci de silicagel GF60 ntr-o camer presaturat. Amestecul de eluare a fost compus din eter de petrol, aceton i dietil amin. O atenie deosebit ar trebuie s fie acordat n cazul n care separarea se face pe silicagel, deoarece uoara aciditate poate declana degradarea pigmentului, cum ar fi rearanjarea expozid-furanoxidelor n carotenoide. Prin urmare, este necesar a neutraliza prima aciditate a silicagelului nainte de separarea pigmentului. Din pcate, separarea compuilor cu structuri similare prin cromatografia n strat subire este dificil de obicei. Acest lucru este bine ilustrat prin compararea cromatogramelor obinute din pigmenii extrai din uleiul din semine de dovleac i separai prin cromatografia n strat subire sau HPLC. Utiliznd cromatografia n strat subire, sunt identificate patru benzi: dou benzi verzi corespund pigmenilor 9

protoclorofilei i protofeofitinei (moleculele protoclorofilei, care au pierdut un atom de Mg2+), iar celelalte dou benzi galbene reflect prezena carotenoidelor. Atunci cnd a fost analizat aceeai prob prin HPLC, au fost obinute 14 picuri. Ca o consecin a puterii relativ sczut a rezoluiei cromatografiei n strat subire, aceste metodologii au fost completate treptat cu tehnici de separare mai eficiente. Cu toate acestea, metodele cromatografiei pe coloan deschis i cromatografia n strat subire sunt nc folosite pentru curarea extractelor i/sau pentru a prepara o cantitate mare de pigmeni. II.3.3. Cromatografia n contracurent Ca fluid de extracie supercritic, cromatografia n contracurent constituie o metod alternativ pentru extraciile solvenilor i permite analiza probelor pe o scar larg. De fapt, cromatografia n contracurent este o versiune automat de extracie lichid-lichid, comparabil la mprirea repetat a unui analit ntre doi solveni imiscibili prin amestecarea viguroas ntr-o plnie separatoare. Ca orice tehnic cromatografic lichid, cromatografia n contracurent funcioneaz n condiii uoare i permite o izolare nedistructiv a compuilor naturali labile, cum ar fi pigmenii. Avnd n vedere absena unor faze staionare solide, scderea absenei este minimizat i, n consecin, recuperarea probei este aproape de 100%. Cromatografia n contracurent a fost aplicat cu succes la izolarea carotenoidelor din Gardenia i antocianinele din mai multe surse. II.3.4. Cromatografia lichid de nalt performan (HPLC) Pigmenii fotosintetici, clorofilele i carotenoidele au un caracter clar hidrofob i sunt, de obicei, analizai de coloanele n faz inversat-C18. Mai recent, a aprut o coloan n faz inversat-C30, care este particular eficient pentru separarea carotenoidelor, deoarece interaciunile pigmenilor i faza staionar sunt maximizate de dimensiunea lor similar. Cu aceast faz, muli izomeri cis ai aceleiai carotenoid sunt separai unii din alii. Aceast coloan n faz inversat-C30 a fost aplicat cu succes la determinarea carotenoidelor saponificate n sucul de portocale. Cu toate acestea, cnd un amestec este complex, coeluia poate deveni rapid limitat. Cnd valoarea total de izomeri cis i trans ai carotenoidelor este necesar, fazele staionare mai puin selective, cum ar fi coloana n faz inversat-C18, sunt preferate. Faza mobil utilizat la separarea moleculelor hidrofobe este, de obicei, alctuit din solveni organici, cu excepia cazului cnd moleculele polare, cum ar fi esterii glicozili ai carotenoidelor sau clorofilei, sunt prezente n amestec. n acest ultim caz, este recomandat un solvent organic polar amestecat cu o mic cantitate de ap. Pentru a mbunii separarea pigmentului, nclzirea coloanei este uneori propus. Aceast procedur, totui, nu este recomandat n cazul clorofilelor i carotenoidelor, deoarece nclzirea poate declana izomerizarea carotenoidei i epimerizarea i alomerizarea clorofilei. Aceste modificri nu sunt detectate prin metodele uzuale de HPLC. Exist multe metode prin HPLC descrise n literatura de specialitate pentru analiza carotenoidei. n ciuda acestei abundene, cnd compoziia carotenoidei este foarte complex, ar putea fi necesar nti s se separe diferite grupe de carotenoide, folosind o coloan deschis ambalat cu alumin. Folosind aceast metod, au fost obinute trei fracii: - fracia 1, care conine caroteni i epoxi-carotenoide, a fost eluat cu eter de petrol - fracia 2, care a fost compus din monohidroxi i ceto-carotenoide, a fost eluat cu 70-90% dietil eter n eter de petrol - fracia 3, compus din polihidroxi-carotenoide, a fost eluat cu 0-30% etanol n eter. Pigmenii coninui n fracii individuale ar putea fi separai cu ajutorul cromatografiei n strat subire sau metodele HPLC. n orice caz, trebuie avut grij s se realizeze bune condiii cromatografice pentru a garanta faptul c pigmenii sau degradarea produselor nu scap de analiz. Pentru a ilustra aceast posibilitate, profilele de eluie HPLC ai pigmenilor din uleiul de semine de dovleac folosind dou metode diferite de faze HPLC inversate, recomandate pentru analizele pigmenilor din plante, sunt ilustrate n figura 4. HPLC a fost, de asemenea, folosit pentru a evalua puritatea coloranilor alimentari disponibili pe pia, care decurge din pigmenii plantelor naturale. 10

Figura 4 Cromatograma racordat la 400 nm a pigmenilor (A-HPLC pentru metanol, acetonitril, clorur de metilen, iar B-HPLC pentru metanol, metanol-hexan)

n timp ce majoritatea metodelor utilizate pentru prepararea pigmenilor fotosintetici se folosesc doar solveni organici, amestecurile eluate necesare la separarea compuilor mai hidrofolici, cum ar fi antocianinele i betalainele, sunt de obicei un amestec de solveni organici i apoi. nainte de analiza antocianinelor prin HPLC, este recomandat s se purifice extractul pe un cartu C18-RP activate n prealabil cu methanol acidifiat. Folosind un protocol similar, Takeoka a analizat coninutul de antocianine din stratul de semine de fasole neagr prin HPLC. Au fost gsite trei antocianine: delfinidin-3-glucoz, petunidin-3-glucoz i malvidin3-glucozid. Compararea spectrelor de absorbie ale compuilor acilai i neacilai arat c acilarea schimb culoarea antocianinei la lungimi de und mai scurte. Programele de eluie HPLC pentru antocianine sunt mbuntite n mod constant i astzi este posibil s se separe pn la 15 antocianine diferite n 30 minute. Cu toate acestea, determinarea i cuantificarea antocianinelor prin HPLC sufer din cauza lipsei generale de disponibilitate a standardelor de antocianine pure. II.3.5. Cromatografia pe fluid supercritic Extracia pe fluid supercritic a fost utilizat cu succes pentru a izola -carotenele din morcovi i capsantinele din ardei. Favati a izolat -carotena i luteina din concentratele frunzelor la 40oC, la presiuni cuprinse ntre 29 i 70 MPa. Dei unele echipamente de laborator pot funciona cu mai puin de 2 g, o limitare major a utilizrii extraciei pe fluid supercritic este cantitatea mare de material necesar. Din punct de vedere analitic, extracia supercritic este compatibil cu cromatografia pe fluid supercritic, deoarece aceste dou tehnici pot arta faza mobil i unele dispozitive, favoriznd dezvoltarea metodologiilor de extracie i separare. Deoarece puterea eluiei a CO2 pur cu privire la carotenoide este destul de slab, este necesar s se adauge co-solveni, pentru a crete solubilitatea carotenoidelor n CO2. 11

Teoria solubilitii parametrului prezice c solubilitatea maxim a unui compus este atins atunci cnd solubilitatea parametrului solventului este echivalent cu cea a solutului. De exemplu, -carotena poate fi extras la 43oC i aproximativ 70 MPa. Din pcate, unele echipamente nu permit eluia la o presiune aa mare. Prin urmare, noile condiii ale presiunii i temperaturii ar trebui s fie gsite utiliznd o diagram, care s conecteze variaiile de presiune la densitatea gazelor pentru diferite temperaturi. La temperaturi mai sczute, densitile similare a celor ajunse la temperaturi mai mari, pot fi obinute pentru presiuni mai sczute. Aceste condiii sunt numite condiii supercritice. Ibanez a separat cu succes -carotena n mai puin de 10 minute n aceste condiii. Cea mai bun separare a fost obinut la 10oC i la o presiune de aproximativ 35 MPa, cu o coloan capilar care conine grupri de silonal dezactivat cu un reactiv octametil-ciclotetrasiloxan. Aceast coloan nu poate fi utilizat la temperaturi nalte, deoarece structura fazei poate fi distrus la temperaturi nalte, formnd legturi O-Si-CH3 cu faz de silicagel. n multe cazuri, experimentele au fost axate pe determinarea presiunii optime, temperaturii i paii de separare pentru a realize extracia carotenoidei. Contrar, profilul concentraiei de carotenoide n etapa supercritic a primit o atenie mai mic. Ambrogi a raportat variaia concentraiei carotenoidei de-a lungul procesului. n condiiile presiunii (30 MPa), temperaturii (60oC) i fluxului de CO2 (8-9 kg/h), 75% din totalul carotenoidei au fost recuperate implicnd doar 15% din totalul de CO2 necesar pentru extracia pigmenilor. II.3.6. Electroforeza capilar Pigmenii cu structuri foarte asemntoare pot fi greu de separat utiliznd coloane clasice RP-C18 HPLC. Acesta este cazul zeaxantinei i luteinei. Pentru a depi aceast dificultate, un program particular HPLC cu solvent ar trebui s fie aplicat. Ca alternativ, pot fi folosite alte metode de separare, cum ar ficoloana capilar. Electroforeza capilar permite separri rapide ale compuilor i un cost relativ sczut, deoarece deeurile sunt puternic reduse. Este utilizat cu succes n separarea zeaxantinei i luteinei. Buna separare i eluia rapid a pigmenilor sugereaz faptul c electroforeza capilar este potrivit pentru analizele de rutin ale probelor mici. Electroforeza capilar a fost angajat la separarea pigmenilor antocianinei din cpuni, soc, coacze negre. Cromatografia electrocinetic micelar a fost utilizat la analiza coninutului de antocianin al ctorva probe de produse alimentare.

II.4. Detecia pigmenilor Odat separai, pigmenii eluai vor fi identificai i cuantificai. n timp ce identificarea pigmentului este adesea bazat pe proprietile spectrale i pe comportarea cromatografic a moleculelor eluate individual, cuantificrile sunt mai mult bazate pe msurtorile absorbanei. Detaliile structurilor moleculare ale moleculelor eluate pot fi obinute utiliznd metode analitice sofisticate, cum ar fi spectrometri de mas i spectroscopia de rezonan magnetic nuclear multidimensional. n continuare, sunt prezentate cteva metode de identificare i de cuantificare a pigmenilor din legume. II.4.1. Spectroscopia UV-VIS Spectrele de absorbie ale pigmenilor pot fi considerate ca o amprent a lor. Prin urmare, spectroscopia prin absorbie constituie cea mai simpl modalitate de a identifica i cuantifica majoritatea pigmenilor prezeni n amestec. Mai multe posibiliti, variind de la msurtorile manuale utiliznd un colorimetru pn la detectoarele cu diode, pot fi utilizate. Aici, a dori s subliniez importana condiiilor necesre pentru o determinare exact a pigmenilor. Deoarece mediul pigmentului poate fi puternic influenat de poziia maxim a absorbanei i de forma spectrului, o msurare exact a concentraiei pigmentului cere ca pigmentul s fie dizolvat ntr-un solvent ai 12

crui coeficieni de absorbie specifici au fost determinai. Cu aceste date, este ntotdeauna posibil s se stabileasc un nou set de ecuaii, adaptate situaiilor particulare, cum ar fi un amestec complex de eluare utilizat n HPLC. Precizia msurtorilor depinde de tipul de dispozitiv utilizat, de determinarea exact a poziiei maxime a absorbanei i, de asemenea, de precizia coeficientului de absorbie utilizat n calcule. Prin urmare, este recomandat s se verifice n mod regulat literatura de specialitate pentru noile valori. Limitarea major, n identificarea pigmenilor pe baza spectrului de absorbie, este suprapunerea benzilor de absorbie a pigmenilor prezeni n amestec. Atunci cnd co-elueaz doi pigmeni, de obicei, este posibil s se stabileasc un set de ecuaii, care permite calcularea concentraiilor ambilor pigmeni. Cu toate acestea, aceast metod este mai puin eficient cnd numrul pigmenilor este prea mare. Pentru completare, este necesar s se precizeze c izomerii cis ai carotenei pot fi recunoscui, deoarece spectrul de absorbie prezint o band suplimentar n regiunea UV. Spectroscopia de fluorescen poate fi mai de ajutor datorit extraciei selective a pigmenilor, cum ar fi clorofilele, dar inutil n cazul carotenoidelor, deoarece fluorescena lor este foarte slab. II.4.2. Spectroscopia n infrarou (IR) Alte metode spectroscopice pot fi folosite la identificarea pigmenilor pe baza unei trsturi structurale particulare. De exemplu, spectroscopia IR a fost utilizat pentru a detecta prezena unei grupri alilice n fucoxantina carotenoidei, aloxantina i bastaxantina. Spectroscopia IR a fost, de asemenea, folosit pentru a stabili detaliile luminii indus de dependena oxigenului a colorantului clorofil n alimente. n concluzie, metodele spectroscopice permit o identificare brut a pigmenilor prezeni ntr-un extract, dar, n cele mai multe cazuri, compoziia specific poate rmne obscur. Prin urmare, obinerea informaiilor detaliate despre compoziia unui amestec de pigmeni necesit analize suplimentare. Aceste analize implic adesea separarea amestecului n componentele sale folosind metode cum ar fi cromatografia. Nici una dintre metodele descrise mai sus nu corespunde pe deplin la identificarea structurilor pigmenilor. Dei amprenta spectral conine suficiente informaii care permit identificarea cromoforului, aceasta nu conine ntotdeauna suficiente informaii care permit determinarea structurii complete a pigmentului. n multe cazuri, n special n cele cu antocianine, structura pigmentului este mult diferit fa de cea a cromoforului. Dei informaiile lips pot fi parial deduse din comportarea cromatografic i din comportarea datelor obinute, alte metode, cum ar fi spectroscopia de mas, trebuie s fie folosite la caracterizarea complet a structurii moleculei.

II.4.3. Spectroscopia de mas (MS) Clorofilele i carotenoidele au prezentat speciale provocri analitice spectroscopiei de mas, din cauza maselor lor mari, volatilitii sczute i instabilitii termice. Cele mai recente progrese n analizele spectroscopiei de mas ale tetrapirolilor au fost obinute cu ajutorul dezvoltrii metodelor de ionizare atmosferic, adic izomerizarea chimic la presiunea atmosferic (APCI) i ionizarea de tip electrospray (ESI). Tehnica APCI, mpreun cu RP-HPLC, se dovedete a fi eficient pentru detectarea clorofilei. Procedura este aproape de 1000 de ori mai sensibil dect izomerizarea de tip termospray. Pentru a demonstra potenialul spectroscopiei de mas de tip electrospray n cercetarea clorofilei, interfaa ESI a fost conectat cu un spectru de mas cu ioni capcan ca analizator de mas. Folosind metoda spectroscopiei de mas, alomerii clorofilei i derivaii ei, produse n timpul prelucrrii fructelor i legumelor, au fost izolate i structurile lor determinate. Folosind aceast metod, Giusti a obinut informaii structurale pe o component minor de antocianin din sucul de struguri i varz roie. O metod similar a fost folosit la analiza antocianinelor prezente n extractele de vin rou, precum i n cele de coacze negre. O limitare a spectroscopiei de mas n analizele antocianinelor i alcaloidelor apare din incapacitatea acestora de a se diferenia dintre diferitele forme diastereoizomerice ale zahrului. Prin urmare, aceast metod nu poate oferi informaii cu privire la substituienii exaci glicozidici, altele dect numrul atomilor de carbon i prezena gruprilor metilice legate de fraciile de zahr. Pentru a obine mai multe informaii asupra structurii 13

acestor substituieni este necesar s se foloseasc tehnologia spectroscopiei de mas. ESI-MS a fost de asemenea folosit cu succes n determinarea structurii moleculare a altor pigmeni insolubili n ap, cum ar fi moleculelepolifenolice galbene, coninute n curcuma estras din rizomul Curcuma longa. II.4.4. Spectroscopia RMN Informaii suplimentare cu privire la structura moleculelor de pigment pot fi, de asemenea, obinute prin spectroscopia RMN. De exemplu, Choung a utilizat spectroscopia RMN pentru a identifica antocianinele separate prin HPLC din straturile seminelor de fasole cultivate n Coreea. Studiul a dezlnuit faptul c straturile roii i maro ale seminelor de fasole conin mai multe antocianine: cianidin-3,5-glucozid, delfinin-3glucozid, cianidin-3-glucozid i pelargonin-3-glucozid, dar nu i petunidin-3-glucozid. Petunidin-3glucozid este prezent doar n straturile negre ale seminelor de fasole. Straturile albe ale seminelor de fasole nu conin antocianine. Spectroscopia RMN a fost recent utilizat la stabilirea structurii antocianinelor, cum ar fi gentiodelfina i 5-carboxi-piranopelargonina, betacianinele. Spectroscopia RMN este un instrument foarte puternic pentru deterninarea structurilor pigmenilor. Cu toate acestea, ea are dou limitri majore intrinseci: - necesit o cantitate relativ mare de probe (n intervalul mg) - achiziia de date poate fi lung, n special n cazul 2D-RMN. Prin urmare, analistul ar trebui s fie sigur c pigmentul studiat ar rmne stabil pe parcursul ntregii perioade de analiz. De exemplu, betalainele sunt labile n condiii extreme de aciditate. n aceste condiii, degradarea pigmentului se produce foarte repede ca rezultat n spectrul complex RMN i, de asemenea, duce la pierderea probei. Pentru a depi aceste dificulti, Stintzing a testat mai multe combinaii de solveni. El a gsit c cel mai potrivit solvent este oxidul de deuteri (D2O) la 25oC i la valori ale pH-ului cuprinse ntre 5 i 7, deoarece permite obinerea stabilitii pe termen lung a pigmenilor i este compatibil cu cerinele 13C-RMN. n aceste condiii, solubilitatea betalainelor este suficient, iar cumulul sistemului i semnalele probei au loc. Conformaia 3D a pigmenilor antocianinei poate fi investigat folosind tehnica spectroscopiei nucleare.

II.5. Identificarea i cuantificarea pigmentului n seciunile precedente au fost prezentate diferite metode analitice care pot fi utilizate la identificarea pigmenilor. Un punct crucial este calibrarea semnalului detector. Aceast problem necesit standarde, n mod ideal, identice pentru fiecare pigment considerat. Aceste standarde nu sunt ntotdeauna disponibile n comer i ar trebui nainte s fie preparate. Gndindu-se la aceast problem, Schiedt i Liaaen-Jensen au definit criteriul minim pentru identificarea carotenoidelor: - spectrul de absorbie n regiunea UV-VIS, obinut din cel puin doi solveni diferii, ar trebui s fie n concordan cu cromoforul sugerat - proprietile cromatografice ale pigmentului purtativ i ale standardului trebuie s fie identice n cromatografia n strat subire (Rf) i HPLC: ambi compui trebuie co-eluai - un spectru de mas ar trebui obinut, care permite n cele din urm confirmarea masei moleculare. Alte reguli nu sunt specificate pentru identificarea altor pigmeni naturali, fiind sugerat un criteriu similar. Chiar i atunci cnd identificarea i calibrarea detectorului au fost mbuntite n conformitate cu aceste reguli, cuantificarea pigmentului poate s nu fie aa de puternic. Suma pigmenilor ntr-o prob nclzit poate fi mai mare dect nainte. Ca un paradox, care a fost frecvent raportat n fructele sau legumele fierte, a fost atribuit unei extractibiliti mari ale pigmenilor dup preparare, deoarece dup nclzire ar declana ruperea peretelui celulei, apoi se faciliteaz eliberarea pigmenilor din celule. 14

Capitolul III Studiile chimice ale antocianinelor

III.1. Introducere Antocianinele sunt colorani naturali, care au prezentat interes crescut datorit gamei extinse de culori, efectelor inofensive i benefice pentru sntate. Din cauza potenialului mare de aplicare pe care antocianinele l reprezint pentru industria alimentar, farmaceutic i cosmetic, utilizarea lor a fost limitat din cauza instabilitii lor relative i procentului mic de extracie. n prezent, cele mai multe investigaii ale antocianinelor sunt axate pe rezolvarea acestor probleme, precum i pe purificarea i identificarea lor. n acest document, cele mai recente progrese n investigarea chimic a antocianinelor sunt prezentate pe scurt, subliniind efectele pH-ului, co-pigmentrii ionului complex i activitii antioxidant asupra stabilitii lor. Studiul coloranilor naturali este un domeniu extins i activ al investigaiei datorit interesului crescut de substituire a coloranilor sintetici cu efecte toxice la oameni. Carotenoidele i antocianinele sunt printre cei mai utilizai colorani vegetali n industria alimentar. Carotenoidele sunt liposolubile, instabile i capabile s coloreze produsele alimentare de la galben la rou; acetia sunt obinui n general din morcovi, roii i ardei. Pe 15

de alt parte, antocianinele sunt solubile n ap i mai puin stabile dect carotenoidele; ei sunt extrai din struguri, fructe de pdure, varz roie, mere, ridichii, trandafiri, lalele i orhidee. Antocianinele (din greac anthos=floare i kianos=albastru) sunt pigmenii cei mai importani ai plantelor vasculare; ei sunt inofensivi i uor de ncorporat n mediul apos, ceea ce i fac interesani pentru utilizarea lor precum colorani naturali solubili n ap. Aceti pigmeni sunt responsabili pentru culorile portocalii, roii, rozului, violete, albastre strlucitoare ale florilor i fructelor unor anumite plante. O alt proprietate important a antocianinelor este activitatea lor antioxidant, care joac un rol vital n prevenirea bolilor neuronale i cardiovasculare, cancer i diabet. Exist mai multe rapoarte axate pe efectul antocianinelor n tratarea cancerului, pe nutriia uman i pe activitatea lor biologic. Prin urmare, datorit potenialului enorm al antocianinelor naturale ca pigmeni sntoi, exist un numr foarte mare de rapoarte gsite n literatura de specialitate pe diverse domenii, cum ar fi: dezvoltarea unor tehnici analitice de purificare i separare, aplicarea n produsele alimentare, identificarea i distribuia n plante, urmrirea culorii i schimbrii pigmenilor, biosinteza, analizele cantitative folosind tehnici cromatografice i electroforetice i n presarea plantelor. Investigaiile cele mai recente pun accent pe informaiile importante ale metodelor de stabilitate, extracie, purificare i identificare. III.2. Chimia antocianinelor Antocianidele sunt structurile de baz ale antocianinelor (tabelul 1). Antocianidele (sau agliconii) sunt constituite dintr-un nucleu aromatic legat de un lan heterociclic care conine O2, i care este, de asemenea, legat de o legtur C-C de al treilea C al nucleului aromatic. Cnd antocianidele se regsesc n form glicozidic sunt cunoscute sub numele de antociani. Culoarea acestor molecule a fost explicat prima dat de Pauling n 1939, care a propus c structura de rezonan a ionului de flavilium este cauza intensitii culorii lor. Exist o mare varietate de antocianine rspndite n natur (numele i prescurtrile celor mai comune sunt redate n tabelul 1). Principalele diferene ntre ele sunt numrul gruprilor hidroxilate, natura i numrul de zaharuri legate de structura lor, gruprile carboxilice alifatice sau aromatice legate de zahrul din molecul i poziia acestor legturi. Pn n prezent, exist rapoarte cu mai mult de 500 de antocianine diferite i 23 antocianidine din care doar 6 sunt cele mai ntlnite n plantele vasculare: Pg, Pn, Cy, Mv, Pt i Dp. Derivaii glicozidici ai celor 3 antocianidine non-metilate (Cy, Dp, Pg) sunt cei mai frecvent ntlnii n natur, fiind gsii n proporie de 80% n frunzele pigmentate, 69% n fructe i 50% n flori. Procentele de distribuie a celor 6 antocianidine cele mai ntlnite n fructe i legume sunt: 50% Cy, 12% Dp, 12% Pg, 12% Pn, 7% Pt, i 7% Mv. Derivaii glicozidici cei mai rspndii sunt: 3-monoside, 3-bioside, 3,5- i 3,7-diglucozide. Prezena derivailor 3-glucozide este de 2,5 de ori mai frecveni dect 3,5- diglucozidele i dect cel mai comun antocianin Cy-3-glucozida. Varietatea mare de antocianine gsite n natur le face a fi un grup complex i interesant de studiat. Tabelul 1 Identifiacrea structurii antocianidinelor

16

III.3. Stabilitatea antocianinelor Antocianinele izolate sunt foarte instabile i foarte sensibile la degradare. Stabilitatea lor este afectat de mai muli factori, cum ar fi: pH-ul, temperatura de depozitare, structura chimic, concentraia, lumina, oxigenul, solvenii, prezena enzimelor, flavonoidele, proteinele i ionii metalici. Stabilitatea chimic a antocianinelor este principalul obiectiv al studiilor recente, datorit aplicaiilor lor abundente i poteniale, efectelor lor benefice i utilizrii lor ca alternativ la coloranii artificiali. III.3.1. Solventul i efectele concentraiei antocianinei Investigaiile recente cu srurile sintetice ale flaviliumului n soluii de natur diferit (acetonitril : ap, etanol, propileuglicol, dioxan i 2-butadon) au artat c schimbrile de culoare depind de solvent i de concentraia srurilor sintetice ale flaviliumului (VFs). n solveni protici, srurile sintetice ale flaviliumului se coloreaz n rou, n timp ce n solvenii aprotici soluiile sunt galbene. Acest lucru a fost explicat presupunnd c speciile roii i galbene corespund unui monomer, respectiv unui dimer; de aceea, atunci cnd crete concentraia srurilor sintetice ale flaviliumului, culoarea roie este favorizat. De asemenea, s-a observat c, atunci cnd crete cantitatea de ap n acetonitril, monomerul este transformat ntr-un dimer de culoare verde. Astfel, apa joac un rol fundamental n dimerizarea srurilor de 17

flavinilium, datorit faptului c aceste molecule necesit neutralizarea propriilor lor repulsii electrostatice cu moleculele de ap, astfel nct dimerizarea s poat avea loc. III.3.2. Influena pH-ului Antocianinele pot fi gsite n diferite forme chimice care depind de pH-ul soluiei (figura 5). La pH =1, cationul de flavilium (de culoare roie) este specia predominant i contribuie la colorarea soluiilor n rou i violet (figura 5A). La valorile pH-ului cuprinse ntre 2 i 4, speciile quinoidale sunt predominante cele albastre (figura 5B-D). La valori ale pH-ului cuprinse ntre 5 i 6, doar 2 specii incolore pot fi observate (pseudobaza carbinolului i calconul - figura 5E-F). La pH>7, antocianinele sunt degradate n funcie de grupele lor de substitueni (figura 5 reacii de degregare). La valori pH cuprins ntre 4 i 6, coexist patru forme structurale ale antocianinelor: cationul de flavilium, baza quinoidal anhidrid, baza incolor a carbinolului i calconul galben pal. Echilibrul dintre bazele quinoidale i carbinol are loc prin intermediul cationului de flavilium aa cum este artat n figura 1 (structurile D, A i E). Cnd pH-ul este crescut, de asemenea, suma bazelor anhidre crete i, n condiii mai acide, specia predominant este ionul rou de flavilium. Stabilitatea antocianidinelor este influenat de substitueni i de prezena grupelor adiionale de hidroxil sau de metoxil, care scad stabilitatea agliconului n mediul neutru; de aceea, Pg este antocianidina cea mai stabil. Opus agliconilor, monoglicozidelor i diglicozidelor, derivaii sunt cei mai stabili n condiii de pH neutru. Investigaiile cu privire la stabilitatea antocianinelor i la variaia culorii cu pH duc la concluzia c schimbrile de culoare ale acestor compui sunt cele mai importante n regiunea alcalin, datorit instabilitii lor.

Figura 5 Formele chimice ale antocianinelor dependente de pH

18

III.3.3. Efectul de co-pigmentare Co-pigmentarea este un fenomen n care, pigmenii i ali compui organici incolori, sau ionii metalici, sub form molecular sau ascoiaii complexe, genereaz o cretere sau o schimbare a intensitii culorii. n stiina alimentar, acest fenomen este considerat o interaciune foarte important deoarece culoarea este unul din factorii cruciali de calitate n acceptarea produselor. Unele investigaii sugereaz c, co-pigmentarea antocianinelor cu ali compui (co-pigmeni) este principalul mecanism de stabilizare a culorii n plante. Copigmenii sunt sisteme bogate n electroni p, care au capacitatea s se asocieze cu ionii flaviliumului, care sunt destul de sraci n electroni. Aceast asociere ofer protecie atacului nucleofil al apei n poziia 2 a ionului de flavilium i altor specii, cum ar fi peroxizii i sulfur-dioxinele n poziia 4. Co-pigmenii sunt, n general, incolori, dar cnd sunt amestecai cu o soluie antocianic, interaciunea producnd un efect hipercronic i o schimbare batocrom n spectru de absorbie (regiunea UV-VIS). Co19

pigmenii pot fi flavonoide, alcaloizi, aminoacizi, acizi organici, nucleotide, polizaharide, metale sau alte antocianine. Interaciunea antocianine co-pigmeni poate fi realizat n 5 moduri diferite, n funcie de speciile care intreacioneaz (figura 6). Dac co-pigmentul este alt antocianin, este format o asociere sigur sau o copigmentare intramolecular; cnd interaciunea se face cu un metal, se efectueaz o complexare; n cazul n care are loc intre co-pigmeni i perechea de electroni liberi, are loc o co-pigmentare intermolecular, iar n cele din urm, cazul cel mai complex, co-pigmentarea poate avea loc prin interaciunea unui aglicon, zahr, copigment cu protonii, toate n acelai timp. Figura 6 Interaciunea antocianinelor (A) self-association, (B) intramolecular copigmentation, (C) metal complexation, (D) intermolecular copigmentation

Cnd co-pigmentul este un alt compus fenolic, interaciunea este trectoare din cauza lipsei legturilor chimice. Acest component este rezultatul unui femomen chimic cunoscut sub denumirea de formare a unui 20

complex prei schimbarea transferului sau interacii p-p; acest fenomen apare atunci cnd compuii cu srcini opuse interacioneaz. Rezultatul total de co-pigmentare se bazeaz pe dou etape: - formarea complexului p-p, care determin schimbrile proprietilor spectrale ale moleculelor n ionul de flaviliu, crete intensitatea absorbiei (efectul hipercromic) i a lungimii sale de und (efect batocrom) - stabilirea formei flaviliumului de un complex p deplaseaz echilibrul n partea n care crete intensitatea culorii roii (figura 7). Prin urmare, amploarea efectului de co-pigmentare este dependent de pH, deoarece la valori mici ale pH-ului, toate moleculeleantocianinei sunt n form flavilium, iar la valori ridicate ale pH-ului, antocianina este n forma ei pseudobaz de carbinol, care este incolor. Efectul de co-pigmentare este evident la pH=4-6, unde antocianinele exist n forme incolore. Recent a fost propus c formarea de complex p-p induce reaciile dintre antocianine i acizii tanici din vinuri, producnd legturi covalente care genereaz acizii tanici pigmentai. Cuplarea chimic dintre antocianine i acizii tanici nu este bine cunoscut; cu toate acestea, unii cercettori au sugerat c mecanismul implic acetaldehidele, acizii tanici i antocianinele. Reacii similare au fost, de asemenea, observate ntre acizii tanici i flavan-3-etanolii. Figura 7 Exemple ale stabilitii antocianinelor

21

III.3.4. Interacia ionilor metalici Varietatea de culori n flori, iniial, a fost explicat prin formarea chelailor dintre metale i srurile flaviliumului. n ciuda interesului sczut n industria alimentar despre complexarea antocianin-metal, aceast interaciune constituie o alternativ viabil pentru stabilizarea culorii, n special, n cazul n care metalele coninute nu implic un risc pentru sntate sau n cazul n care ele chiar fac parte din mineralele eseniale dietei. Una dintre principalele caracteristici ale antocianinelor i antocianidinelor cu grupri orto-di-hidroxil (Cy, Dp, Pt), este capacitatea lor de a forma complci metal-antocianin (tabelul 1). Unele studii privind stabilitatea culorii n plante sugereaz c aceste culori albastre sunt datorate unui complex format ntre antocianine i unele metale, cum ar fi: Al, Fe, Cu, Sn, Mg i Mo. n interaciunea antocianinei cu Al(III), complexarea a fost format cu Cy i ali derivai flavonoizi, constatnd faptul c acest proces stabilizeaz baza albastr de quinoidal, prin evitarea oxidrii sale. Ali autori au studiat variaia culorii a unui esut de varz Hindu adugnd soluii de Mo (IV i VI), unde, n ambele cazuri culoarea albastr a fost stabilizat. Acest fapt sugereaz posibilitatea de complexare dintre antocianin i Mo. Mai multe studii recente au artat c,complexarea dintre o-di-hidroxilantocianin i Fe (III) sau ionii de Mg (II) la pH=5, este esenial pentru formarea culorii albastre n plante, mai ales n cazul n care raportul stoichiometric antocianin:Fe(III) este 1:6 sau mai mare pentru Mg (II). III.3.5. Activitatea antioxidant Compuii care sunt mai uor de oxidat sunt adesea cei mai buni antioxidani (moleculele care pot dona un electron liber sau un atom de H pentru a reaciona cu radicalii liberi). Cteva studii au sugerat c, coninutul de antocianin i activitatea ei antioxidant corespunztoare, contribuie la efectul protector al fructelor i legumelor mpotriva bolilor cornice i degenerative. Unele plante i extracte din fructe cu coninut ridicat de compui fenolici, au fost raportate pentru a aciona ca inhibitori mutagenici i carcinogenici. Substanele fitochimice, care prezint o activitate antioxidant, include, pe lng compuii fenolici (flavonoide), compui azotai, tocoferoli, carotenoide i acid ascorbic. n catecoli, oxidarea se realizeaz prin intermediul radicalilor liberi, pn cnd formeaz semiquinone foarte stabile. Compuii cu grupe de catecol sau 1,4-hidroquinon sunt deosebit de uor de oxidat, deoarece radicalul fenoxil poate fi stabilizat cu oxigen. Dac ar fi fcut o anlogie ntre gruprile de catecol i cele mai frecvente antocianidine, ar fi de ateptat c acelea care au o substituie cu o-dihidroxil (Cy, Dp, Pt) sunt cele mai sensibile la oxidare. n cazul Pg, Pn i Mv oxidarea nu se poate realize uor, deoarece ele nu sunt substituite o-dihidroxil. Din cele 6 cele mai comune antocianidine, Pg este cea mai stabil n condiii de pH neutru. Avnd n vedere stabilitatea radicalului semiquinon n catecol, n figura 8 este propus un mechanism radicalic liber pentru stabilitatea semiquinonei format prin oxidarea Cy. Presupunnd de asemenea aceast supoziie pentru o-dihidroxil antocianidin cu metale, este probabil c acest complex reduce capacitatea antioxidant a antocianinei sau a antocianidinei, pentru c atomii de oxigen sunt limitai de ionul metallic, ca i n complxul antocianin-Al(III) i ele nu ar mai fi disponibile pentru reaciile de oxidare. Antocianidinele i antocianinele au artat o activitate antioxidant mai mare dect vitamina C i E. Aceti compui sunt capabili de a capta radicalii liberi prin donare de atomi de hidrogen fenolici; acesta este motivul pentru activitatea lor anticarcinogenic. A fost de asemenea raportat o corelare linear ntre valorile capacitii antioxidante i coninutul de antocianine n mure, zmeur i cpuni; n plus, a fost descries faptul c extractele de boabe posed o activitate de curare ridicat fa de speciile reactive ale oxigenului generate chimic. Aciunea antioxidant a fructelor de pdure este direct proporional cu coninutul de antocianine.

22

Figura 8 Mecanismul propus pentru stabilitatea radicalului Cy semiquinon

III.3.6. Pyranoantocianinele Primul raport al pyranoancianinelor dateaz din 1996, cnd o nou clas de pigmeni a fost detectat n vinurile roii filtrate. Aceste molecule au avut o atenie deosebit pe parcursul ultimilor 10 ani, deoarece ele au o stabilitate mai mare dect antocianinele, la variaiile valorilor de pH. Ele sunt formate n urma reaciei antocianinelor cu moleculele care au greutate molecular mic, precum 4-vinilfenol, acidul piruvic i flavonolii. De asemenea, unele pyranoantocianine au fost detectate n soluiile de vin studiate. Aceste atribute diferite ale pyroantocianinelor au ridicat unele semne de ntrebare cu privire la contribuia lor posibil pentru culoarea vinurilor roii vechi. Structurile bine cunoscute ale principalelor pyranoantocianine sunt artate n figura 9. Studiile efectuate au artat dependena concentraiei soluiilor fa de civa factori: acidul piruvic, acetaldehid, nivelurile antocianinei, pH i temperatur. Mecanismul sugereaz o reacie a antocianinelor din vin cu acizii hidroxicinamici simpli (acidul coumaric, cafeic, ferulic i sinapic). Reacia este destul de rapid, dar depinde de condiiile de depozitare. Pentru analiza compuilor puri au fost utilizate metodele UV-VIS, 1H-RMN, 13C-RMN, MS-ESI i LC-ESI-MS. Unele pyranoancianine au fost identificate n sucul negru de morcovi i n sucurile de portocale.

23

Figura 9 Structurile chimice ale pyranoantocianinelor

III.4. Metode de extracie i purificare III.4.1. Metodele de extracie Extracia solventului a fost cea mai uzual metod de extracie a diferiilor compui prezeni n fructe, inclusiv flavonoidele. Compuii fenolici au fost extrai prin mrunire, uscare sau doar prin nmuierea fructelor proaspete ntr-un solvent de extracie. Antocianinele sunt molecule polare, astfel cei mai frecveni solveni utilizai n extracii sunt amestecurile apoase de etanol, metanol sau aceton. Aceste metodologii implic coextracia substanelor nefenolice (zaharuri, acizi organici i proteine), care necesit procese de purificare ulterioare (de exemplu, extracia n faz solid SPE).

24

Printre metodele cele mai uzuale sunt cele care utilizeaz metanolul acidulat sau etanolul ca ageni de extracie. Dintre aceste metode, extracia cu metanol este cea mai eficient, de fapt, s-a constatat c, n extraciile antocianinei din pulpa de struguri, extracia cu metanol este cu 20% mai eficient dect extracia cu etanol, i cu 73% mai eficient dect extracia cu ap. Cu toate acestea, n industria alimentar este preferat extracia cu etanol datorit toxicitii metanolului. n extraciile cu solvent acidulat, o atenie deosebit ar trebui s aib loc pentru a evita mediul puternic acid, deoarece antocianinele acidulate s-ar putea degrada (reacie de hidroliz), iar n cazul antocianinelor 3-monoside legturile glicozide ar putea fi distruse. n afar de extraciile cu metanol i metanol acidulat exist rapoarte cu derivai ai etanolului sulfurai folosii ca ageni de extracie, utiliznd o soluie apoas de SO 2 (HSO3-), care poate reaciona cu antocianinele provocnd un atac nucleofil n molecul i cauznd aceast form a antocianinei incolore. nmuierea a fost, de asemenea, folosit pe scar larg pentru extracia antocianinelor; n industria vinului este cea mai curent metod, care const n mcinarea fructelor proaspete i punerea n contact a sucului de struguri cu coaja pentru a extrage pigmenii. n extraciile antocianinelor din coacze, o soluie apoas de 80% etanol saturat cu SO 2 a fost utilizat ca agent de extracie. Antocianinele din sorgul negru au fost extrase cu HCl 0,1% n metanol i 70% soluie apoas de aceton. Extracia cu metanol acidulat a fost de dou ori mai eficient dect extracia cu soluie apoas de aceton. Antocianinele n urma extraciei cu soluii apoase de aceton nu au fost identificate; aparent moleculele de antocianine ii modific semnificativ structura n soluii apoase de aceton, un fenomen care nu are loc n extracia cu metanol acidulat. Aceast observaie este n concordan cu alte investigaii, care au reuit s confirme formarea pyranoantocianinelor prin adugarea acetonei. n conformitate cu metodele de extracie raportate n literatura de specialitate, se poate observa c, n scopul extraciei antocianinelor acilate i 3,5-diglicerinei, este necesar s se utilizeze un mediu acid pentru a evita hidroliza (acidul formic sau acidul acetic); n cazul extraciei cu HCl 0,1% n metanol, au fost de asemenea obinui aglicoli, dar n aceste condiii nu se tie dac agliconii au fost simpli sau dac ei au hidrolizat n timpul extraciei. Se poate concluziona c atunci cnd se utilizeaz mediu acid este posibil s se extrag mai multe i diferite antocianine. III.4.2. Metodele de purificare Metodele de extracie propuse pn acum nu sunt selective pentru antocianine, deoarece ele sunt n msur s co-extrag un numr mare de ali compui, cum ar fi zaharuri sau acizi organici. n consecin, este necesar s se implementeze noi tehnici de purificare, n scopul de a izola antocianinele care intereseaz. n acest sens, s-a propus o varietate mare de tehnici, de la extraciile n faz solid (SPE) i n faz lichid-lichid (LLE) pn la utilizarea tehnicilor cromatografice sofisticate precum cromatografia n contracurent (CCC), cromatografia lichid la presiune medie (MPLC) i cromatografia lichid de nalt presiune (HPLC). Extracia n faz solid se utilizeaz frecvent n analiza C18 sau cartuului Sephadex, n care antocianinele sunt puternic legate de gruprile hidroxil i separate ulterior de ali compui prin creterea polaritii cu diferii solveni. Cromatografia n contracurent i cromatografia lichid la presiune medie sunt utilizate ca metode de purificare cu analize ulterioare prin HPLC pentru elucidare structural, cu avantajul de a minimiza timpul de separare i solvenii fazei mobile. Cea mai frecvent metod utilizat pentru separarea antocianinelor este HPLC cu detectorul UV-VIS sau matricea de fotodiod (PDA). III.4.3. Platforma de prelucrare pilot Dei importana pigmenilor naturali este cunoscut, exist puine rapoarte n utilizarea plantelor i fructelor pentru extracia antocianinelor. Acest lucru ar putea fi cauzat de trei factori limitativi, adesea trecui cu vederea n studiile tiinifice: - eficiena recuperrii i extraciei - comercializarea extractelor rezultate - adecvarea practic pentru produsele alimentare i farmaceutice. 25

Un alt factor important este stabilitatea i intensitatea coloraiei dat de antocianine, care depinde de structurile lor moleculare i de asociaiile inter i intramoleculare. Antocianinele sunt, de asemenea, cunoscute pentru sensibilitatea lor la cldur. n efortul de a pstra proprietile acestor compui au fost explorate cteva strategii pilot. Le, Durst i Wrolstand (2002) au efectuat ctevaexperimente pentru extragerea antocianinelor din afinele congelate. Ei au folosit extracia cu aceton alimentar cu adugare de SO2 ca agent de extracie.Apoi, o etap de purificare a fost fcut prin reextragerea cu chloroform:soluie de aceton (2:1) i concentrarea acestora printr-un tratament termic. Extractul final coninnd 465 mgxkg-1 din totalul antocianinelor corespunde la o rat de recuperare de la 13% la 23%. ntr-un alt studio, Kammerer, Kljusuric, Carle i Schieber (2005) au evaluat o rin schimbtoare de ioni pentru recuperarea i concentrarea antocianinelor din extractele de tescovin de struguri. Extractul apos a fost preparat prin adugarea de ap peste coaja strugurilor proaspei. Produsul rezultata a fost trecut prin rin i eluat cu metanol. Temperaturile de absorbie i desorbie au fost de 25oC, respective 50oC. Ratele de recuperare raportate au variat de la 96% la 100%. Valorile retie de recuperare n platforma de prelucrare pilot au fost comparate cu cele obinute experimental n laborator, rezultatele relevate nu au prezentat diferene semnificative ntre recuperrile prevzute de ambele metode. n scopul de a reduce la minimum nedorita descompunere natural microbian a antocianinelor n timpul etapei de extracie, Meng, Lozano, Bombarda, Gaydon i Li (2006) au propus o metodologie de curgere transversal de microfiltrare cu o membran ceramic i osmoz invers. Acest process a fost aplicat n frustescens Perrila cu 0,01 molxl-1 de acid azotic ca agent de extracie. Extractul acid final a fost concentrat de 9,4 ori coninnd 422 mgxl-1 din totalul de antocianine i reprezentnd 77% din extrasul total. III.5. Metodele de identificare Identificarea antocianinelor are un rol critic n studiile taxonomice i de alterare, n afar de evaluarea calitii produselor alimentare brute i prelucrate. Datorit caracteristicilor spectrale ale antocianinelor care ofer informaii utile calitative i cantitative, de fapt spectroscopia este tehnica cea mai folosit datorit simplitii ei i costului redus. Giusti i Wrolstad (2001) au publicat comentariile excelente despre metodele utilizate cel mai frecvent n caracterizarea i cuantificarea antocianinelor (UV-VIS, HPLC, PDA). Prin urmare, spectrometria de mas (MS) i spectroscopia de rezonan magnetic nuclear protonic 1 ( H-RMN) i 13C-RMN au devenit tehnicile preferate pentru identificarea antocianinelor. III.5.1. Spectrometria de mas (MS) Analizele antocianinelor prin spectrometria de mas au fost efectuate pentru diferite scopuri: elucidarea structural, studiul transformrilor n timpul nvechirii vinului rou, polimerizrile i reaciile cu alte flavonoide. n tabelul 2 sunt prezentate referinele principale ale utilizrii spectrometriei de mas n studiile antocianinelor. Recent, tehnicile cum ar HPLC cuplat cu MS, APCI-MS, FAB-MS i ESI-MS au devenit instrumente foarte puternice pentru identificarea antocianinelor. n ultimele dou decenii, numeroase metode de ionizare au fost dezvoltate pentru probele nevolatile sau pentru probele instabile termodinamic precum antocianinele. Aceste tehnici evit ulterioara volatilizare i ionizare i mrete energia probelor solide sau lichide n diferite moduri, astfel nct se produce formarea direct a ionilor gazoi. Ca o consecin, este posibil s se obin spectre foarte simplificate. Printre aceste surse de desorbie s-au contactat FAB, ESI i MALDI, care sunt considerate surse regulate de ionizare, deoarece ele provoac fragmentare slab i permit determinri exacte ale maselor moleculare (tabelul 2). Wang, Kalt i Sporns (2000) au raportat utilizarea MALDI-ToFMS pentru identificarea extractului de affine. Principalul avantaj al acestei tehnici, conform autorilor, a fost acela c analizele au fost effectuate n aproximativ 4 minute/prob.

26

Tabelul 2 Analizele antocianinelor prin spectrometria de mas

III.5.2. Rezonana magnetic nuclear (RMN) Tehnica RMN a fost utilizat pentru elucidarea structural a antocianinelor. Prin efectuarea experimentelor de corelare COSY, a fost posibil identificarea antocianinelor acilate n trandafiri, observnd c principalele antocianine au fost Cy-3-cum-glc-5-glc, Pn-3-cum-glc-5-glc i Cy-3-sop. n ceea ce privete identificarea antocianinelor n cpuni, au fost efectuate de Froytlog, Slimestad i Andersen (1998) aceleai experimente de corelare cum ar fi HMBC, HSQC, DQF-COSY. n acest studiu, un nou aglicon a fost gsit: 5carboxipyranpelargonidina. Experimentele de corelare au fost folosite de civa cercettori, n special pentru a determina poziia glicozidei n antocianine. n mod similar, cteva experimente RMN de corelare au fost fcute pentru adiia antocianinei (cu acid piruvic) gsit n vinul rou. n acest studiu, este propus un mecanism pentru formarea a doi pigmeni obinui din acelai produs (acid Mv-3-glc-piruvic i acid Mv-3-cum-glc-piruvic), aceste studii fiind efectuate cu ajutorul metodelor 1H-RMN i 2D-RMN (COSY). Spectroscopia de rezonan magnetic nuclear a fost foarte util pentru identificarea produilor de reacie a antocianinelor cu ali compui, cum ar fi derivaii acidului cinamic, radicalii peroxil, catechinele i flavonolii.

27

III.5.3. Electroforeza capilar (CE) Utilizarea electroforezei capilare n separarea antocianinelor este destul de recent, limitat i promitoare datorit solubilitii ridicate n ap a acestor compui. Electroforeza capilar este tehnica potrivit pentru separarea, identificarea i cuantificarea antocianinelor. Primele analize ale antocianinei prin electroforeza capilar au fost raportate n 1996. n acest studiu s-a folosit un tub capilar siliconic, o soluie tampon de borat (pH=8) i detector PDA. Datorit instabilitii antocianinelor la pH bazic, rezoluia i sensibilitatea metodei au fost foarte mici, iar autorii au fost n msur s obin rezultate doar la concentraii ridicate ale antocianinei. Mai trziu, aceiai cercettori au propus alte metodologii prin utilizarea soluiei tampon de fosfat la pH=2,1 i CTAB ca surfactant cationic. CTAB a fost folosit pentru a acoperi suprafaa capilar n scopul de a evita interaciunile pereilor antocianinei i a schimba direcia EOF, care afecteaz rezultatele separrii i cuantificrii. Alte variante ale electroforezei capilare au fost utilizate pentru determinarea cantitativ a antocianinelor n vin ca o alternativ a HPLC; studiul a fost realizat cu ajutorul unei capilare siliconice i a soluiei tampon Na2B4O7 la pH=8,4 cu 15% metanol ca modificator. Electroferogramele au fost obinute la 599 nm i, n scopuri de cuantificare, curbele de calibrare au fost realizate folosind Mv-3-glc ca standard. n acest raport, rezultatele au fost mai bune dect cele publicate n 1996, deoarece a fost fcut o preconcentrare a soluiei, n afar de adugarea modificatorilor organici pentru a spori selectivitatea metodei i stabilitatea antocianinelor. O metod similar a fost propus pentru antocianinele acilate sau non-acilate i derivaii 3-glucozidei. Calvo, Saenz-Lopez, Fernandez-Zurbano i Tena (2004) au efectuat unele experimente de electroforez capilar pentru pigmenii care au fost separai de LC, cu scopul de a identifica compuii i pentru a determina timpul de migrare, explicaiile lor fiind bazate pe raportul de schimbare a masei i pe posibilitatea formrii unui complex cu moleculele soluiei tampon de tetraborat. Un alt mod de utilizare a electroforezei capilare, care a fost folosit n analizele antocianinelor, este electrocromatografia micelar (MEKC). Prin utilizarea acesteia, s-a descoperit o metod de a separa simultan 6 antocianine (Mv-3,5-diglc, Mv-3-glc, Mv-3-gal, Pg-3-glc, Cy-3,5-diglc i Cy-3-gal). Condiiile de analiz au fost: soluie tampon de fosfat 30 mM + 400 mM borat-TRIS + 50 mM SDS, pH=7. Concentraia mare de borat a fost foarte important la separarea perechilor de diasteromeri, cum ar fi Mv-3-glc i Mv-3-gal. n ceea ce privete SDS, este cunoscut faptul c formarea de miceli ncrcai negativ ofer stabilitate chimic antocianinelor n soluii apoase. Rezultatele acestor investigaii indic faptul c numrul de sarcini negative i o distribuie organizat a acestor sarcini pe suprafaa micelei sunt factori determinani pentru a permite stabilitatea i pstrarea culorii a antocianinelor. Electroforeza capilar a fost de asemenea folosit pentru a crea corelaii ntre coninutul antocianinelor i nvechirea vinului rou. Electroforeza capilar cuplat cu ESI-MS a fost utilizat pentru monitorizarea antocianinelor i flavonoidelor n vin. Condiiile experimentale au fost: soluie tampon de cloroacetat de amoniu (pH=2) i soluie tampon de borat de amoniu (pH=9, cu o selectivitate mare a derivatelor cu grupri hidroxil). Metoda spectrometriei de mas a fost optimizat i fragmentrile antocianinelor au fost studiate n detaliu. III.5.4. Calcule teoretice Civa cercettori au efectuat calcule teoretice n scopul de a prezice comportamentul chimic al antocianinelor n diferite soluii. Rapoartele calculelor teoretice pentru antocianine sunt limitate, dar unul dintre studiile care au fost bazate pe calculele orbitalilor moleculari (MO) a fost fcut n scopul de a determina interaciunea unor acizi organici cu antocianinele i modul n care aceasta le afecteaz colorarea (efectul de copigmentare). n plus, unele studii au fost efectuate pentru caracteristicile structurale i electronice pentru patru antocianidine: Pg, Cy, Dp i An. Pentru aceste molecule, structurile plane i cele n afara planului au fost determinate la un nivel de teorie B3LYP/D95. Rezultatele au indicat faptul c structurile plane sunt mai stabile dect cele n afara planului, iar autorii au artat c hidroxilarea gruprii fenil produce o schimbare n energia excitat fr a ine cont de efectele solventului; acest fapt este de acord cu experimentele precedente spectrale i cu experimentele de calcul ale orbitalilor moleculari.

28

III.6. Concluzii Antocianii, mai ales antocianidenele, posed o varietate de proprieti farmacologice, fcndu-i interesani ca potenial ageni chemopreventivi de cancer. Ei apar n fructe i legume n cantiti relativ mari. Studiile farmacocinetice sugereaza c antocianinele sunt uor de ingerat din sursele lor naturale, care pot furniza nivelurilor sanguine la oameni un domeniu de 10-8-10-7 M. Problemele care rmn nerezolvate sunt att dac aceste nivele sunt suficiente pentru exercitarea efectelor robuste anticarcinogenice, ct i dac antocianinele exercit eficacitate chemopreventiv ei nsii sau n cazul n care au nevoie s fie supui hidrolizei cu omologii lor agliconici. Antocianidinele s-au dovedit a inhiba supravieuirea celulei maligne i semnalizarea oncogenic cu poten rezonabil. Dei studiul literaturii disponibile n prezent prevede sugestiile la utilitatea potenial a antocianilor ca intervenii chemopreventive de cancer, sunt necesare studii suplimentare. Dou tipuri de investigaii par a fi deosebit de importante. n primul rnd, diferenele potenialelor farmacologice dintre derivaii antocianilor trebuie s fie definite n continuare, pentru a permite stabilirea proprietilor care urmeaz s fie fcute cu privire la antocianine i/sau antocianidine. n al doilea rnd, studiile ar trebui s se concentreze pe tipurile de esuturi care ar putea fi susceptibile la prevenirea cancerului cu antociani. Rezultatele din astfel de studii, mpreun cu cele prezentate mai sus, vor oferi baza tiinific solid pentru a sprijini ideea c ingestia de 5 porii de fructe colorate/zi este foarte bun, deoarece poate preveni cancerul. Accentul investigaiilor recente ne permite s constatm o cretere semnificativ n utilizarea antocianinelor ca i colorani naturali n diverse produse n timpul urmtorilor ani. Avnd n vedere efectul benefic pentru sntate al acestor molecule, ncorporarea lor n industria alimentar i n industria buturilor va reprezenta o valoare important. Punerea n aplicare a unei bune metodologii de extracie, purificare i identificare ntr-un laborator i apoi ntr-o platform de prelucrare pilot, va avea loc un impact asupra costului acestor colorani i asupra standardelor lor n viitorul apropiat, precum i asupra creterii unor noi instrumente de autentificare ale acestor produse alimentare. Cercetarea pigmenilor din plante este fascinant. Ea implic mai multe metode i cunotine profunde n mai multe domenii. Studiile pigmentului din plante ar trebui s continue, deoarece ele pot procura cteva impresii interesante imediate la fel de bine ca i avantajele comerciale i ale sntii. Pentru aceste avantaje, este important s se aib la dispoziie cele mai bune metodologii pentru analizarea compoziiei pigmentului din probe. Aceste metode pot conine tehnici, cum ar fi spectrometria n infrarou, spectroscopia de rezonan magnetic nuclear etc., care, n trecut, au fost mai restrnse din punct de vedere al utilizrii lor n cercetrile de baz.

29

Bibliografie

1. Darren Cooke, William P. Steward, Andreas J. Gescher, Tim Marczylo Anthocyans from fruits and vegetables Does bright colour signal cancer chemopreventive activity? European Journal of Cancer 41 (2005): 931-1940
2. Araceli Castaneda-Ovando, Ma. De Lourdes Pacheco-Hernandez, Ma. Elena Paez-

Hernandez, Jose A. Rodriguez, Carlos Andres Galan-Vidal Chemical studies of anthocyanins: A review Food Chemistry 113 (2009): 859-871 3. Benoit Schoefs Determination of pigments in vegetables Journal of Chromatography A, 1054 (2004): 217-226

30

CUPRINS Capitolul I Antocianii din fructe i legume.................................................................................2

I.1. Introducere ....................................................................................................................................................2 I.2. Dovezi epidemiologice..................................................................................................................................3 I.3. Proprietile chimice......................................................................................................................................3 I.4. Proprietile chemopreventive ale cancerului la animale..............................................................................4 I.5. Efecte farmacologice n vitro.........................................................................................................................4 I.6. Farmacologia clinic i pre-clinic................................................................................................................5

Capitolul II Determinarea pigmenilor n legume.......................................................................6

II.1. Introducere....................................................................................................................................................6 II.2. Extracia pigmentului....................................................................................................................................8 II.2.1. Moleculele de clorofil i de carotenoide..............................................................................................8 II.2.2. Antocianinele ........................................................................................................................................8 II.2.3. Betalainele.............................................................................................................................................9 II.3. Separarea cromatografic a pigmenilor din legume....................................................................................9 II.3.1. Coloana deschis...................................................................................................................................9 II.3.2. Cromatografia n strat subire................................................................................................................9 II.3.3. Cromatografia n contracurent.............................................................................................................10 II.3.4. Cromatografia lichid de nalt performan (HPLC).........................................................................10 II.3.5. Cromatografia pe fluid supercritic.......................................................................................................11 II.3.6. Electroforeza capilar .........................................................................................................................12 II.4. Detecia pigmenilor...................................................................................................................................12 II.4.1. Spectroscopia UV-VIS .......................................................................................................................12 II.4.2. Spectroscopia n infrarou (IR)............................................................................................................13 II.4.3. Spectroscopia de mas (MS)...............................................................................................................13 II.4.4. Spectroscopia RMN.............................................................................................................................14 II.5. Identificarea i cuantificarea pigmentului..................................................................................................14

Capitolul III Studiile chimice ale antocianinelor.......................................................................15

III.1. Introducere.................................................................................................................................................15 III.2. Chimia antocianinelor...............................................................................................................................16 III.3. Stabilitatea antocianinelor ........................................................................................................................17 III.3.1. Solventul i efectele concentraiei antocianinei.................................................................................17 III.3.2. Influena pH-ului................................................................................................................................18 III.3.3. Efectul de co-pigmentare....................................................................................................................19 III.3.4. Interacia ionilor metalici...................................................................................................................22 III.3.5. Activitatea antioxidant ....................................................................................................................22 III.3.6. Pyranoantocianinele...........................................................................................................................23 III.4. Metode de extracie i purificare...............................................................................................................24 III.4.1. Metodele de extracie.........................................................................................................................24 III.4.2. Metodele de purificare .......................................................................................................................25 III.4.3. Platforma de prelucrare pilot..............................................................................................................25 III.5. Metodele de identificare............................................................................................................................26 III.5.1. Spectrometria de mas (MS)..............................................................................................................26 III.5.2. Rezonana magnetic nuclear (RMN)..............................................................................................27 III.5.3. Electroforeza capilar (CE) ..............................................................................................................28 III.5.4. Calcule teoretice.................................................................................................................................28 III.6. Concluzii ..................................................................................................................................................29

Bibliografie...................................................................................................................................30

31