VOL, 114 TANUARIE - MARTIE. ISSN: 0048-7848 2010 Nr REVISTA : MEDICO-CHIRURGICALA A SOCIETATH DE MEDICI $I NATURALISTI DIN IASIRev. Med. Chir. Soc. Med. Nat., lasi - 2010 - vol. 114, nr. 1 BIOINGINERIE MEDICALA STUDIU EXPERIMENTAL PE SOARECI SWISS PRIVIND MODUL DE REACTIE A SISTEMULUI IMUNITAR IN URMA ADMINISTRARIT TOPICE A TREI COLORANTI REACTIVI TEXTILI C.C. Gayat', R.V. Lupusoru’, Cristina Mihaela Ghiciuc*, Catalina Elena Lupusoru* ~~~ Universitatea de Medicina si Farmacie “Gr.T, Popa” Iasi Facultatea de Bioinginerie Medical 1. Disciplina de Tehnologie protetica i Biotehnologii Facultatea de Medicina 2. Disciplina de Farmacologie EXPERIMENTAL STUDY REGARDING REACTION MODE OF SWISS MICE IM- MUNE SYSTEM, DUE TO TOPICAL ADMINISTRATION OF THREE TEXTILE RE- ACTIVE DYES (Abstract) : Reactive Red 183, Reactive Red 2 and Reactive Blue 204 (red dye, grena dye and blue dye) are three reactive dyes frequently used in textile industry. In some atmospheric conditions ( high temperature, perspiration, pH values, UV/IR radiations), some quantities of these hydrolyzed dyes, could pass from textile clothes directly into the human skin. Material and method : There were used 4 groups of white Swiss mice (with similar weight and number of both sexes), control group and 3 groups, treated once daily with a retro-auricular application of different reactive dyes. After 14 days of treatment, blood samples were taken from retro-orbitary plexus to assess leukocyte count, phagocytic capacity of periph- ral neutrophils, serum opsonic capacity, phagocyte capacity and bactericidal capacity of perito- neal macrophages, splenic T lymphocytes with rossetting capacity and spleen cells forming Jerne plaques. The retro-acuricular and latero-cervical nodes were weighted. Results : Red dye did not influence the weight of the studied nodes, but determined statistically significant modifications on non-specific immune system parameters, Blue and grena dyes determined modifications of weight especially of retroauricular nodes. Grena dye determined important effects of non-specific immune system parameters (serum opsonic capacity, phagocyte capacity and bactericidal capacity of peritoneal macrophages). The blue dye did not determine a biological response. Conclusion: Red and grena dye determined important effects on non- -specific immune system parameters. Key words: REACTIVE DYES, IMMUNOLOGYCAL PARAMETERS, TOXICITY, BIOLOGICAL RESPONSE, ARTICOLE ORIGINALE Colorantii reactivi, lansati pe piaji de Imperial Chemical Industries Ltd (1.C.1) in 1956 sunt, la ora actual, cea mai cuprin- zitoare grupi de coloranti cu aplicatii in industria textili. Ei prezinté marele avantaj ci se fixeaza pe fibrele celulozice prin lega- turi covalente, care se stabilesc intre gru- pele reactive ale colorantului, de obicei halotriazinice si grupele alcoolice din lan- ul macromolecular al celulozei (1,2). in procesul vopsirii, aceasta reactie prin- cipal dintre colorant si fibra, este insoyita de o reactie secundara, competitiva, in urma c&reia colorantul este hidrolizat la 0 forma inactiva, incapabild si mai adere la fibra. Consecinja direct este micsorarea gradului de fixare pe fibra, asociata cu pierderi in- semnate de colorant hidrolizat, care prin deversare in bazinele de apa, ridicd serioase probleme economice si de mediu (3) . Efectele adverse, constatate la manipularea unor coloranti reactivi, ca si actiunea lor 283C.C. Gavat et déuniitoare asupra viefuitoarelor din apele deversate, impun studierea atenté a pro- prietitilor nocive ale acestei grupe de colo- rangi (4). Lucrarea de fata isi propune s& abordeze un aspect particular al toxicitai a trei colo- ranjireactivi textili (un colorant rogu - Reactive Red 183, un colorant grena - Reac- tive Red 2 si un colorant albastru - Reactive Blue 204) si anume actiunea pe cale cutanata, asupra sistemului imunitar al organismului animal. Problema prezinta interes deoarece, prin intermediul imbracémintei organismul uman vine in contact direct cu acesti colo- rangi, care pot influenga in grade diferite, starea de sindtate a individului MATERIAL SI METODA S-au folosit patru loturi de cate 9 soareci albi Swiss, in greutate de 25-44 g, cu repar- titie uniform’ pe sexe, dintre care un lot martor, identic ca structurd, cu celelalte trei loturi. Solutiile 10% de coloranti s-au pre- parat in DMSO (dimetil-sulfoxid) si s-au aplicat topic, in cantitate de 25 él, in doza unica zilnica, la orele 8 a.m., in regiunea posterioara a urechii stangi, timp de 14 zile. La lotul martor, s-a administrat numai DMSO, in mod similar cu cei 3 colorant. Dupa 14 zile de administrare a coloran- tilor, s-a recoltat singe din plexul retro-or- ital, la toate cele 4 loturi. Sangele obtinut a servit la determinarea urmatorilor indica- tori: leucograma, formula leucocitar’, capa- citate de fagocitoz’ a PMN din sangele peri- feric (testul Nitro Blue Tetrazolium - NBT) (5), capacitatea opsonica a serului (CO). Dupa aceea, s-au sacrificat animalele si “s-a procedat la recoltarea ganglionilor retro- -auriculari si latero-cervicali, urmata de spa- larea peritoneului cu solusie Hank diluata 1/10 cu apa distilata, pentru a obtine lichi- dul peritoneal, din care s-a obtinut suspen- sia de macrofage, care a servit la determi- narea urmatorilor parametri: capacitatea fagocitara (CF) si bactericida (CB) a macro- 284 fagelor peritoneale, folosind o cultura de Staphylococcus aureus 94 si indicatori ai imunitatii specifice (determinarea limfoci- telor T splenice cu capacitate de rozetare si a spenocitelor formatoare de plaje de hemo- liza) (6). Rezultatele objinute au fost prelucrate statistic folosind testul t-Student, in vede- rea identificdrii diferenjelor gi a stabilirii semnificatiei statistice intre loturi. REZULTATE SI DISCUTIL Masa ganglionilor latero-cervicali are urmatoarea evolutie in urma administrarii colorantilor: sub actiunea colorantului albas- tru si rosu au aparut cresteri ai acestora faja de lotul martor, dar diferentele nu sunt semnificative statistic (p= 0,21 pentru DMSO/ Albastru si p= 0,07 pentru DMSO/Rosu) in cazul lotului caruia i s-a aplicat topic colorantul grena, s-a constatat o medie mai redusi a masei ganglionare comparativ cu martorul, fara semnificatie statisticd (p= 0,28 pentru DMSO/ Grena ), dar cu dife- rene semnificative fayé de lotul albastru (p= 0,03) si lotul rosu (p< 0,001). Ganglionii retro-auriculari aflati de aceeasi parte cu locul administrarii colorantului, au crescut sub actiunea colorantilor in compa- ratie cu martorul, rezultatele find asigurate statistic numai pentru colorantul grena si albastru. (respectiv p<0,001 si p= 0,01 ) Formula leucocitard. Dup& 14 zile de administrare topic’, doi dintre coloranti (al- bastru si rosu) determina o sc&dere semni- ficativa statistic (p<0,001) a procentelor de polimorfonucleare neutrofile (PMN) din sdngele periferic, comparativ cu lotul mar- tor iar colorantul rosu este mai activ in comparatie cu cel albastru si cel grena (p< 0,001). Colorantul grena nu a produs modifi- cri semnificative statistic (p= 0,3) (fig. 1). Limfocitele (Ly) din sangele periferic (fig. 2), au scdzut semnificativ la cele dowd loturi carora li s-a administrat colorantul albastru si rosu, comparativ cu lotul martorStudiu experimental pe soareci Swiss privind modul de reacfie a si temului imunitar DMSO Fig. 1. Formula leucocitara e700 e180 malas Ros aGrena PMN% 5.50 620 65.00 e540 | 6550 65.40 65.20 | 65.00 apo Alas Rosy Grena Fig. 2. Formula leucocitara - Ly % (p<0,001) iar intre cele doud loturi diferen- jele nu sunt semnificative statistic (p=0,41) in schimb intre Albastru/ Grena si Rosu/ Grena, diferenjele sunt semnificative sta~ tistic (respectiv p= 0,01 si p<0,001). Dupa 14 zile de administrare topica, nici unul dintre colorantii testati nu au influen- {at semnificativ statistic procentele de eozi- nofile din sangele periferic, comparativ cu lotul martor. Bacofilele (B) din sangele periferic (fig 3) au crescut semnificativ statistic la lotu- rile c&rora li s-a administrat topic retro- -auricular cei trei coloranti, comparativ cu lotul martor (p< 0,001). S-a constatat de asemenea o diferenja semnificativ statistic intre loturile Albastru/Rosu (p=0,03) si Rogu/ Grena (p=0,01), cresterea fiind in favoarea lotului ce a primit colorantul rosu, respectiv rosu > albastru > grena Variatiile valorilor procentuale ale mono- citelor (M) din sangele periferic, nu pot fi considerate concludente, din cauza expri- mari procentuale a formulei leucocitare. Capacitatea de fagocitoza a PMN din sdngele periferic (testul NBT), este influen- até negativ de administrarea celor trei colo- ranti (fig. 4), in sensul scaderii semnifi- cative statistic (p<0,001) a capacitatii de fagocitozi a acestora, comparativ cu Jotul martor. in urma compardrii loturilor carora li s-a administrat coloranti, se constati dife renje semnificative statistic Albastru/Rosu si Rosu/Grena (p<0,001) Capacitatea opsonicé a serului (CO) Rezultatele objinute sunt redate in fig. 5 din care rezultd urmatoarele : toyi colorantii determina o scddere semnificativa statistic a CO comparativ cu lotul martor (p< 0,001) Compardnd cei trei coloranti, activitatea se exprima astfel: albastru > rosu > grena (fig. 5) Capacitatea de fagocitozd a macrofage- lor peritoneale (CF) a scizut considerabil in urma administrarii colorantilor testati, comparativ cu valorile acestui parametru la soarecii c&rora li s-a administrat topic mar- torul DMSO. Se constaté cd cea mai mare 285C.C. Gavat et al. . 3. Formula leucocitara mata — | Ros ucrena B% somo | mAlbasiru Ros | crena Fig. 4. Testul NBT (%) 2000.09 -—— 1600.00 | 1400.09 - £00.00 «00.00 + 0.00 + co Capacitatea opsonicd a serului (colonii de S.aureus x 1/1000 mL) scidere a CF este determinat’ dupa apli- carea topic a colorantului grena, iar cea mai redus& se objine dup’ aplicarea coloran. tului albastru: grena > rosu > albastru (p< 0,001) Capacitatea bactericidé a macrofagelor peritoneale (CB) s-a modificat in acelasi sens cu ceilalti doi indicatori (CO si CF), comportamentul colorantilor find: grena > rosu > albastru Referitor la alte tehnici utilizate, cum este determinarea limfocitelor T-splenice cu 286 oomso mAlbastrs mRosu sorena capacitate de rozetare si determinarea sple nocitelor formatoare de plaje de hemoloza (plaje Jerne), nu s-au constatat modificari semnificative statistic intre loturile tratate cu colorangi si lotul martor. CONCLUZI Dupa aplicarea topica timp de 14 zile a colorantilor studiati, se constaté urmatoarele efecte sistemice de tip imuno-modulator * colorangii albastru si rosu determina atat scdiderea numérului cat si a functiei fagoStudiu experimental pe soareci Swiss privind modul de reactie a sistemului imunitar citare a PMN din sangele periferic, pe colorantul albastru ; cand colorantul grena influenteazd in © cei trei coloranti nu influenteaz’ sem- sens negativ numai functia fagocitar’ a —_—nificativ. statistic parametrii imunitaqii PMN; cel mai activ asupra celor doi para- _—_specifice testati (Ly T splenice cu capa- metrii s-a dovedit a fi colorantul rou ; citate de rozetare si splenocitele forma- * colorantul rosu s-a dovedit a avea cel toare de plaje de: hemoliza) ; mai puternic efect asupra Ly, urmat de * colorantul rogu desi nu influenteaz% sem- colorantul albastru ; nificativ statistic masa ganglionilor cer- * cozinofilele din sangele periferic nu sunt _cetafi, determina efecte sistemice impor- influenjate de nici unul din cei trei colo- _tante asupra componentelor imunitare rangi, in schimb colorantul rosu produ- __nespecifice ; ce o bazofilie crescuta, fiind urmat de * colorangii grena si albastru influenteaza colorantul albastru ; masa ganglionilor retro-auriculari si mai * cei trei coloranti testati determina scde- usin a celor latero-cervicali (situati de rea semnificativ’ a capacit&tii opsonice aceiasi parte cu locul administrarii), iar a serului, a capacit&ti de fagocitoza si colorantul grena determina efecte siste- bactericid’ a macrofagelor peritoneale ; mice importante asupra componentelor cel mai puternic efect este manifestat de _imunitare nespecifice testate, in timp ce colorantul grena, iar cel mai redus, de colorantul albastru exercita o influenta redusi asupra acestor parametri, BIBLIOGRAFIE 1. Ahmed AI. Reactive dyes development. A review. Textile Dyer & Printer 1995; 28: 16, 19-24 2. Taylor JA, Pasha K, Phillips DAS. The dyeing of cotton with heterobifunctional reactive dyes containing both a monochlorotriazinyl and a chloroacetylamino reactive groups. Dyes and Pigments 2001 ; $1 (2-3): 145-152. 3. Kanetkar VR, Shankarling GS, Patel S. Recent developments in reactive dyes. Part 1: Introduction and bifunctional reactive dyes. Colowrage 2000; 47 (3): 35-46. 4. Klemola K, Honkalampi-Hamildinen U, Liesivuori J, Pearson J, Lindstrom-Seppa P. Evaluating the toxicity of reactive dyes and fabrics with the spermatozoa motility inhibition test. AUTEX Res J 2006; 6 (3): 182-190. 5 Peacock IE, Thomas D, Russel H. Manual of Laboratory Immunology. Philadelphia: Publishing House Lea and Febiger, 1980, 224-226. 6. Shortmann JK, Palmer J. The requirement for macrophages in the in vitro immune response. Cell Immunol 1971 ; 2: 399-403. 287