This file has been cleaned of potential threats.

If you confirm that the file is coming from a trusted source, you can send the following SHA-256
hash value to your admin for the original file.

2f1ff99978b1fb2e77f7b165ec80f20b6dcf743bc5189e3d279acf3da66b21aa

To view the reconstructed contents, please SCROLL DOWN to next page.

ILEANA CONSTANTINESCU

IMUNOLOGIA
TRANSPLANTULUI

Editura Universitară ”Carol Davila”

București, 2021
 CUPRINS

PREFAȚĂ ............................................................................................................................. 5

Glosar de termeni - Imunologia transplantului ....................................................................7

COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE...............................................................13

Organizarea genelor antigenelor leucocitare umane (HLA) în complexul major de

histocompatibilitate (MHC) .................................................................................................13

Structura moleculelor HLA ...................................................................................................16

Tiparea HLA prin metode serologice ...................................................................................22

Tiparea HLA prin metode de biologie moleculară ..............................................................26

Genotiparea HLA SSOP.........................................................................................................30

Genotiparea HLA SSP ...........................................................................................................32

Tipizarea HLA bazată pe secvenţiere (SBT) .........................................................................33

Tehnologia Microarray.........................................................................................................35

Limitele metodelor de biologie moleculară ........................................................................43

EVALUAREA IMUNOLOGICĂ ÎN TRANSPLANTUL RENAL ....................................................46

Evaluarea anticorpilor anti HLA ...........................................................................................49

Screening-ul anticorpilor anti HLA prin metoda Luminex...................................................53

Anticorpii anti HLA ...............................................................................................................55

Testul de screening al anticorpilor anti HLA........................................................................55

Sindroame mediate de anticorpi .........................................................................................56

Rolul anticorpilor în rejetul acut..........................................................................................57

Rolul anticorpilor în rejetul cronic şi glomerulopatia de transplant ..................................58

Importanţa anticorpilor anti donori circulanți ....................................................................59

Testul crossmatch ................................................................................................................60

Crossmatch prin tehnica ELISA pentru celula T şi B ............................................................63

Crossmatch prin metoda flowcitometriei ..........................................................................64

Crossmatching prin tehnologia Luminex .............................................................................65

Algoritmul evaluării imunologice în transplantul renal cu donator viu .............................67

Algoritmul evaluării imunologice în transplantul renal cu donator cadavru .....................68

Alegerea unui donator viu versus donator cadavru pentru transplantul renal .................69

Efectul sursei donatorului asupra supravieţuirii alogrefei .................................................70

Efectele potrivirii HLA asupra supravieţuirii alogrefei renale provenite de la un donator viu
..............................................................................................................................................71

Matching-ul imunologic: conceptul de matching în transplantul renal ............................71

Transplanturile renale ABO incompatibile ..........................................................................73

Provocari ale imunologiei transplantului renal la copil ......................................................75

Potrivirea între donator și primitor .....................................................................................75

Potrivirea grupelor de sânge ...............................................................................................80

Terapia imunosupresoare în transplantul renal la copii .....................................................84

EVALUAREA IMUNOLOGICĂ ÎN TRANSPLANTUL HEPATIC ..................................................85

Compatibilitatea donator – primitor în transplantul hepatic .............................................87

Boala acută de grefă contra gazdă (GVHD) în transplantul hepatic ...................................88

Monitorizarea pacientului posttransplant hepatic .............................................................89

EVALUAREA IMUNOLOGICĂ ÎN TRANSPLANTUL MEDULAR ...............................................93

Genele KIR și transplantul de celule stem hematopoetice .................................................96

Imunogenetica non-HLA și transplantul de celule stem hematopoetice ...........................98

Incompatibilitatea ABO și suportul transfuzional ...............................................................99

Reconstituirea sistemului imun după transplantul de celule stem hematopoetice .........100

BIBLIOGRAFIE.......................................................................................................................112
 PREFAȚĂ

Cuvânt către ucenic:

Cunoașterea cere sacrificiu.
Întelegerea cere răbdare.

Imunologia transplantului este o specialitate dinamică caracterizată

prin frumusețea abordării noilor tehnologii de biologie moleculară, prin
semnificația clinică rezultatelor și impactul acestora asupra evoluției
transplantului.
Atât genotiparea alelelor HLA cât și detecția și identificarea
anticorpilor anti HLA sunt investigații imunologice de transplant care au
nevoie de o interpretare extrem de laborioasă, iar expertiza imunologului este
extrem de importantă în transplantul renal, medular, cardiac, hepatic,
pulmonar, pancreatic, etc.
Alături de investigațiile imunologice pretransplant sunt foarte
importante și evaluările posttransplant care urmăresc posibila apariție a
rejetului subclinic, apariția neoplaziilor sau a altor complicații imunologice
legate de regimurile imunosupresoare, care sunt decisive în ceea ce privește
supravietuirea pe termen lung a pacienților transplantați.
Centrul de Imunogenetică și Virusologie Fundeni, a fost înfințat în anul
2000 și are ca domeniu de activitate imunologia transplantului, imunologia
tumorală, diagnosticul virusologic, biologia moleculară a cancerului și a
bolilor inflamatorii. Acest centru, este centru de referință metodologic în
imunologia transplantului pentru România din anul 2006, în același an
obținând și acreditarea cu Federația Europeană de Imunogenetică (EFI). Seria
acreditărilor a fost completată de acreditarea ISO realizată în anul 2009. Prin
intermediul Centrului de Imunogenetică și Virusologie Fundeni, s-au organizat
numeroase congrese, workshop-uri interne și internaționale, simpozioane,
cursuri pentru toate centrele de imunogenetică din țară și pentru comunitatea
de transplant din Europa.

5
 Prin realizările profesionale, centrul nostru, care este și primul centru
de biologie moleculară în imunologia de transplant din România, are o
activitate susținută in toate tipurile de transplant care se efectuează la noi în
țară, monitorizând anual peste 1000 de pacienți care au efectuat un transplant
de organ solid sau celule stem.
Avem speranța că această monografie va fi utilă tuturor studentilor si
rezidenților care doresc să aprofundeze aspectele imunologiei de transplant, de
cercetare stiintifica sau de practică clinică în domeniul transplantologiei și să
reprezinte o lucrare de referință pentru colegii noștrii imunologi la nivel
national.

Noiembrie, 2021
Prof. Dr. Ileana Constantinescu
Șeful Disciplinei Imunologie și Imunologia Transplantului, UMF “CAROL
DAVILA”, București
Șeful Centrului de Imunogenetică și Virusologie, Institutul Clinic Fundeni

6
 GLOSAR DE TERMENI - IMUNOLOGIA TRANSPLANTULUI

Alelă: variantă a unei gene într-un locus genetic particular. Cele două alele, de
pe cei doi cromozomi omologi, pot fi identice, şi individul este homozigot sau
diferite şi el este heterozigot.
Alogrefă: este tipul cel mai răspandit de grefă şi se referă la situaţia în care un
organ se transplantează unui individ aparţinând aceleiaşi specii, dar diferit
genetic.
Aloreactivitate: descrie stimularea celulelor T de către moleculele MHC, altele
decât cele proprii; marchează recunoaşterea moleculelor MHC alogenice. Astfel
de răspunsuri sunt numite aloreacţii.
Anticorp: este o proteină care se leagă specific la o substanţă particulară,
antigenul corespunzător. Fiecare moleculă de anticorp are o structură unică care
îi permite să se lege specific la antigenul său corespunzător, dar toţi anticorpii
au aceeşi structură şi sunt cunoscuţi ca imunoglobuline sau Ig-uri. Anticorpii
sunt produşi de celulele plasmatice ca răspuns faţă de infecţie sau imunizare,
legându-se la patogeni, neutralizându-i şi îi pregăteşte pentru distrugere de către
fagocite.
Anticorpi citotoxici: anticorpi anti-HLA
Antigen: orice moleculă care se leagă specific de un anticorp. Numele lor
provine de la abilitatea acestora de a genera anticorpi. Nu toate antigenele sunt
capabile să stimuleze producţia de anticorpi; antigenele care induc producţia de
anticorpi sunt denumite imunogene.
ASHI: Societatea Americană de Histocompatibilitate şi Imunogenetică.
Autogrefă: când un organ se transplantează aceluiaşi individ, dar în altă parte a
organismului.
CD: Clusters of differentiation, sunt grupuri de anticorpi monoclonali care
identifică aceeaşi moleculă de la suprafaţa celulară. Molecula de la suprafaţa
celulei este desemnată CD urmat de un numar (de exemplu: CD1, CD2 etc).
Celulele prezentatoare de antigen: sunt celule înalt specializate care pot
procesa antigene ale căror fragmente peptidice le proiectează pe suprafaţa
celulară împreună cu moleculele necesare activării celulelor T. Principalele
celule prezentatoare de antigen pentru celulele T sunt celulele dendritice,
macrofagele şi celulele B.

7
Celulele T CD4 (helper): aceste celule ajută celulele B pentru a produce
anticorpi ca răspuns la stimularea antigenică. Cele mai eficiente celule T helper
sunt cunoscute ca celule TH2, care produc citokinele IL4 şi IL5. Celulele CD4
sunt importante pentru recunoaşterea peptidelor antigenice legate la moleculele
MHC de clasa a II-a. Acţionează ca şi co-receptori prin legarea la partea laterală
a moleculelor MHC de clasa aII-a.
Celulele T CD8: sunt celule T care poartă co-receptorul CD8. Aceste celule
recunosc antigenele, de exemplu antigenele virale, care sunt sintetizate în
citoplasma celulei. Peptidele derivate din aceste antigene sunt transportate de
către TAP, asamblate cu molecule MHC de clasa I în reticulul endoplasmatic şi
expuse ca complexe peptide MHC de clasa I pe suprafaţa celulară. Celulele T
CD8 se diferenţiază în celule T CD8 citotoxice.
Centimorgan: unitate de măsură a distanţei dintre două locusuri în linkage,
stabilită prin frecvenţa recombinărilor între locusuri. Este egal cu o frecvenţă de
recombinare de 1% între locusuri. Are simbolul cM. Unitate de recombinare.
Centromer: punct de unire a cromatidelor. La om secvenţele centromerice sunt
diferite.
Chimera: coexistenţa la nivelul unui singur individ sau la nivelul ţesuturilor
sau celulelor a două genotipuri diferite. De exemplu, primitorul unui transplant
de maduvă de la un individ genetic diferit are celulele sanguine de origine ale
donatorului ca şi celulele autologe. Termenul provine din mitologia greacă,
reflectând un monstru cu un cap de leu, un corp de capră şi coada unui dragon.
Citokine: polipetide secretate care afectează funcţia altor celule. Citokinele
sunt importante pentru interacţiunile celulare din cadrul răspunsului imun.
Citokinele produse de fagocitele mononucleare se numesc monokine; cele
produse de limfocite se numesc limfokine.
Cod genetic: triplete de baze din ADN şi ARN care poartă informaţia genetică,
necesară sintezei proteinelor. Este un veritabil dicţionar care permite trecerea de
la un grup de 3 nucleotide (triplet sau codon) la un aminoacid specific.
Codon: secvenţe a trei nucleotide mARN, care codifică un aminoacid specific.
Codon ambiguu: care codifică mai mulţi aminoacizi cu sens greşit (missens)şi
care în urma unei mutaţii devine un codon terminator al sintezei lanţului
polipeptidic.
Codon iniţiator: unul dintre cei 2 codoni AUG sau GUG care marchează
începutul sintezei proteice.
Codoni sinonimi: care codifică acelaşi aminoacid.
Codoni terminatori: care anunţă terminarea sintezei proteinelor. Când
ribozomii ajung în dreptul lor, sinteza se opreşte şi lanţul polipeptidic este
eliminat.

8
Conversie genică: înlocuire a materialului genetic de pe un sit particular al unei
cromatide, de către materialul genetic situat pe un punct exact corespunzător, de
pe o cromatidă ne-soră; este o formă particulară de recombinare, care explică
apariţia unor anomalii de segregări.
CREGs: Cross reactive groups (grupuri care reacţionează încrucişat) epitopi
publici care sunt responsabili pentru crossreactivitatea serologică bine
cunoscută care este observată între aloantiserurile HLA. Modelul
crossreactivităţii serologice a antiserurilor HLA au fost utilizate pentru a
categorisi genele HLA de clasa I în grupuri majore crossreactive sau CREGs.
Baza moleculară a crossreactivităţii serologice este existenţa concomitentă,
diferenţiată a epitopilor publici la nivelul mai multor gene HLA.
Cromatină: complexul de ADN, histone, proteine nehistonice şi puţin ARN
care compune cromozomul.
Cromozom: purtătorul informaţiei genetice.
Crossing-over: încrucişare, schimb de material genetic între cromatidele
cromozomilor omologi.
Crossmatch: test care evidenţiază anticorpi direcţionaţi faţă de antigenele HLA
prezente la nivelul limfocitelor T ale donatorului (clasa I) sau la nivelul
limfocitelor B ale donatorului (clasa a II-a) implicate în răspunsul imun; prin
acest test se previne fenomenul de rejet în transplantul renal.
EFI: Federaţia Europeană de Imunogenetică
ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, este un test serologic în care un
antigen sau un anticorp legat este detectat utilizând anticorpi cuplaţi cu o
enzimă care converteşte un substrat incolor într-un produs colorat. Testul
ELISA este larg folosit în biologie şi medicina ca şi în imunologie.
Epitop: determinant antigenic definit
Epitop privat: iniţial, un epitop privat a fost considerat a fi unic la nivelul unui
singur produs genetic alelic. Astăzi prin epitop privat înţelegem epitopii care se
află la nivelul unui grup limitat sau familii de alele strâns înrudite, cum sunt
alelele A2 (A*0201-0229), sau alelele B39 (B*39 01011-*3915). Epitop de
grup este un termen şi mai adecvat pentru a descrie acest tip de epitop şi poate
fi interschimbat cu termenul de “privat”.
Epitopi publici: există concomitent, diferenţiat între conglomeratele de gene HLA
care în mod normal aparţin la grupuri diferite de gene, strâns înrudite, de exemplu,
existenţa concomitentă a epitopului public între A2 şi moleculele B57 sau 58.
Exon: secvenţă de nucleotide care codifică o secvenţă de aminoacizi specifici.
În medie, ei sunt constituiţi din 100-300 de nucleotide. O genă este, astfel
constituită din mai mulţi exoni separaţi prin introni, iar fiecare exon poate fi
considerat un modul al unei proteine.

9
Expresie genică: manifestare fenotipică a unei gene specifice; este condiţionată
de natura genei, dominantă sau recesivă, de interacţiunea cu alte gene, condiţiile
de mediu, penetranţă şi expresivitate.
Fenotip: caracteristicile detectate ale unei celule sau organism; rezultă din
interacţiunile genotipului cu mediul.
Genă: informaţia nucleotidă care asigură sinteza unei secvenţe de aminoacizi şi
care ocupă un locus specific.
Genom: set haploid de cromozomi. Totalitate a variantelor genetice de pe un
locus dat. Dacă pe un locus se găsesc n alele, atunci pot exista n homozigoţi şi
n(n-1)/2 heterozigoţi. Numărul total al genotipurilor de pe acelaşi locus este
egal cu n(n+1)/2. Genomul uman conţine 6,4 x 10-10 g ADN, echivalentul a
5800 de milioane de baze, în timp ce al Escherichia Coli are numai 4 milioane.
Nucleul diploid uman include 6 milioane de gene.
Genotip: constituţia genetică a unui organism.
Haplotip: setul de alele HLA găsit pe un cromozom.
Histocompatibilitate: identitate la nivelul moleculelor de histocompatibilitate
de clasa I şi clasa a II-a. Termenul este folosit în sens operaţional însemnând
similaritate suficientă între moleculele HLA ale donatorului şi primitorului, în
transplantul de organe.
HLA: antigene leucocitare umane sau “leucocite de histocompatibilitate”.
Imunogenetică: ramura a geneticii care studiază complexitatea proceselor ce
asigură apărarea şi integritatea organismului, în ipoteza în care în organism
pătrund antigene străine; controlul genetic al imunoglobulinelor, deficienţele
condiţionate genetic, răspunsul imun, imunitatea celulară etc, variabilitatea
genelor implicate în acest proces (ABO, Rh, HLA) precum şi tulburările
autoimune; imunogenetica a descoperit complexul major de
histocompatibilitate, a reuşit să cartografieze regiunea cromozomială 6 pe care
este situat acest sistem, a elucidat structura anticorpilor (imunoglobulinelor), a
explicat fenomenele de compatibilitate şi incompatibilitate, a precizat existenţa
asociaţiilor dintre genele sistemului HLA şi diverse tulburări.
Interleukinele: sunt citokine secretate în principal de celulele mononucleare
(limfocitele şi fagocitele mononucleare) care induc creşterea şi diferenţierea
limfocitelor şi a celulelor stem hematopoietice pluripotente.
Intron: secvenţă de 100-1000 nucleotide situată în afara sau în interiorul genei
care separă exonii (secvenţele de nucleotide ADN care sunt transcrise) şi sunt
prezente în mARN. Toţi intronii studiaţi până acum încep cu secvenţe GT şi se
termină cu secvenţele AG. Uneori, secvenţele de început şi de sfârşit se repetă
de numeroase ori. Intronii coordonează sinteza proteinelor şi diminuează
frecvenţa mutaţiilor survenite în cursul recombinării.

10
Izogrefă: când un organ se transplantează între indivizi ai aceleiaşi specii, cu
configuraţie antigenică identică (gemeni monozigoţi).
Linkage: asociere a două sau mai multe gene nealele în aşa fel încât se transmit
ca o singură unitate dacă nu intervine fenomenul de crossing-over.
Linkage disequilibrium : legătură dezechilibrată – tendinţă a unor alele situate
pe locusuri diferite de a apărea împreună pe acelaşi cromozom sau haplotip,
într-o secvenţă mai mare decât cea aşteptată teoretic.
MHC: complexul major de histocompatibilitate: regiune cromozomială formată
din locusurile care au rol fundamental în procesele imune. La om MHC este
sistemul HLA, omolog cu complexul H2, la şoarece.
Microarray: tehnologie cu microcipuri, care are ca principiu de bază
hibridizarea complementară a secvenţelor simplu spiralate ale acizilor nucleici.
În genetica cancerului, ADN microarray este creată prin plasarea diferitelor
ADN-uri pe un mic fragment al unui microcip, folosindu-le apoi, pentru a
evalua expresia ARN în celulele normale sau maligne.
Mutaţie: modificare permanentă şi transmisibilă a structurii şi implicit a
funcţiei unei gene. De obicei, termenul de mutaţie se referă la o singură genă.
Prin lărgirea conceptului, în categoria mutaţiilor au fost incluse modificările
numerice şi structurale ale cromozomilor, precum şi modificările numerice ale
genomului (poliploidia).
Neopterina: pteridină serică secretată de macrofag; valorile serice crescute ale
neopterinei reprezintă expresia activării răspunsului imun celular.
Polimorfism: înseamnă existenţa într-o varietate de forme diferite.
Polimorfismul genetic este variabilitatea de la nivelul locusului genei în care se
produc variante genice la o frecvenţă mai mare de 1%. Complexul major de
histocompatibilitate (MHC) este cel mai polimorf conglomerat de gene
cunoscut la om.
Prezentarea antigenică: descrie antigenul ca fragmente peptidice legate la
moleculele MHC pe suprafaţa unei celule. Celulele T recunosc antigenul când
este prezentat în acest fel.
Procesarea antigenică: este degradarea proteinelor în peptide care se pot lega
la moleculele MHC pentru prezentare la celulele T. Toate antigenele, cu
excepţia peptidelor, trebuie să fie procesate în peptide înainte de a putea fi
prezentate de către moleculele MHC.
Rejetul grefei: reacţie imunologică direcţionată faţă de moleculele de
histocompatibilitate din grefă care conduce la eliminarea sau rejetul grefei.
RT-PCR: reacţie de amplificare genică folosită pentru a amplifica secvenţele
ARN. Enzima revers-transcriptaza (RT) este folosită pentru a converti secvenţa
ARN într-o secvenţă de ADN complementar (cADN), care este apoi amplificată
prin PCR.

11
Segregare: separare a cromozomilor omologi în meioză, implicit, separarea şi
migrarea în gameţi diferiţi a celor 2 membri ai oricărei perechi de alele. În acest
fel se disociază şi caracterele materne şi paterne. Este prima lege a lui Mendel,
legea segregării genelor.
Sistemul complement: este un set de proteine plasmatice care reacţionează
împreună pentru a ataca formele extracelulare ale patogenilor.
Sistemul grupelor sanguine ABO: antigene care sunt exprimate pe eritocite.
Ele sunt folosite pentru tipizarea sângelui uman pentru transfuzii. Indivizii care
nu exprimă antigenele A sau B pe eritrocitele lor, în mod natural formează
anticorpi care interacţionează cu acestea.
Sit: “pozitie”, “localizare”; 1. Cea mai mică unitate a unei gene care poate
suferi o mutaţie. 2. Secvenţă de nucleotide recunoscută specific de anumite
proteine.
Tapasin (TAP – associated protein): este o moleculă cheie în asamblarea
moleculelor MHC de clasa I; o celulă deficientă în această proteină are numai
molecule MHC de clasa I instabile pe suprafaţa celulară. TAP1 şi TAP2
(“transporters associated with antigen processing”) sunt proteine – casetă care
leagă ATP, implicate în transportul peptidelor scurte din citosol în lumenul
reticulului endoplasmatic, unde se asociează cu moleculele MHC de clasa I.
TCR (“T-cell receptor”): receptorul celulei T este al lanţurilor înalt variabile
şi heterodimer legate disulfidic, exprimate de membrana celulară ca un complex
cu lanţurile CD3 permanente. Celulele T care poartă acest tip de receptor
frecvent denumite celule T.
Telomer: cromomer terminal situat la extremităţile cromozomilor care au rolul
de a împiedica fuziunea cromozomilor intacţi.
Xenogrefa: este transplantul de organe între specii diferite (de exemplu: de la
porc sau de la babuin la om).

12
 COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE

Ileana Constantinescu

ORGANIZAREA GENELOR ANTIGENELOR LEUCOCITARE UMANE (HLA) ÎN

COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE (MHC)

Complexul HLA ocupă un segment de 1,5-2 centiMorgani pe braţul

scurt al cromozomului 6 şi conţine gene care codifică moleculele de
histocompatibilitate de clasa I, având 2000 kilobaze (HLA–A, HLA–B, HLA–
C), moleculele de histocompatibilitate de clasa II, de aproximativ 1000 kilobaze
(HLA–DRB1, HLA–DQB1, HLA–DQA1, HLA–DPB1), moleculele de clasa a
treia, de aproximativ 1000 kilobaze (C2, C4, factorul B, citocromul P-450, 21-
hidroxilaza) [2].
Genele care codifică aloantigenele HLA de clasa I şi clasa a II-a sunt
apropiate unele faţă de altele la nivelul braţului scurt al cromozomului uman 6.
Această parte a genomului constituie sistemul major de histocompatibilitate
(MHC) şi este denumit complexul HLA [4,28].
Moleculele HLA de clasa I sunt exprimate la nivelul tuturor celulelor
nucleate şi al plăcuţelor sanguine, pe când moleculele HLA de clasa a II-a se
găsesc la nivelul celulelor prezentatoare de antigen, cum sunt celulele
dendritice, limfocitele B şi macrofagele [30]. Rolul fundamental al moleculelor
de clasa I şi clasa a II-a este de a se lega la peptide proprii şi peptide non-
proprii, pe care apoi le transportă la membrana plasmatică a celulelor pentru
fenomenul de recunoaştere de către receptorul pentru antigen al celulei T [15].
Astfel, prezentarea peptidelor virale şi bacteriene de către moleculele de
clasa I şi clasa a II-a antigenelor receptorilor pentru antigen ai celulelor T,
conduce la un răspuns imun.
Moleculele HLA de clasa I leagă peptide formate din 8 - 10 aminoacizi,
peptide ce rezultă din degradarea proteosomică a proteinelor citoplasmatice şi
prezintă aceste peptide limfocitelor T citotoxice, CD8+. Astfel, moleculele de
clasa I sunt primele care alertează celulele T faţă de celulele infectate viral.
Moleculele HLA de clasa a II-a leagă peptide formate din 13-25 de
aminoacizi, care rezultă din degradarea endosomală a proteinelor exogene şi

13
endogene şi prezintă aceste peptide limfocitelor T helper, CD4+. Moleculele de
clasa a II-a joacă un rol important în stimularea răspunsului imun faţă de
organisme cum sunt bacteriile piogene. Activarea celulelor T CD8+ şi CD4+
prin aceste două căi duce la diviziune celulară şi diferenţiere, rezultând un
răspuns imun celular şi respectiv umoral [15].
Complexul HLA conţine aproximativ 4.000.000 de perechi de baze de
ADN şi este de dimensiune comparabilă cu genomul bacteriei Escherichia coli.
În interiorul complexului HLA se disting trei regiuni (Fig. 1).

Fig. 1. Harta simplificată a complexului HLA.

Gruparea complexului HLA în regiunile de clasa I, a II-a şi a III-a

În regiunile de clasa I şi a II-a sunt redate poziţiile relative ale genelor

codificând izotipurile funcţionale ale HLA clasa I şi clasa a II-a. La nivelul
regiunii clasei a III-a se observă poziţia relativă a genelor care codifică
componentele complementului C2, C4 şi factorul B. Toate aceste trei regiuni
conţin şi alte gene.
În apropierea centromerului cromozomului 6, există regiunea clasei a II-a
care conţine genele de clasa a II-a; pe când în apropierea telomerului, braţului scurt
al cromozomului 6, există regiunea clasei I care conţine genele de clasa I [21].
Între regiunile clasei I şi a II-a este situată regiunea clasei a III-a.
Această regiune conţine o varietate de proteine diferite care codifică
componentele complementului C4, C2 şi FACTORUL B. Atât regiunea clasei I
cât şi regiunea clasei a II-a conţin şi alte gene decât cele ale clasei I sau clasei a
II-a care sunt neînrudite structural cu acestea. Genele care dau denumirea
oficială a HLA sunt cele din interiorul complexului HLA care codifică
aloantigenele de clasa I şi clasa a II-a, gene şi pseudogene.
Principalele gene de clasa I codifică lanţurile grele denumite şi lanţurile
alfa ale celor 6 forme de clasa I , HLA-A, -B, -C, -E, -F şi -G. În completare
mai există şi HLA-H, -J, -K şi -L care sunt pseudogene nefuncţionale strâns
înrudite din punct de vedere al secvenţei nucleotidice cu genele funcţionale de
clasa I (Fig. 2)

14
 Fig. 2. Harta regiunii HLA clasa I

Această figură ilustrează genele HLA-H, -J, -K şi -L care sunt gene

complete de clasa I neexprimate, respectiv pseudogene. Familia de gene MIC
conţine 5 gene între care genele MICA şi MICB sunt exprimate, iar MICC,
MICD şi MICE sunt pseudogene. Genele nedenumite (barele verticale scurte)
sunt fragmente de gene de clasa I. HFE este o genă funcţională, asemănătoare
clasei I, la ~4 Mb telomeric de HLA-F.

În completarea genelor cunoscute din această figură mai există încă ~50
de gene care sunt răspândite printre genele clasei I şi care nu sunt înrudite
structural cu acestea. În populaţia umană toţi cromozomii 6 poartă cele 6 gene
HLA de clasa I. În contrast cu acest fapt, anumiţi cromozomi 6 au deleţii de ~50
kb în regiunea clasei I care include şi pseudogena HLA-H [21].

Gena care codifică β2 microglobulina, lanţul uşor al moleculelor HLA

de clasa I, nu este situat în complexul HLA ci pe cromozomul uman 15. Din
cauza acestei localizări cromozomiale gena β2 microglobulinei nu are o
denumire în nomenclatura HLA.

Moleculele HLA de clasa a II-a sunt heterodimeri compuşi din lanţuri α

şi β de dimensiuni similare. Există 5 izotipuri ale proteinelor HLA de clasa a II-
a care sunt denumite HLA-DM, -DO, -DP, -DQ şi -DR.

Genele pentru lanţurile α şi β sunt localizate în regiunea HLA de clasa a

II-a şi cele mai multe dintre acestea sunt organizate în perechi de lanţuri α şi β
genice care contribuie la acelaşi izotip (Fig. 3).

15
 Fig. 3. Harta regiunii HLA de clasa a II-a

Sunt ilustrate 3 tipuri de categorii de gene: gene care codifică lanţurile α

şi β ale moleculelor HLA de clasa a II-a, pseudogene înrudite cu genele
lanţurilor α şi β şi genele care codifică alte funcţii implicate în procesarea şi
prezentarea antigenelor de către HLA de clasa I. De asemenea, sunt menţionate
genele LMP2 şi LMP7 care codifică subunităţi ale proteozomei, genele TAP1
şi TAP2 care codifică un peptid transportor şi gena tapasinei care facilitează
eliberarea peptidelor din TAP la nivelul moleculelor de clasa I.

Genele care codifică lanţurile α sunt denumite A (DMA şi DOA) iar

genele ce codifică lanţurile genelor β sunt denumite B (DMB şi DOB). Aceste
gene care codifică HLA-DQ α şi β sunt HLA-DQA1 şi respectiv HLA-DQB1.
Partea din regiunea HLA de clasa II care codifică moleculele HLA-DR este mai
complicată deoarece are câteva gene funcţionale de lanţ β precum şi
pseudogene, numărul lor variind între diferiţi cromozomi 6 [21]. Diferitele
aranjamente pentru genele lanţului β sunt denumite haplotipuri DRB.

STRUCTURA MOLECULELOR HLA

Structura moleculelor HLA de clasa I

Moleculele HLA de clasa I conţin fiecare o copie a două polipeptide şi

anume: un lanţ greu, glicoproteină de ~45kDa care este ancorată la membrană,
şi un lanţ uşor, solubil în apă, de 12kDa (Fig. 4).

16
 Fig. 4. Structura schematică a moleculei HLA de clasa I

Genele care codifică lanţurile grele HLA de clasa I au o structură caracteristică

în care diferite domenii proteice sunt codificate de exoni separaţi.
În total, exonii genelor lanţurilor grele de clasa I conţin 1089-1101
nucleotide (incluzând codonul terminator) şi codifică lanţuri grele de 362-366
reziduri de aminoacizi. (Fig. 5)

Fig. 5. Organizarea exon-intron a unei gene HLA de clasa I

La nivelul lanţului greu de clasa I, fiecare domeniu proteic este codificat

de exoni diferiţi. L codifică secvenţa conducătoare, TM codifică regiunea trans-
membranară, CYT codifică coada citoplasmatică şi 3’UT este regiunea 3’
netradusă.

17
 Diferenţe mici în lungimea lanţurilor grele de clasa I din diferite alele
sau locusuri, provin din inserţii şi deleţii în regiunea transmembranară şi din
modificări de lungime ale cozii citoplasmatice datorită plasării diferenţiale a
codonului terminator în interiorul exonilor 6, 7 sau 8.
Polimorfismul antigenic al moleculelor HLA-A, B şi C este datorat
diferenţelor în secvenţele de aminoacizi ale lanţulului greu al HLA de clasa I.
Cele mai multe dintre aceste diferenţe apar prin substituţii nucleotidice
la nivelul exonilor 2 şi 3. Genele lanţului greu al HLA- A, B şi C sunt foarte
polimorfe în contrast cu genele lanţului greu al HLA-E şi G, ce dezvoltă un
polimorfism limitat denumit oligomorfism. Pentru HLA-F, o singură alelă este
recunoscută în prezent şi de aceea gena este considerată a fi monomorfă.

Structura moleculelor HLA de clasa a II-a

Moleculele HLA de clasa a II-a conţin fiecare o copie a unui lant α şi

β, amândouă fiind ancorate la membrană (Fig. 6).

Fig. 6. Structura schematică a moleculelor HLA de clasa II

18
 Lanţurile α şi β prezintă fiecare două domenii extracelulare, o regiune
trans-membranară şi o coadă citoplasmatică. Domeniile extracelulare ale
lanţului α sunt α 1 şi α 2 , iar cele ale lanţului β sunt β 1 şi β 2.
Lanţurile α au 33-35 kDa, iar lanţurile β au 26-28 kDa, diferenţele în
dimensiuni datorându-se în principal glicozilării. Organizarea exon – intron a
genelor de clasa a II-a este asemănătoare genelor de clasa I, astfel exonii
codifică domenii separate ale proteinelor [29].
Genele lanţurilor α şi β au structură similară în care exonul 1 codifică
peptidul conducător şi exonii 2 şi 3 codifică cele două domenii extracelulare.
La nivelul genelor lanţului α exonul 4 codifică domeniul
transmembranar şi exonul 5 codifică coada citoplasmatică. Prin contrast, la
nivelul genelor lanţului β, atât regiunea transmembranară cât şi coada
citoplasmatică sunt codificate de exonul 4 (Fig.7).

Fig. 7. Organizarea exon intron a genelor codificând lanţurile α şi β

ale moleculelor HLA de clasa a II-a
Legendă: L - secvenţa conducătoare; TM - regiunea transmembranară;
CYT - coada citoplasmatică; 3’UT - regiunea 3’ netradusă.

Polimorfismul moleculelor HLA de clasa a II-a poate deriva atât de la

nivelul lanţurilor α cât şi de la nivelul lanţurilor β, dar acest lucru depinde de
izoforma clasei a II-a. Pentru HLA-DR, lanţul α este monomorf şi toate
polimorfismele derivă din genele lanţurilor β. Componentul cel mai polimorf al
genelor de clasa a II-a este HLA-DRB1 pentru care sunt definite 221 de alele [21].
Pentru HLA-DQ şi DP atât lanţurile α şi β contribuie la polimorfism, iar
genele corespunzătoare sunt foarte polimorfe. În contrast, izoformele HLA-DM
şi HLA-DO sunt puţin polimorfe.

19
Emergenţa de noi alele
Microvariaţii la nivelul serotipurilor şi crearea de noi alele care sunt
chimere a două serotipuri distincte pot fi fenomene relativ dinamice.
Alelele noi emerg cu o rată înaltă şi devin fixate în populaţie, în teorie, dacă au
un avantaj selectiv în prezentarea peptidelor provenite de la organisme
infecţioase.
Alelele noi sunt generate via mutaţii punctiforme, recombinări şi
evenimente asemănătoare conversiei genice [3].

Fig. 8. Nomenclatura specificităţilor HLA

Prefixul HLA precede antigenele sau alelele pentru a defini MHC-ul

speciei. Denumirile A, B, C, DR etc, definesc locusul. Acesta este urmat de un
număr care denotă antigenul definit serologic sau un număr cu un asterix care
denotă alela definită molecular.
În anumite cazuri, litera w este plasată înaintea antigenului serologic indicând
că este o denumire de lucru, provizorie.
Linkage Disequilibrium (Legătură dezechilibrată)
Observaţia că alelele de la nivelul diferitelor locusuri genetice există în
populaţie în acelaşi haplotip, semnificativ mai frecvent decât ar fi aşteptat, se
numeşte Linkage Disequilibrium. Frecvenţa estimată a două alele (f1, f2) a se
produce împreună este produsul frecvenţei genei fiecărei alele din populaţia
respectivă ([f aşteptată = f1 x f2]) [17]. Frecvenţa observată este determinată
din studii familiale în cadrul aceleaşi populaţii.

20
 Linkage Disequilibrium este un fenomen tipic pentru MHC uman şi se
extinde de la HLA-A până la HLA-DQ. Cel mai cunoscut exemplu pentru acest
fenomen este haplotipul din populaţia caucaziană A1, Cw7, B8, DR17 [4],
DR52, DQ2 care este întâlnit aproximativ de 4 ori mai frecvent decât este
estimat [17].

Genetica HLA

Una din consecinţele conglomeratului de gene HLA de la nivelul

cromozomului 6 este că cei mai mulţi indivizi moştenesc un set de alele HLA
nerecombinat de la fiecare părinte. Aceste gene sunt exprimate codominant.
Astfel, dacă tipurile HLA ale membrilor familiei sunt determinate, segregarea
tipurilor HLA în interiorul familiei poate fi utilizată pentru construirea tipurilor
HLA din fiecare cromozom. Setul alelelor HLA găsit pe un cromozom este
denumit haplotip. Determinarea haplotipurilor este importantă pentru
identificarea persoanelor înrudite identice, deoarece purtarea de antigene din
haplotipuri diferite este frecventă.
Fiecare individ moşteneşte două haplotipuri MHC de la fiecare părinte
şi astfel are două alele pentru fiecare dintre gene. Aceste alele sunt exprimate
codominant. Moştenirea genelor MHC urmează regulile segregării ale lui
Mendel. În cadrul unei familii, fiecare copil moşteneşte un haplotip
MHC de la mamă şi unul de la tată [17]. Prin convenţie, haplotipurile paternale
sunt denumite a şi b şi cele maternale c şi d. Astfel, există patru genotipuri
posibile MHC la nivelul copiilor: ac, ad, bc şi bd. Probabilitatea de a exista
oricare dintre cele patru variante de genotipuri este de 1:4 [17]. Într-o familie
cu 5 copii, cel puţin doi dintre copii vor fi identici HLA (presupunând ca nu
există fenomen de crossing over) (Fig.9).

Fig. 9. Segregarea alelelor la nivelul unui locus genetic.

21
Semnificaţie clinică

Elementul cheie, pentru transplantul renal de succes, este reprezentat de

abilitatea identificării corecte a potrivirii histocompatibilităţii dintre primitori şi
donatori şi de a încerca un prognostic de funcţionalitate, vindecare şi de viaţă
pentru aceşti pacienţi având în vedere posibilitatea apariţiei fenomenului de
rejet (gazdă versus alogrefă renală, sau în cazul transplantului medular alogrefă
versus gazdă).
Tipizarea antigenelor leucocitare umane (HLA) joacă un rol important
deoarece moleculele HLA sunt ţintele primare ale răspunsurilor imune în
transplanturile alogenetice, sunt critice pentru răspunsurile la stimuli antigenici
şi sunt implicate în susceptibilitatea genetică faţă de anumite boli imune şi
autoimune.
Antigenele şi alelele complexului major de histocompatibilitate sunt
definite şi revizuite de către Organizaţia Modială a Sănătăţii, care organizează
periodic manifestări ştiinţifice prin care se asigură o abordare comună a
nomenclaturii şi tipizării. Cea mai bună potrivire HLA dintre toate variantele
este potrivirea între gemeni identici.
În practică, acest lucru se întâmplă foarte rar şi marea majoritate a
transplantelor se efectuează între donatori neînrudiţi şi receptori potriviţi din
punct de vedere al histocompatibilităţii. Este foarte clar că, atât pentru
transplantul renal cât şi pentru transplantul de măduvă, cu cât potrivirea este mai
bună cu atât alogrefa va funcţiona în condiţii bune iar complicaţiile ulterioare vor
fi minore. Dacă potrivirea este redusă primitorul va necesita cantităţi
considerabile de imunosupresoare pentru a preveni rejetul grefei. Acest lucru
conduce la riscul unor malignităţi secundare şi la apariţia infecţiilor oportuniste.

TIPAREA HLA PEIN METODE SEROLOGICE

Metodele serologice furnizează foarte rapid şi simplu rezultatele histo-

compatibilităţii. Aceste metode folosesc ser care conţine anticorpi faţă de
antigenele HLA. Anticorpii anti HLA sunt foarte specifici pentru determinanţii
structurali individuali care caracterizează antigene diferite ale sistemului HLA.
Astfel, când serurile conţinând anticorpi anti-HLA sunt puse în contact cu
limfocite, anticorpii se leagă numai de antigenele specifice ţintă. Când
complexul antigen - anticorp este format pe suprafaţa celulei în prezenţa
complementului, activarea complementului duce la liza celulară. Astfel,
moartea celulei este un indicator de specificitate comună a antigenului şi a
anticorpului şi este un rezultat al testului “pozitiv”. Detecţia acestei specificităţi
între anticorp şi antigen furnizează răspunsul la câteva întrebări fundamentale în
testarea histocompatibilităţii:

22
 1. Care sunt antigenele HLA ale unei celule particulare? Când este
cunoscută specificitatea anticorpului (aşa cum se întâmplă la reactivii
de tipizare HLA) şi celula este de fenotip necunoscut, rezultatul testului
pozitiv cu anticorpi specifici identifică antigenele celulei.
2. Sunt anticorpi anti HLA într-un ser particular?
Când un ser este testat pentru prezenţa anticorpilor anti-HLA, un test
pozitiv indică activitate anti limfocitară în ser. Din modelul de reacţii pozitive şi
negative, cu un panel de celule tipizate HLA, poate fi găsită specificitatea
anticorpilor. Dacă serul pacientului reacţionează cu celulele donatorului, cei doi
indivizi sunt incompatibili. Astfel, printr-un proces iterativ, de testare a serului
şi tipizare a celulelor, antigenele HLA sunt definite, panelul de limfocite
tipizate este generat şi sunt create colecţiile de seruri tipizate anti-HLA de
specificitate cunoscută.
Tipizarea HLA prin testul de limfocitotoxicitate

Tipizarea HLA serologică este realizată prin expunerea celulelor

necunoscute la o baterie de antiseruri de specificitate HLA cunoscută. Serurile
pentru tipizare sunt selectate pentru a rezulta scoruri pozitive puternice care să
asigure reproductibilitatea. Dacă celulele sunt omorâte, în prezenţa antiserului şi
a complementului, celula se presupune a avea acelaşi antigen HLA ca şi
specificitatea anticorpului.
Un ser ideal pentru tipizare HLA ar trebui să fie monospecific, adică să
aibă specificitate pentru un singur antigen HLA.
Totuşi, în realitate, aloanticorpii observaţi într-un singur ser sunt în
general polispecifici. Un aloantiser poate conţine anticorpi faţă de multipli
determinanţi de pe antigenul imunizant.
Anumiţi determinanţi sunt clasici, adică, este vorba de specificităţile HLA
private care caracterizează fiecare tip HLA. Alţi determinanţi sunt publici, adică,
sunt împărţiti la câteva antigene care, în mod colectiv, constituie antigene cross
reactante de grup cross-reacting antigen group (CREG group). Majoritatea
antiserurilor HLA sunt seruri complexe obţinute de la femei multipare. Lichidul
placentar s-a dovedit a fi o sursă secundară valoroasă de aloantiseruri pentru
tipizarea HLA. Anticorpii anti-HLA sunt de asemenea găsiţi la pacienţi expuşi la
antigene HLA prin transfuzii de sânge sau grefe de organe.
Totuşi, aceste metode de obţinere a antiserurilor HLA sunt dificile şi de
aceea au fost elaborate metode care să utilizeze anticorpi nefixatori de
complement şi care se bazează numai pe legarea antigenului, cum este ELISA
sau citometria în flux.

23
 Mulţi anticorpi multiclonali reacţionează cu mai mult de o specificitate
HLA ceea ce arată existenţa de determinanţi antigenici comuni la nivelul
moleculelor HLA.
Mai nou, folosirea metodelor moleculare de tipizare HLA a crescut,
astfel că eforturile prin metodele serologice au fost reduse mult.
Un număr foarte mic de laboratoare mai menţin încă metodele
serologice de tipizare HLA dar, şi în aceste situaţii, acestea sunt completate
obligatoriu de metodele de biologie moleculară pentru a rezolva incertitudinile
şi limitele metodei serologice.

Izolarea celulelor

Limfocitele sunt tipul celular preferat pentru tipizarea HLA serologică,

screening-ul anticorpilor şi crossmatching. În mod tradiţional, limfocitele sunt
izolate din sânge total periferic prin separare în gradient de densitate – când
donatorul este viu. În cazul donatorului cadavru, limfocitele sunt separate din
splină sau ganglioni limfatici. Lucrând această metodă, trebuie o grijă deosebită
pentru a prepara o suspensie celulară de viabilitate foarte bună şi care să nu
conţină eritrocite şi trombocite. Tipizarea HLA pentru clasa II de antigene
HLA, HLA –DR şi DQ este performată pe preparate limfocitare îmbogăţite cu
limfocite B. Procedurile de izolare speciale, performate, sunt necesare,
deoarece aproximativ 80% din limfocitele din sângele periferic sunt celule T
inactive care nu conţin antigene HLA de clasa a II-a pe suprafaţa lor.
Izolarea limfocitelor T şi B cu ajutorul bilelor magnetice este în prezent
cea mai comună metodă pentru tipizarea HLA şi crossmatching. Bilele,
căptuşite cu anticorpi oferă versatilitate, viteză a revenirii celulare şi o bună
puritate a preparatului celular final. Bilele peliculizate cu anti-CD2 sau anti-
CD8 sunt folosite pentru izolarea celulelor T şi anti-CD19 pentru celulele B.
Bilele magnetice pot fi folosite pentru obţinerea numărului adecvat de celule
din sângele total, din diferite tampoane sau din preparate de limfocite din
sângele periferic.
Celulele legate de aceste bile devin mai sensibile ca ţinte posibil datorită
modificării membranelor celulare şi astfel testele necesită o perioadă de
incubare mai redusă ca timp, faţă de metodele standard de citotoxicitate.

Protocol de lucru pentru testul limfocitotoxicităţii dependente de

complement

Antiseruri HLA individuale sunt dispensate câte 1 µL în godeuri

microtest, de specificitate desemnată, în plăcuţe de plastic compuse din 60 sau

24
72 de godeuri având capacitatea de 15µL. Un model de seruri anti HLA este
ales cu specificităţi care acoperă toate posibilităţile variantelor de tipuri HLA.
În general, fiecare tip este reprezentat de cel putin doua antiseruri. Astăzi,
laboratoarele obţin plăcuţe de tipizare congelate, comerciale, gata de folosit.
Pentru tipizarea HLA, serurile dintr-o plăcuţă de testare sunt dezgheţate
şi aproximativ 2000 de limfocite sunt dispensate în godeu. Apoi plăcuţa este
incubată 30 de minute la temperatura camerei pentru a permite anticorpilor anti-
HLA a se lega la antigenele lor HLA ţintă specifice. Complementul (5 µL) este
adăugat în general ca ser de iepure şi plăcuţa este incubată timp de 60 de
minute. Testul de citotoxicitate dependentă de complement pentru tipizarea
HLA-DR şi DQ este performat cu seruri corespunzătoare de tipizare de clasa
aII-a, numai că metoda este modificată pentru celule B: iniţial are loc incubarea
celulelor, iar serul este încălzit la 370C sau 220C pentru 60 de minute; după
adăugarea complementului, amestecul este incubat timp de 120 de minute la
temperatura camerei. Creşterea temperaturii este folosită pentru a evita reacţiile
fals pozitive care pot rezulta din legarea anticorpilor nespecifici, reactivi la rece.
Când se utilizează pentru tipizarea clasei a II-a bile imunoabsorbante, timpii de
incubare sunt în general reduşi cu aproximativ jumătate, posibil din cauza
slăbirii membranei celulare datorită ataşării bilelor.
Pentru a vizualiza celulele moarte şi vii este adăugat un colorant, eozina
Y urmată de formalină pentru a fixa reacţia, apoi se utilizează microscopul cu
contrast de fază. Celulele vii exclud colorantul şi apar luminoase şi refractante,
iar celule moarte conţin colorant şi sunt uşor mărite de volum şi întunecate.
Există o metodă alternativă de vizualizare care foloseşte fluorocromi, cum este
fluoresceina diacetat (verde), înainte de dispensarea în plăcuţă. Când celulele
sunt omorâte testul este pozitiv, iar fluoresceina curge afară şi celulele “dispar”.
Rezultatele pozitive sunt comparate cu un godeu negativ, unde toate celulele
sunt viabile. Se poate adăuga un al doilea fluorocrom de culoare contrastantă,
cum este ethidium bromide (roşu), pentru a vizualiza celulele moarte.
Fiecare godeu este scorificat individual prin inspecţie, notând procentul
celulelor moarte per godeu. Testul este clar pozitiv când cel puţin jumatate din
celule sunt moarte. Tipajul HLA rezultă prin interpretarea modelului de
reactivitate al unor seruri individuale şi a specificităţii lor. În fenotiparea unui
individ pentru HLA clasa a I-a se aşteaptă să se găsească modele de rezultate cu
două antigene pentru, fiecare din locusurile A, B şi C. Când numai un singur
antigen este identificat într-un locus, individul poate fi homozigot pentru acel
tip de antigen sau, laboratorul a eşuat în a identifica cel de-al doilea antigen
deoarece serurile pot să nu conţină anticorpi pentru epitopii prezenţi pe celulele
ţintă sau există o exprimare redusă a moleculelor HLA pe limfocitele testate.

25
Variabilitatea rezultatelor de tipizare HLA serologice

Serurile de tipizare HLA nu sunt uniforme deoarece complexitatea

polimorfismului HLA face imposibilă crearea unui reactiv standard pentru
fiecare specificitate. Fiecare laborator de tipizare HLA are responsabilitatea de
a obţine antiserurile adecvate şi de a monitoriza performanţa acestora, inclusiv a
produselor comerciale.
Rezultate obţinute cu plăcuţele de tipizare ale laboratorului pot fi
comparate cu acelea ale altor colecţii de seruri pentru confirmarea unui anumit
fenotip HLA. Toate laboratoarele de tipizare HLA sunt controlate de către
inspectorii Federaţiei Europene de Imunogenetică (EFI) sau de către Societatea
Americană pentru Histocompatibilitate şi Imunogenetică (ASHI), pentru a
verifica calitatea reactivilor serologici şi a reactivilor celulari folosiţi pentru
testarea clinică.
Programele de control de calitate naţionale şi internaţionale sunt
disponibile pentru tipizare, crossmatching şi anticorpi citotoxici, iar
performanţa satisfăcătoare este obligatorie pentru acreditarea EFI şi/sau ASHI a
laboratorului.
O a doua variabilă a tipizării HLA serologice este complementul seric,
un reactiv disponibil comercial care cumulează practic serurile de la câteva sute
de iepuri. Serul de iepure conţine anticorpi heterofili cu activitate limfocitară
antiumană care îi măreşte eficienţa în testele de citotoxicitate. Supraabundenţa
acestor anticorpi antiumani face ca şi complementul să fie citotoxic şi astfel se
produc rezultate fals pozitive. Fiecare laborator trebuie să îşi verifice sursa de
complement pentru a găsi varianta care promovează reacţii citotoxice intense
fără a produce toxicitate nespecifică. Deoarece nu există o sursă standard de
complement, acelaşi ser testat în diferite laboratoare, are potenţialul de a
produce rezultate discordante.
Alte variabile sunt metodele folosite pentru a vizualiza celulele vii şi
moarte, timpii de incubare şi definirea terminării perioadei de lucru a testului,
precum şi interpretarea rezultatelor.

TIPAREA HLA PRIN METODE DE BIOLOGIE MOLECULARĂ

Specificităţile serologice au fost identificate prin modelul de legare al

anticorpilor în testele serologice şi din activarea limfocitelor de către antigenele
distincte ale complexului major de histocompatibilitate (MHC) în testul culturii
mixte limfocitare (MLC).

26
 Cu ajutorul clonării genice şi a secvenţializării ADN, specificităţile
antigenelor HLA sunt în prezent cunoscute a deriva din diferenţele de secvenţă
localizate în câteva regiuni hipervariabile de la nivelul moleculelor MHC.
Cele mai multe dintre diferenţe au apărut din evenimentele de conversie
intragenică şi intergenică care au condus la polimorfismul complex care
caracterizează sistemul HLA.
La nivelul genelor HLA de clasa aII-a, regiunile variabile se găsesc în
principal în exonul 2, iar la genele HLA clasa I; zonele polimorfe sunt
concentrate în exonul 2 şi 3.
Aceste variaţii de secvenţă, sunt localizate în zona de legare a
antigenului şi la nivelul regiunilor alfahelix care întâmpină receptorul celulei T.
Aceste localizări strategice sunt expuse abilităţii sistemului imun de a
recunoaşte şi a răspunde la patogeni (şi posibil autoimunogeni) şi la antigeni
endogeni sau exogeni.
Alelele HLA poartă multe din aceleaşi motive secvenţiale dar în
combinaţii diferite.
În consecinţă, antigenele de clasa I şi clasa aII-a, pot fi aşezate ca un
pachet de combinaţii ale acestor polimorfisme secvenţiale, care au ca bază o
secvenţă comună de nucleotide.
Fenomenul observat al crossreactivităţii antiserurilor şi mai recent
fenomenul de crosshibridizare al nucleotidelor marcate poate fi explicat de
faptul că anumite antigene pot avea aceleaşi secvenţe.
O consecinţă importantă a acestor motive secvenţiale purtate în comun
este că anumite combinaţii heterozigote ale alelelor nu pot fi întodeauna distinse
de o a doua combinaţie diferită.
Toate metodele de tipizare ADN trebuie să ia în considerare aceste
aspecte când propun schemele pentru identificarea alelelor.
În mod evident, cea mai performantă metodă de tipizare HLA ar fi aceea
care ar putea performa o analiză completă secvenţială a ADN-ului de la nivelul
genelor HLA pentru fiecare individ.
Secvenţierea nucleotidică automată este folosită în mod curent ca şi
„standardul de aur” pentru tipizarea HLA, dar această tehnologie este în general
mai restrânsă pentru Centrele de Imunogenetică care sunt implicate în
programele de transplant de celule stem hematopoetice care folosesc frecvent
donatori neînrudiţi.
În tabelul următor sunt redate comparativ caracteristicile metodelor de
tipizare HLA serologice şi moleculare.

27
Tabelul nr.1. Comparaţie între metodele de tipizare HLA serologice şi bazate pe ADN [2]

Metode SEROLOGICE ADN: SSP/SSOP ADN: SBT

Numărul de tipuri identificabile

HLA-A 21 21-151 151

HLA-B 43 43-301 301

HLA-C 10 10-83 83

HLA-DR 18 18-282 282

HLA-DQ 9 9-43 43

HLA-DP - 6-87 87

Materialul probei 2-3 milioane de Cantităţi infime de ADN Cantităţi infime de

limfocite vii ADN

Reactivi Aloantiseruri Oligonucleotide Oligonucleotide

(furnizare limitată) sintetice primeri / sintetice primeri
câteva monoclonale oligonucleotide marcate (furnizare
(furnizare nelimitată) nelimitată)

Puterea de a Foarte limitată: Limitată: bazată pe Nelimitată: noi alele

identifica noi alele depinde de cunoştinţa secvenţelor şi identificate prin
disponibilitatea şi pe noi modele de reacţie secvenţiere
specificitatea serurilor

Nivelul de Nivel generic De la generic la nivel Nivel alelic

rezoluţie pentru alelic
alelele cunoscute

Factori importanţi Expresia HLA pe Calitatea şi cantitatea Calitatea şi

suprafaţa celulară. ADN-ului genomic şi cantitatea ADN-ului
factorii de amplificare. genomic şi factorii
Viabilitatea celulelor de amplificare.
Obligativitatea
respectării cu stricteţe a
protocolului

Metodele moleculare de tipizare oferă avantaje importante faţă de

metodele serologice incluzând acurateţea mult îmbunătăţită, rezoluţia înaltă şi
flexibilitatea probelor. Metodele moleculare de tipizare pot fi în particular
avantajoase pentru tipizarea probelor conţinând molecule HLA care sunt în
acelaşi CREG.

28
 Câteva publicaţii au documentat beneficiul clinic al tipizării moleculare
evidenţiind în special cele două aspecte deja menţionate şi anume acurateţea
mult îmbunătăţită şi rezoluţia înaltă a tipizării.
Menţionăm că datele de secvenţiere furnizate de metodele moleculare
împreună cu cunoştinţele despre structura şi funcţia sistemului HLA sunt în
mod curent folosite pentru înţelegerea mai bună a bazei moleculare a
alorecunoaşterii şi a bolilor cu determinism genetic HLA.
Principiile metodelor moleculare de lucru în histocompatibilitate
Prima metodă de tipizare moleculară a detectat lungimea
polimorfismului fragmentului de resctricţie (RFLP) în ADN-ul genomic şi a
fost folosită în special pentru tipizarea HLA de clasa a II-a.
De asemenea o altă metodă de biologie moleculară utilizată frecvent
este metoda cu hibridizare la matriţa ARN folosind oligonucleotide marcate cu
secvenţă specifică (SSOP). După descoperirea reacţiei de amplificare genică
(PCR) au fost dezvoltate rapid câteva metode facile şi robuste de tipizare HLA
prin biologie moleculară. Prima metodă utilizată a fost SSOP. Această metodă a
fost urmată de dezvoltarea metodei cu primeri de secvenţă specifică care se
bazează pe specificitatea amplificării pentru a determina tipurile de HLA.
Cea mai recentă dezvoltare în domeniul metodelor de biologie
moleculară pentru tipizarea HLA este tipizarea bazată pe descifrarea
secvenţelor – secvenţiere (SBT) care are avantajul automatizării şi a unei
acurateţi perfecte. Secvenţierea este urmată de dezvoltarea tehnologiei
microarray pentru genotiparea HLA.
În tabelul 2 sunt prezentate cele mai folosite metode de biologie
moleculare în tipizarea HLA.
Tabelul nr. 2. Tehnici moleculare de testare a histocompatibilităţii [2]

REACTIVI PROCESE Polimorfismele detectate

NUME CARACTERISTICI CARACTERISTICE
Endonucleaze Southern blotting Lungimea fragmentului de
RFLP
bacteriene de restricţie restricţie

Primeri PCR de PCR/gel electroforeză De la nivel generic la nivel

SSP
secvenţă specifică de alelă

Oligonucleotide cu PCR/hibridizare a De la nivel generic la nivel

SSOP secvenţă specifică, oligonucleotidelelor de alelă
marcate marcate la produsul PCR
Primeri PCR/secvenţierea Nivel de alelă
SBT etichetaţi/terminatori nucleotidică a
de secvenţiere produsului PCR
*În prezent este în curs de investigare clinică şi tehnologia microarray pentru genotiparea HLA.

29
Amplificarea genelor

Majoritatea metodelor moleculare de genotipare HLA folosesc reacţia

PCR pentru a amplifica selectiv segmentele genelor HLA care sunt necesare
tipizării.
Specificitatea amplificării poate fi specifică de locus (de exemplu,
HLA-A, HLA-B, HLA-DRB1), specifică de grup (de exemplu: DRB1-01,
DRB1-02) sau cu specificitate alelică (de exemplu: DRB1*-0401,
DRB1*0402).
Pentru PCR specificitatea este determinată de secvenţa primerilor şi
condiţiile de amplificare (cum sunt ciclurile de temperatură şi Mg2+).
Cele mai multe scheme de tipizare necesită condiţii care evită co-
amplificarea pseudogenelor.

GENOTIPAREA HLA SSOP

Hibridizarea cu oligonucleotide marcate de secvenţă specifică (sonde)
a fost prima metodă de tipizare HLA bazată pe PCR. Această metodă simplifică
amplificarea selectivă a HLA ţintă urmată de hibridizarea cu un panel de
oligonucleotide marcate.
Cele două formate mai frecvent folosite sunt:

 Dot sau slot blot cu ADN-ul amplificat legat de un suport solid (cum
este membrana) şi hibridizat cu substanţe de marcat în soluţie.

 Revers dot sau slot blot cu substanţe de marcat legate de un suport solid,
hibridizat cu ADN-ul amplificat în soluţie. Formatul dot blot este favorabil
pentru tipizarea unui număr mare de probe. Unele laboratoare cu volum mare
de lucru, folosesc această metodă pentru tipizarea unor loturi de 96 sau 384
de probe. Metoda revers dot blot este favorabilă pentru testarea unui număr
mic de probe. Reactivii pentru dot/slot-blot sunt disponibili comercial,
existând kituri standardizate având toate componentele necesare lucrului
incluse.
O cantitate de 1-5 µL de ADN amplificat din fiecare probă este aplicată
pe o membrană de nylon. Dupa hibridizarea cu oligonucleotidele marcate,
membranele sunt spălate pentru a îndepărta legarea nespecifică. Se utilizează un
substrat astfel încât se dezvoltă o reacţie de culoare rezultând un model al
hibridizării pozitive şi negative care este folosit pentru a desemna tipul HLA.
Un avantaj major al acestui procedeu este că, atât controlul pozitiv cât şi
controlul negativ pot fi incluse pentru fiecare reacţie.

30
 În rezumat, principiul metodei este bazat pe revers hibridizare.
Materialul ADN extras şi amplificat biotinilat este aport denaturat chimic şi
separat în spire care sunt hibridizate cu oligonucleotide specifice marcate
(sonde) imobilizate ca linii paralele pe benzi.
În etapa urmatoare, de spălare, are loc îndepărtarea materialului
amplificat nelegat. Dupa spălare, este adăugat conjugatul cu streptavidină şi
fosfatază alcalină care se leagă la hibrizii biotinilaţi formaţi anterior. Incubarea
cu o soluţie substrat, conţinând un cromogen, conduce la obţinerea unui
precipitat gri/maro.
Reacţia este oprită printr-o etapă de spălare şi modelul reactivităţilor
sondelor este înregistrat. Amplificarea este efectuată prin PCR (Fig.10). Datele
obţinute sunt introduse în calculator, iar programul interpretează şi redă tipul
alelic HLA.
Tipizarea PCR-SSOP reprezintă o metodă cu un înalt nivel de rezoluţie
şi acurateţe.
Această metodă este foarte adecvată pentru analiza unui număr mare de
probe pe o perioadă lungă de timp, fiind foarte eficientă pentru lucrul
pacienţilor aflaţi pe listele de aşteptare. Dezavantajele acestei metode sunt
durata mare a timpului de lucru (9,50 ore) şi costul ridicat în cazul în care se
utilizează pentru un număr redus de probe.

Fig. 10. Genotiparea ADN HLA prin metoda SSOP

31
GENOTIPAREA HLA SSP
Una din cele mai frecvente metode de biologie moleculară utilizată
pentru genotiparea HLA este metoda de amplificare genică cu primeri cu
secvenţa specifică (SSP). Perechile de primeri sunt elaborate pentru a amplifica
specific fiecare secvenţă polimorfă HLA care trebuie să fie detectată, pentru a
furniza nivelul dorit de rezoluţie al tipizării. Trebuie menţionat că există o
pereche de primeri care amplifică un segment diferit al ADN-ului şi care în mod
curent este inclusă în acelaşi tub ca şi control intern pozitiv al amplificării.
ADN-ul ţintă este adăugat în reacţie alături de primeri şi celelalte componente
de reacţie (ADN polimeraza, tamponul, Mg2+)apoi este performată ciclizarea
termică.
Produsele de amplificare PCR sunt uzual detectate prin separare pe un
gel de agaroză. După electroforeză, ADN-ul este marcat cu ethidium bromide şi
reacţia este scorificată pentru prezenţa produşilor de amplificare ai primerilor
controlul intern şi prezenţa sau absenţa produsului de amplificare specific HLA.
Combinarea reacţiilor HLA pozitive şi negative este folosită pentru a desemna
tipul HLA. Dacă nu sunt prezente produse de amplificare specifice HLA şi nu
se identifică nici produsul controlului intern, reacţia este cotată ca eşec şi
trebuie repetată.
Numărul de primeri incluşi în test variază în funcţie de locus şi de
nivelul de rezoluţie cerut. Pentru o rezoluţie scăzută HLA DRB este nevoie de
20-30 de reacţii; pentru o tipizare ABC, în mod curent, este nevoie de 100-200
de reacţii. Setul de primeri pentru tipizare sunt furnizaţi comercial.
Cum numărul de alele cunoscute este în continuă creştere şi numărul
minim de reacţii necesare pentru tipizarea SSP creşte de asemeni.
Avantajul major al acestei metode este că dotarea cu echipament este
minimă, timpul necesar pentru testare este scurt, ceea ce face ca metoda să fie
ideală pentru lucru în cazul donatorului cadavru şi este uşor de performat
(Fig.11).
Dezavantajele majore sunt reprezentate de necesitatea unui număr mare
de reacţii şi de nevoia unei cantităţi mari de ADN înalt purificat care să asigure
ca specificitatea reacţiei nu este compromisă.
Una din slăbiciunile formatelor de lucru actuale este că primerii de
tipizare HLA nu sunt întodeauna controlaţi intern. Astfel, un rezultat fals
negativ poate fi obţinut dacă controlul intern (o pereche diferită de primeri) este
pozitiv, iar primerii specifici HLA sunt disfuncţionali.

32
 Mai nou, producătorii acestor kituri includ, de regulă, şi controale
interne pentru fiecare reacţie.
În rezumat, metoda parcurge următoarele etape: ADN-ul este extras
din probă şi amestecat cu primeri având specificitate pentru secvenţele
caracteristice ale fiecărui tip de HLA. Aliquote din probă sunt plasate în tuburi
separate fiecare conţinând un set specific de primeri şi apoi sunt amplificate în
termobloc.
Produsele de amplificare sunt apoi vizualizate în electroforeză, gelul
fiind marcat cu ethidium bromide şi fotografiat în lumină UV.
Prezenţa benzilor indică faptul că proba ADN a avut secvenţa
corespunzătoare unui tip particular de HLA. Absenţa amplificării implică
absenţa acelei secvenţe alelice particulare în proba ADN. Toate tuburile conţin
un primer suplimentar care serveşte ca şi control al amplificării PCR.

Fig. 11. Rezultatele metodei SSP ADN HLA

TIPIZAREA HLA BAZATĂ PE SECVENŢIERE (SBT)

Tipizarea HLA bazată pe secvenţiere (SBT) implică determinarea

secvenţei nucleotidice a unei segment amplificat aparţinând unei gene HLA.
Aceasta se realizează folosind un secvenţializator nucleotidic automat, iar
procedeul se desfăşoară, pe scurt, după cum urmează: segmentul de genă HLA
este amplificat şi excesul de nucleotide şi primeri este îndepârtat. ADN-ul
amplificat este folosit ca matriţă pentru reacţia de secvenţiere iar produsele
reacţiei de secvenţiere sunt purificate şi aplicate pe un gel de secvenţiere.

33
 Reacţiile SBT conţin un amestec de nucleotide normale şi nucleotide
modificate (dideoxinucleotide) care termină polimerizarea când sunt
încorporate în spira replicativă a ADN. Un primer este folosit pentru a iniţia
sinteza ADN folosind ADN polimeraza. Când un dideoxinucleotid este
încorporat într-o nouă moleculă ADN polimerizarea este terminată. Astfel,
extensia primerilor este generată astfel încât se termină la fiecare poziţie a
moleculei ADN.
Markeri fluorescenţi sunt utilizaţi pentru a distinge lanţurile terminate
de fiecare bază (A, C, G sau T). Markerii sunt încorporaţi folosind culori pentru
primeri sau culori pentru dideoxinucleotidele terminatoare.
Extensiile primerilor sunt separate pe un gel care rezolvă diferenţele de
dimensiuni ale acestor secvenţe ADN până la nivel de o singură bază. Gelul
este efectuat într-un secvenţializator ce conţine laser care excită moleculele
markerilor şi un detector care înregistrează emisia fiecărui marker.
Software-ul converteşte datele primare într-o cromatogramă şi aliniază
automat nucleotidele pentru fiecare poziţie. Datele sunt editate automat şi
secvenţa este comparată cu o bază de date conţinând toate secvenţele cunoscute,
pentru a alinia alelele în probă.
Un avantaj al acestei metode este că fiecare secvenţă, din fiecare spiră
ADN poate fi determinată pentru a confirma tipul. Acest lucru este recomandat
deoarece artefactele tehnice pot determina câteodată pierderea unui nucleotid
particular care poate conduce la o interpretare incorectă a datelor de la
heterozigoţi.
În concluzie, variaţiile mici în secvenţa genică pot fi relevate numai
prin secvenţiere directă care conferă o acurateţe perfectă rezultatelor.
În rezumat, etapele metodei sunt: ADN-ul este izolat din probă şi
amplificat prin PCR folosind primeri specifici de locus, grup sau alelă.
Produsul de amplificare este apoi distribuit în 4 tuburi, fiecare conţinând
polimerază, dideoxinucleotide (dNTP) şi amestecuri de secvenţiere. Fiecare din
cele 4 amestecuri este marcat cu un terminator de secvenţe fluorescent: tubul 1
cu citozina marcată (C*); tubul 2 cu guanină marcată (G*); tubul 3 cu thymină
marcată (T*), iar tubul 4 cu adenină marcată (A*).
Produsul este amplificat prin PCR pentru a încorpora terminatorii
marcaţi. Cele 4 tuburi cu probe sunt puse în electroforeză pentru a separa
produsele de extensie ale primerilor în funcţie de dimensiuni.
Secvenţializatorul detectează fluorescenţa în fiecare bandă şi software-ul
converteşte datele în secvenţe nucleotidice. De asemenea, software-ul compară
secvenţele cu o bază de date de secvenţe HLA şi descifrează tipul HLA.

34
TEHNOLOGIA MICROARRAY

Principiul de bază al hibridizării ADN microarray este legarea

complementară a secvenţelor de acizi nucleici simplu spiralate. Pe un
microarray (numit şi microcip), secvenţe cunoscute denumite ţinte, sunt ataşate
la locaţii fixe (puncte - spots) pe o suprafaţă solidă cum este sticla, folosind
punctarea robotică (Fig. 12).
Cele mai frecvent folosite sunt două tipuri de ADN microarray:
a. cADN sau ADN genomic array, cu secvenţe lungi de ADN
complementar de 500-5.000 perechi de baze imobilizate, fiecare
reprezentând o genă sau un fragment specific de cromozom.
b. Oligo array, ale căror microcipuri au secvenţe ADN mai scurte
(oligo-nucleotide), de 20-100 perechi de baze imobilizate ca ţinte;
secvenţele necunoscute în soluţie numite sonde (cum este cADN
sau ARN marcat fluorescent), se vor lega la ţinte complementare
imobilizate.
Acelaşi principiu se poate aplica şi altor ţinte şi sonde ca: proteine, glicani, etc.
Pentru HLA, tehnologia microarray va trebui să-şi dovedească eficienţa
şi performanţa, deoarece secvenţierea este un concurent redutabil în ceea ce
priveşte sensibilitatea, specificitatea şi descifrarea de alele noi.

Fig. 12. Microarray – microcip ADN HLA

35
 SECVENȚIEREA DE NOUA GENERAȚIE

Secvențierea de nouă generație se referă la secvențierea genomurilor, re-

secvențierea acestora, secvențierea transcriptomurilor (RNA-Seq), interacțiunea
ADN-proteine (secvențierea ChIP), și caracterizarea epigenomurilor. Re-
secvențierea este necesară pentru că genomul unui singur individ nu este
reprezentativ pentru întreaga specie.
Cererea pentru secvențiere ieftină a dus la dezvoltarea tehnologiei
secvențierii la scară largă (sau secvențiere de nouă generație) care paralelizează
procesul de secvențiere, producând milioane de secvențe ADN în același
timp.[135][136] (Fig. 13)

Fig. 13. Fragmente secvențiate

Comparație între metodele de secvențiere

Acuratețe
Lungimea (citire a
Citiri pe Timp pe
Metodă secvenței unei baze Avantaje Dezavantaje
tură tură
citite fără
consens)

10,000 bp -
Secvențiere în 15,000 bp 50,000 pe Număr de citiri
Citiri
timp real a unei medie (14,000 celulă între 30 relativ mic.
extrem de
singure bp N50);mări 87% SMRT minute și 4 Echipamentul e în
lungi.
molecule (Pacific mea maximă a sau 500– ore general foarte
Rapid.
Biosciences) unei singure 1000 Mb scump.
citiri >40,000
de baze

36
Ion Echipa-
până la
semiconductor ment mai
până la 400 bp 98% 80 de 2 ore Erori.
(Secvențierea Ion ieftin.
milioane
Torrent) Rapid.

Citiri
Pirosecvențierea
700 bp 99.9% 1 milion 24 ore lungi. Scump. Erori.
(454)
Rapid.

între o zi și
până la 5
11 zile, Echipament scump.
Secvențierea prin de la 50 la 300 99.9% miliarde Secvențe
depinde de Cere mari cantități
sinteză (Illumina) bp (Phred30) (TruSeq, multe.
lungimea de ADN.
perechi)
citirilor

Ia mai mult timp

Secvențierea prin decât celelalte
între 1.2
ligație 50+35 sau 1 sau 2 metode. Are
99.9% și 1.4 ieftin.
(secvențierea 50+50 bp săptămâni probleme cu
miliarde
SOLiD) secvențele
palindromice.

Scump și nu foarte
practic în proiectele
ample.
între 20 de
Secvențierea între 400 și Citiri Presupune Reacția
99.9% N/A minute și 3
Sanger 900 bp lungi. de polimerizare în
ore
lanț sau
clonare plasmidelor
.

Citiri
lungi.
Rezultate
rapide.
Mașinăria
Secvențierea până la MinION Acurarețe foarte
70% N/A 75 bp/s
nanopore 50000 bp este slabă.
portabilă,
de
mărimea
unui
telefon.

37
CE ESTE SECVENȚIEREA ILLUMINA

Tehnologia de secvențiere sau de secvențiere prin sinteză Illumina (SBS) este

cea mai utilizată tehnologie de secvențiere de generație următoare din lume.
Mai mult de 90% din datele de secvențare ale lumii sunt generate de secvențiere
Illumina. A fost inițial dezvoltat de Shankar Balasubramanian și David
Klenerman la Universitatea din Cambridge. Au fondat o companie cunoscută
sub numele de Solexa în 1998. Apoi, Illumina a achiziționat Solexa în 2007,
îmbunătățind rapid tehnologia originală. Prin urmare, metoda mai este
numită metoda de secvențiere Solexa / Illumina. Principalul avantaj al
secvențierii Illumina este că oferă un randament ridicat de lecturi fără erori.

CUM FUNCȚIONEAZĂ SECVENȚAREA ILLUMINA

PASUL 1. PREGĂTIREA BIBLIOTECII

 O bibliotecă de secvențiere este pregătită prin marcare simultană a

ADN-ului în segmente scurte de 200-600 de perechi de baze prin
transpozații într-un proces cunoscut sub numele de marcare, urmată de
ligarea adaptorului la capetele de 3 'și 5' ale segmentelor scurte ale
ADN-ului.
 Motive suplimentare, cum ar fi secvențierea site-ului de legare a
grundului, indexul și o regiune, care este complementară cu oligo-ul
celulelor curgătoare, sunt adăugate pe adaptor pe ambele părți
prin amplificarea ciclului redus. Tagmentarea și adăugarea motivelor
sunt prezentate în figura 14.

38
 Fig. 14. Tagmentarea și adăugarea motivelor

Pasul 2. Generarea clusterului

 Biblioteca de secvențiere pregătită este denaturată și încărcată într-

o celulă de flux pentru generarea clusterului. În timpul generarii
clusterului, fiecare fragment din biblioteca de secvențiere este amplificat
izotermic. Celula de flux este alcătuită din benzi care conțin sticlă.
Fiecare bandă este acoperită cu două tipuri de oligonucleotide. Un tip
este complementar cu regiunea 5 ′ a motivelor suplimentare, iar celălalt
este complementar cu regiunea 3 ′ a motivelor suplimentare ale
bibliotecii pregătite. Prin urmare, acești oligoți se leagă de regiunile
corespunzătoare de ADN din biblioteca de secvențare. Celula de flux cu
două tipuri de oligo este prezentată în figura 15. Oligo care se leagă de
regiunea 5 ′ a bibliotecii de secvențiere are o culoare roz, în timp ce
oligo care se leagă de regiunea de 3 ′ a bibliotecii de secvențare are o
culoare verde.

39
 Fig. 15. Celulă de flux

 Odată ce biblioteca de secvențiere monocatenară este legată de oligo,

catena complementară este generată de ADN-polimerază. Apoi, ADN-ul
dublu-catenar rezultat este denaturat și șuvița inițială este spălată.
 Amplificarea clonală a fragmentului se realizează prin amplificarea
podului. În timpul acestui proces, șuvița se pliază asupra celui de-al
doilea tip de oligo pe celula de flux. Apoi, polimeraza sintetizează
puntea cu două cateni. Daturarea punții are ca rezultat două catene de
ADN: atât în fața în față, cât și pe cea inversă pe oligoii celulei de flux.
 Amplificarea podului este repetată de mai multe ori pentru a obține
simultan milioane de cluster-uri de toate tipurile de fragmente din
biblioteca de secvențiere prin amplificare clonală. Amplificarea clonală
este prezentată în figura 16.

40
 Fig. 16. Amplificare clonală

 Apoi, șuvițele invers sunt spălate, păstrând numai cablurile înainte pe

celula de curgere. În șirul înainte, capătul 3 ′ este liber și este blocat
pentru a preveni amorsarea nedorită.
Pasul 3. Secvențiere
Prima citire a secvenței inversă

Secvențializarea începe cu extinderea primului primer de secvențiere.

Metoda de secvențiere Illumina utilizează dNTP modificate, care conțin un
terminator în poziția 3 'a zahărului dezoxiribozei. Aceste dNTP-uri sunt, de
asemenea, marcate fluorescent în culori diferite.
După adăugarea fiecărui nucleotid complementar, se observă ciorchine în celula
de flux pentru emisia de fluorescență.
După detectarea luminii, fluoroforul poate fi spălat.
Apoi, grupul terminator al poziției 3 'a zahărului este regenerat de o grupare
hidroxil, permițând adăugarea unui al doilea dNTP la lanțul de creștere. Acest
proces este cunoscut sub numele de secvențiere-prin-sinteză. Secvențializarea
prin sinteză este prezentată în figura 17.

41
 Fig. 17. Secvențiere prin sinteză

 La finalizarea sintezei, se obține prima citire a secvenței inversă și

produsul de secvențare este spălat.

Grundul de index 1 este apoi hibridizat în grupuri pentru a genera o a doua

citire în același mod prin secvențiere-prin sinteză. Produsul de secvențare este
spălat.

Capătul 3 ′ al clusterului este apoi deprotejat, permițând hibridizarea capătului 3

′ cu cel de-al doilea tip de oligo pe celula de curgere (culoare verde). Prin
aceasta, se obține secvența regiunii index 2. Produsul de secvențare este spălat.
A doua citire a secvenței înainte

 Al doilea tip de oligo este extins de o polimerază, formând o punte cu

două cateni. Podul este denaturat și capetele lor de 3 ′ sunt blocate. Firul
înainte este spălat.
 A doua citire a secvenței înainte se obține prin secvențiere-prin sinteză
prin hibridizarea și extensia celui de-al doilea primer de secvențiere.

Pasul 4. Analiza datelor

 Miliarde de lecturi obținute prin secvențiere sunt grupate pe baza

secvențelor lor de index.

42
  Apoi, secvențele cu citiri similare sunt grupate.
 Citirile înainte și invers sunt împerecheate pentru a forma secvențe
contigue.
 Aliniamentele ambigue pot fi rezolvate prin secvențe împerecheate.
 Secvențele contigua sunt aliniate la genomul de referință pentru
identificarea variantei.

Concluzie

Secvențializarea Illumina este o metodă de secvențiere de generație următoare.

Secvențializarea Illuminei este implicată în pregătirea unei biblioteci de
secvențiere cu 200-600 de perechi de baze lungi fragmente de ADN. Cei patru
pași implicați în secvențierea Illumina sunt pregătirea bibliotecii, generarea
clusterului, secvențiere și analiza datelor. Deoarece secvențierea Illumina oferă
citirea secvenței cu o precizie ridicată, aceasta este metoda de secvențiere pe
scară largă folosită în lume.

LIMITELE METODELOR DE BIOLOGIE MOLECULARĂ

Metodele care detectează secvenţe cheie polimorfe, pentru a deduce un

tip HLA pot, uneori, elabora un tip incorect dacă sunt prezente alele
necunoscute. Aceste metode nu pot detecta întodeauna alele noi la nivelul
locusurilor polimorfe testate.
Mai mult, probleme pot apărea cu diferite interpretări ale datelor
depinzând de lista secvenţelor HLA folosite pentru asamblarea tipului HLA.
Aceste circumstanţe fac să fie dificilă compararea tipizărilor performate la date
diferite.
În completare, extrapolarea de la datele de secvenţiere, limitate la un
anumit tip HLA, poate determina uneori asamblarea de diferite tipuri depinzând
de metoda şi reactivii folosiţi pentru tipizare.
O limitare majoră, care afectează tipizarea ampliconilor heterozigoţi,
este că multiplele interpretări ale datelor sunt posibile pentru anumite
combinaţii de alele. Această situatie poate fi rezolvată prin performarea tipizării
pe alele amplificate selectiv. Câteodată ambiguităţile pot fi rezolvate folosind o
combinaţie de date provenite de la două metode cum ar fi de exemplu, SSOP şi
SSP sau SBT şi SSP.

43
 Din aceste considerente, este obligatoriu ca toate centrele de
imunogenetică şi histocompatibilitate să aibă posibilitatea de a performa cel
putin două metode de genotipare HLA.
O limitare majoră este dată de faptul că interpretarea datelor este
influenţată de baza de date de secvenţe folosite pentru a interpreta rezultatele
obţinute. SBT, care determină secvenţa unui segment ce reprezintă o porţiune
substanţială a genei HLA, este mai puţin susceptibil la aceste probleme. Dacă
secvenţa este determinată pentru o alelă amplificată selectiv, secvenţa este
precisă. Deoarece multe laboratoare nu determină secvenţa pentru întreaga genă
HLA, polimorfismul din afara regiunii secvenţei nu este detectat.
Multe laboratoare performează metoda SBT folosind matriţe
heterozigote cum ar fi două alele HLA-A care sunt co-amplificate. Aceste date
sunt tipic interpretate comparând secvenţa determinată cu secvenţele pentru
toate combinaţiile posibile de alele cunoscute.
Uneori aceste rezultate sunt ambigue, cum ar fi multiplele interpretări
ale rezultatelor de secvenţiere ale datelor heterozigoţilor. Dacă baza de date al
secvenţelor HLA este lărgită ca număr, atunci numărul ambiguităţilor sau al
interpretărilor alternative ale datelor obţinute creşte.

Evaluarea acurateţei metodelor de tipizare HLA

Complexitatea identificării alelelor HLA necesită asigurarea unor

rezultate de înaltă calitate.
Standardele actualizate şi detaliate pentru tipizarea HLA bazată pe ADN,
sunt menţinute de către Societatea Americană pentru Histocompatibilitate şi
Imunogenetică (ASHI) [1] şi de către Federaţia Europeană de Imunogenetică
(EFI). Centrele de Imunogenetică şi Histocompatibilitate sunt obligate să
participe în scheme de control extern de calitate.
În tipizarea HLA calitatea este o problemă cheie. Conceptul de
control de calitate în laborator asigură că testul adecvat este performat cu o
competenţă tehnică de un standard înalt pe proba adecvată şi că rezultatul corect
este trimis cu interpretarea calificată către clinicianul care o cere. Testele
imunologice de histocompatibilitate au nevoie de interpretarea expertului astfel
încât rezultatele ajunse în clinică să poată fi înţelese corect de către clinician.

44
 Cu alte cuvinte, laboratorul face parte din echipa de lucru a clinicii,
imunologul având un rol important în stabilirea gradului de potrivire HLA
dintre donator şi primitor şi în a da verdictul pentru transplant din punct de
vedere imunologic.
De asemenea, evaluarea imunologică post-transplant renal este la fel de
importantă, dozarea imunosupresiei şi determinarea anticorpilor anti-HLA
orientând terapia de întreţinere.
Centrele de imunogenetică şi histocompatibilitate din Europa sunt
obligate să se acrediteze cu Federaţia Europeană de Imunogenetică (EFI), care
documentează şi actualizează toate tehnicile de lucru în ceea ce priveşte
tipizarea HLA, determinarea anticorpilor citotoxici şi testul crossmatch.
Federaţia Europeană de Imunogenetică (EFI) elaborează standardele de
performanţă în imunogenetică şi histocompatibilitate.

45
 EVALUAREA IMUNOLOGICĂ ÎN TRANSPLANTUL RENAL

Ileana Constantinescu, Ana Moise, Ioanel Sinescu

Statusul curent al transplantului renal

Primul transplant renal de succes a fost performat la Boston în 1954

între gemeni genetic identici. In Romania, primul transplant renal a fost efectuat
de către Domnul Profesor Dr. Eugen Proca în anul 1980 la Institutul Clinic
Fundeni. În anul 1997 s-a efectuat primul transplant renal de la cadavru, după
recoltare multiorgan. În anul 1998 a fost performat primul transplant renal la un
pacient diabetic. În acelaşi an, s-a efectuat primul transplant renal la un adult cu
insuficienţă renală cronică prin neoplasm. Seria performanţelor continuă, în
1999 având loc primul transplant renal la copil, cu rinichi prelevat de la cadavru
iar în 2005 realizându-se primul transplant renal la un copil anefric prin tumora
Wilms bilaterală.
Transplantul renal este tratamentul cel mai eficient pentru marea
majoritate a pacienţilor cu insuficienţă renală cronică, îmbunătăţind
semnificativ calitatea vieţii, în anumite cazuri crescând speranţa de viaţă.
Imunosupresia actuală performantă, a condus la o evoluţie în timp mult
îmbunătăţită, supravieţuirea alogrefelor renale la un an şi respectiv la cinci ani
după transplantul renal de la cadavru fiind în prezent, de aproximativ 90% şi
respectiv 70% [3].
Acest succes a dus la creşterea numărului de transplante renale care
nu pot fi susţinute doar de donatori cadavru, al căror număr rămâne staţionar.
În prezent se utilizează din ce în ce mai mult rinichi de la aşa numiţii
donatori “marginali” sau donatori cadavru cu criterii de donare “extinse” sau de
la donatori non-heart-beating. De asemenea se utilizează foarte mult şi rinichii
proveniţi de la donatori vii care acoperă aproximativ 25% din transplanturile
renale în Marea Britanie şi 50% în Statele Unite [3].
În România, programul de transplant renal se bazează aproape exclusiv
pe donatori vii, donatorii cadavru fiind în medie de 20 pe an.
Actualmente, în transplantul renal, toate eforturile se concentrează pentru
îmbunătăţirea pe termen lung a evoluţiei pacienţilor.

46
Factori determinanţi ai evoluţiei pe termen lung

Îmbunătăţirile supravieţuirii pe termen lung sunt în principal rezultatul

unei evoluţii bune în primul an post-transplant [12].
Rata pierderilor alogrefelor renale după un an a rămas, însă, relativ
neschimbată din anii 1980, la 3 – 5 % pe an. Pierderea alogrefelor se datorează
în principal nefropatiei cronice a alogrefei. Recurenţa bolii renale iniţiale are
loc în aproximativ 10% din cazuri [3].
Factorii de risc imunologic pentru nefropatia cronică a alogrefei includ
episoadele de rejet şi imunosupresia suboptimală.
Missmatch-urile între donatori şi primitori pentru locusurile HLA-DR, HLA-A
şi HLA-B reduce de asemeni, supravieţuirea pe termen lung în transplantul
renal.
Factorii non-imunologici care duc la nefropatia cronică a alogrefei sunt
numeroşi şi includ vârsta înaintată a primitorului, sexul masculin,
hipertensiunea şi vârsta înaintată a donatorului.
Deoarece nu există un tratament eficient pentru nefropatia cronică a
alogrefei, şi aceasta necesită retransplant, este important să se încerce pe cât
posibil a minimaliza factorii de risc asociaţi.
Pentru transplantul renal, din punct de vedere imunologic, trebuie
parcurse trei etape. Dacă pacientul cu insuficienţă renală cronică se află înscris
pe lista de aşteptare de câţiva ani, se evaluează periodic detecţia şi identificarea
anticorpilor citotoxici.
Pacienţii pot dezvolta aloanticorpi ca răspuns faţă de moleculele HLA
străine dobândite din sarcini, transfuzii sau alogrefe anterioare. Aceşti anticorpi
pot fi cauza rejetului alogrefei renale.
În momentul în care se pune problema transplantului renal se
efectuează tipizarea HLA, atât pentru primitor cât şi pentru donator, iar în etapa
a treia se efectuează testul crossmatch. Crossmatching-ul a fost dezvoltat pentru
a detecta aloanticorpii donator – specifici în serul pacienţilor care candidează
pentru un transplant renal. Folosirea tehnicilor de crossmatch sensibile, pentru a
evalua compatibilitatea primitorilor şi donatorilor de rinichi, a eliminat
fenomenul de rejet hiperacut al alogrefelor renale şi a avut o contribuţie majoră
la îmbunătăţirea supravieţuirii alogrefelor şi a pacienţilor.
Tipizarea HLA joacă un rol foarte important în transplantul renal.
Caracteristica moleculelor HLA este imensa lor diversitate la nivelul populaţiei

47
umane. Tipizarea HLA detectează şi clasifică această diversitate. De-a lungul
anilor, odată cu progresele tehnicii, au fost în mod continuu descoperite noi
molecule HLA, astfel încât în 1999 s-a trecut oficial de numărul de 1000 de
alele HLA recunoscute [2].
Identificarea alelelor HLA este, cu siguranţă, problema actuală cea mai
complexă în diagnosticul molecular.
În prezent se cunosc mai mult de 1300 alele în populaţia din întreaga
lume, la nivelul celor 12 locusuri exprimate ale clasei I şi clasei a II-a [10].
Polipeptidele codificate de către aceste alele diferă una de alta prin una
sau mai multe substituţii aminoacidice care sunt de fapt mutaţii cu sens greşit
(missens) [30].
Nu există alte locusuri genetice umane mai polimorfe decât locusurile
HLA. De exemplu, locusul HLA-B are mai mult de 400 de alele cunoscute [30].
În prezent este cunoscută secvenţa genomică completă a MHC [26].
MHC conţine mai mult de 200 de gene, iar dintre acestea mai mult de
20 de locusuri codifică proteine implicate în legarea şi prezentarea produselor
de degradare peptidice ale proteinelor la receptorul antigenic al celulei T.
Astfel, MHC participă la diferite nivele în procesarea peptidelor
antigenice şi la prezentarea acestora [24]. În completarea genelor HLA
exprimate, există numeroase pseudogene de clasa I şi clasa a II-a care sunt
localizate în complexul major de histocompatibilitate. Aceste pseudogene pun
probleme dezvoltării metodelor moleculare de tipizare HLA, deoarece este
necesar a tipiza genele exprimate fără a fi posibil a se detecta şi pseudogenele
apropiat înrudite. Foarte rar prezenţa unei pseudogene poate duce la ambiguităţi
ale tipizării moleculare HLA.
Numărul de alele cunoscute, coresunzătoare unei specificităţi
particulare, variază de la 1 la mai mult de 50 [2]. Avantajul imens al metodelor
de tipizare HLA moleculare este că depistează alături de alelele exprimate şi
alelele nule, silenţioase sau puţin exprimate. Relaţia între specificităţile
serologice şi tipurile moleculare nu este întodeauna directă (Fig.9). De exemplu,
multe alele recent descoperite nu au fost tipizate prin metode serologice şi de
aceea nu au specificitatea serologică definită.
În contrast faţă de metodele de tipizare serologice, tipizarea HLA
moleculară poate detecta orice secvenţă nucleotidică polimorfă. Aceasta
furnizează oportunitatea de a performa tipizare HLA la diferite nivele de
rezoluţie începând de la grupuri de alele până la alele idividuale.

48
 Tipizarea care defineşte grupuri de alele, în mod curent aproximând
specificităţile serologice, este considerată de rezoluţie joasă sau generică (de
exemplu, HLA-DRB1-04). Tipizarea prin metode care rezolvă toate alelele
cunoscute este considerată de înaltă rezoluţie (de exemplu, HLA-DRB1*0401).
Tipizarea care rezolvă tipurile HLA dincolo de specificităţile serologice, dar nu
atinge nivelul alelic, este descrisă ca tipizare de rezoluţie medie (de exemplu,
HLA- DRB1– 0401/09/13/16/21/26/33).
Complexitatea deosebită este cauzată de diferenţele dintre tipizările
HLA moleculare şi există o nevoie crescândă continuă, de a actualiza
interpretarea datelor de tipizare moleculare ca şi numărul de alele HLA
cunoscute.
Câteva metode moleculare detectează secvenţele cheie polimorfe şi
folosesc aceste date pentru a depista alelele. Interpretarea acestor date este
influenţată de baza de date a secvenţelor HLA folosită pentru interpretarea
acestor rezultate.
Preponderenţa mare a polimorfismului de la nivelul genelor clasei I şi a
II-a are loc în exonii care codifică α1 şi α2 la clasa I (exonii 2-3) şi α1 şi β1 la
clasa aII-a, (exonul 2), domenii care leagă peptidele procesate [18].
Anumite poziţii ale nucleotidelor la nivelul acestor exoni sunt
invariabile, altele pot avea două, trei sau chiar patru din bazele existente ca
posibilităţi. Astfel, anumiţi codoni sunt constanţi pe când alţii expun variate
grade de variabilitate. Având în vedere că exonii polimorfi sunt relativi scurţi în
lungime (aproximativ 250 nucleotide) ei pot fi uşor amplificaţi în PCR pentru
studii de diagnostic molecular.
De exemplu, toate alelele DRB1 au codificată glicina la poziţia 20 pe
când alte alele pot codifica glicina, valina sau acidul aspartic la nivelul
codonului 86. Cele 289 de alele DRB1 apar din multiplele combinaţii posibile
ale acestor polimorfisme [3].

EVALUAREA ANTICORPILOR CITOTOXICI

Screening-ul anticorpilor citotoxici prin metoda limfocitotoxicitătii

dependente de complement

Screening-ul anticorpilor anti HLA este folosit pentru a detecta prezenţa

acestora la pacienţii care sunt candidaţi pentru transplant renal. Screening-ul a
fost în mod tradiţional, performat folosind metoda limfocitotoxicitătii
dependente de complement.

49
 Cele mai multe laboratoare evaluează lunar, din punct de vedere al
screening-ului anticorpilor citotoxici, pacienţii aflaţi pe listele de aşteptare.
Serurile fiecărui pacient sunt testate pentru prezenţa anticorpilor împotriva unui
panel de celule care conţin cele mai frecvente tipuri HLA în populaţia
donatoare, prezentă la nivelul unor diferite combinaţii de HLA-A şi B (sau DR
şi DQ pentru clasa II), pentru a permite determinarea specificităţilor
aloanticorpilor [13]. Formatul poate fi astfel gândit ca un test în masă pentru
toţi pacienţii sau un test pentru un singur pacient. Procentul de anticorpi ,ca
panel (PRA), este calculat ca procent al numărului de celule pozitive faţă de
numărul total de celule din panel, multiplicat cu 100.
PRA este indicatorul imunizării pacientului faţă de HLA. Trebuie
menţionat că specificitatea anticorpilor din serurile cu un PRA înalt nu poate fi
determinată, de cele mai multe ori. Anumite proceduri cum ar fi diluţia serurilor
sau ambele, se pot utiliza pentru a determina identificarea anticorpilor.

Screening-ul anticorpilor citotoxici prin metoda ELISA

Recent a fost dezvoltată o metodă foarte sensibilă de fază solidă pentru

detecţia anticorpilor anti-HLA folosind tehnica ELISA. Preparate purificate ale
antigenelor HLA sunt peliculizate pe plăcuţe de plastic şi sunt utilizate pentru a
capta anticorpii anti-HLA din serul pacienţilor.
În acest fel se evită folosirea celulelor cu întregul lor complex de
markeri de suprafaţă. Reacţiile fals pozitive, datorate legării anticorpilor la
antigenele non HLA, sunt evitate prin folosirea acestei tehnologii. Antigenele
HLA purificate, cu afinitate, sunt izolate din plăcuţe sanguine sau din liniile
celulare limfoblastoide, cumulate şi fixate la baza godeului din plăcuţa de
plastic în care are loc testul. Antigenele derivate din placuţele sanguine sunt
numai HLA de clasa I, pe când antigenele din liniile celulare limfoblastoide pot
fi de clasa I, de clasa II sau combinaţii ale ambelor tipuri de antigene [19].
Avantajele testului ELISA, faţă de testul convenţional de limfotoxicitate
dependentă de complement, includ procesarea rapidă şi uşoară a mai multor
probe, prin cititoare automate de plăcuţe, şi eliminarea dependenţei testului de
viabilitatea limfocitelor şi a complementului [22].
Serul pacientului este incubat în godeul plăcuţei respective unde orice
anticorp anti-HLA de aviditate adecvată se leagă de antigenul fixat. După
îndepărtarea anticorpilor nelegaţi este adăugat un anticorp cuplat cu o enzimă
care este direcţionat împotriva IgG uman. Adăugarea substratului enzimatic
conduce la dezvoltarea reacţiei de culoare în cazul testelor pozitive.

50
 Formatul de interpretare a citirii rezultatelor pentru detecţia anticorpilor
citotoxici prin tehica ELISA poate fi, fie pozitiv (anticorpi prezenţi ), fie
negativ (anticorpi absenţi). Nu se calculează PRA, iar testul de identificare a
anticorpilor citotoxici în cazul reacţiei pozitive, se efectuează tot prin tehnica
ELISA şi are o valoare diagnostică pretransplant deosebit de importantă.
De exemplu, este important de ştiut dacă primitorul aflat pe lista de
aşteptare este imunizat şi dacă anticorpii citotoxici identificaţi sunt identici cu
alelele HLA ale potenţialului său donator de rinichi.
În acest caz, testul crossmatch va fi clar pozitiv iar pericolul unui rejet
acut, imediat în perioada post-transplant, este iminent.
Testul ELISA este formulat numai pentru detecţia anticorpilor HLA de
tip IgG. În consecintă, testul ELISA standard nu poate detecta anticorpii
citotoxici de tip IgM şi anticorpii non-HLA dar detectează anticorpii IgG
nefixatori de complement pe care testele de citotoxicitate îi omit.
Testul ELISA poate eşua în a detecta un anticorp cu specificitate pentru
un antigen HLA rar, care poate fi absent sau la nivele foarte scăzute în cumulul
de antigene. Recent au fost dezvoltate teste ELISA capabile să identifice şi
anticorpii de tip IgM.
În rezumat, principiul metodei de lucru pentru screening-ul
anticorpilor citotoxici de clasa I şi aII-a prin metoda ELISA este: serul
pacientului este adăugat în godeuri căptuşite cu glicoproteine HLA clasa I,
respectiv clasa aII-a, permiţând anticorpilor să se lege (dacă sunt prezenţi).
Anticorpii nelegaţi sunt apoi spălaţi. Se adaugă în godeuri un reactiv ce
conţine globulină anti-umană (anti-IgG) cuplată cu fosfatază alcalină şi se
incubează. Anticorpii anti-IgG nelegaţi sunt apoi spălaţi şi se adaugă substratul
PNPP (p-nitrofenil fosfat). După 30 de minute de incubare reacţia este oprită
adăugând soluţie de hidroxid de sodiu. Densitatea optică a probelor este
măsurată cu un spectrofotometru.
Interpretarea rezultatelor screening-ului pentru ANTICORPII anti-HLA
clasa I şi clasa AII-A este:

 Rezultatele cu absorbanţă mai mare sau egală de 2 ori decât media

controalelor negative sunt POZITIVE.

Notă: diferenţele de citire între absorbanţe pentru duplicatele rezultatelor nu

trebuie să fie mai mari de 20%. Pentru a nu interfera citirea, pe spatele plăcii
nu TREBUIE SĂ existe urme de reactivi sau urme de talc.

51
Identificarea anticorpilor citotoxici prin metoda ELISA

Metoda de identificare a anticorpilor anti HLA clasa I şi aII-a prin tehnica

ELISA are, ca principiu de lucru următoarele etape:
1. Serul pacientului este adăugat în godeuri căptusite cu
glicoproteine HLA clasa I, respectiv clasa aII-a, permiţând
anticorpilor să se lege (daca sunt prezenţi).
2. Anticorpii nelegaţi sunt apoi spălaţi.
3. Se adaugă în godeuri un reactiv ce conţine globulină anti-umană
(anti-IgG) cuplată cu fosfatază alcalină şi se incubează.
4. Anticorpii anti-IgG nelegaţi sunt apoi spălaţi şi se adaugă
substratul PNPP (p-nitrofenil fosfat).
5. După 30 de minute de incubare reacţia este stopată adăugând
soluţie de hidroxid de sodiu.
6. Densitatea optică a probelor este măsurată cu un
spectrofotometru.
Interpretarea rezultatelor: Pentru identificarea anticorpilor anti-HLA clasa
I, validarea rezultatelor este efectuată dacă:
 media controalelor negative < 0,225
 media controalelor pozitive > 0,900
Pentru identificarea de anti-HLA clasa a II-a, validarea rezultatelor
este efectuată dacă:

 media controalelor negative < 0,225

 media controalelor pozitive > 1,000

Atât pentru identificarea de anti-HLA de clasa I cât şi anti-hla clasa aII-a,

rezultatele cu valoarea densităţi optice egal sau mai mare decât valoarea prag
(cut off) sunt considerate pozitive [27].

Numãr rezultate pozitive  100

%PRA 
numãr de godeuri continand antigene HLA de clasa I

Numãr rezultate pozitive  100

%PRA 
numãr de godeuri continand antigene HLA de clasa II

52
 Fig. 18. Principiul metodei ELISA pentru detecţia anticorpilor citotoxici

SCREENING -UL ANTICORPILOR CITOTOXICI PRIN METODA LUMINEX

Odată cu creşterea numărului de pacienţi de pe lista de aşteptare, se

pune problema identificării anticorpilor citotoxici pentru a evalua şansele
acestor pacienţi de a efectua transplantul renal în condiţii imunologice de
siguranţă.
Sistemul multiplex Luminex poate fi folosit atât pentru screening-ul cât şi
pentru identificarea anticorpilor citotoxici având o sensibilitate şi o specificitate
performantă.
Principiul acestei noi tehnologii este capacitatea de a măsura simultan
analiţi multiplii într-un singur godeu de reacţie.
Cu tehnologia Luminex, reacţiile moleculare au loc pe suprafaţa
seturilor de microsfere colorate codificat, folosind un amestec de 2 coloranţi
fluorescenţi de intensitate diferită.
Microsferele acţionează ca purtători moleculari care capturează o probă
şi apoi sunt etichetate cu un raportor fluorescent care se leagă la proba capturată
de pe microsferă. Microsferele sunt apoi transferate într-un instrument care
foloseşte microfluide pentru a le alinia într-un singur şir care va trece printre
două lasere. Un laser luminează culorile din interiorul microsferei, pentru a
identifica bila care va fi citită, şi al doilea laser excită culoarea de pe suprafaţa
bilei. Printr-o tehnică optică avansată sunt captate semnalele de culoare şi
procesarea digitală a semnalelor este translatată, în timp real, în date cantitative
pentru fiecare reacţie [20].

53
 Fig. 19. Tehnologia Luminex de identificare a anticorpilor

Comparând Luminex-ul cu alte metodologii folosite pentru screening-ul

anticorpilor (cum sunt CDC-AHG, ELISA şi flowcitometrie), a fost relevat
faptul că sensibilitatea acestei metode este comparabilă cu cea a flowcitometriei
[14] (tabelul 3).
Tabelul nr. 3. Comparaţie între metodele actuale folosite pentru detecţia anticorpilor
citotoxici

Metodă Anticorpi detectaţi / total %

CDC-AHG 12 / 66 18

ELISA 32 / 66 48

Luminex 44 / 66 67

Flowcitometrie 48 / 66 73

Prin tehnica Luminex se pot lucra deodată 96 de probe, astfel încât, se

poate face screening-ul şi identificarea anticorpilor pe o singură placă, ceea ce
înseamnă eficienţă maximă în testarea pacienţilor [14].

54
 ANTICORPII ANTI HLA

Ion Maruntelu, Ileana Constantinescu

Dezvoltarea metodelor sensibile pentru detectarea anticorpilor a

constituit un progres semnificativ în transplantul de organe solide.
Anticorpul specific anti HLA donator (DSA), prezent fie în momentul
transplantului, fie apărut de novo posttransplant, reprezintă un factor de risc atât
pentru rejetul mediat de anticorpi (RAM) cât şi pentru pierderea alogrefelor în
aproape toate tipurile de transplanturi de organe. [15-20] Înţelegerea
complexităţii şi limitărilor tehnicilor de detectare a DSA este esenţială pentru
realizarea unei evaluări exacte a riscurilor, îmbunătăţind în acelaşi timp accesul
la transplant.
Evaluarea iniţială a unui potenţial primitor de transplant renal implică
tiparea HLA atât a donatorului cât şi a beneficiarului, screeningul pentru
anticorpi anti HLA şi identificarea unui eventual istoric de evenimente
sensibilizante (transplant anterior, transfuzie de sânge şi / sau sarcină). Testarea
HLA include în mod ideal locusurile A, B, C, DRB1, DQB1, DQA1 şi DPB1;
dar acest lucru nu este realizat întotdeauna.
Screeningul de anticorpi anti HLA utilizând tehnologia de citometrie în
flux [LAB screen (One Lambda) sau LifeScreen (LifeCodes-Immucor)] este cel
mai frecvent test efectuat la momentul inscrierii pacienţilor pe listele de
transplant. Mulţi pacienţi- mai ales în absenţa unui eveniment sensibilizant - au
anticorpi anti HLA puţini sau deloc detectaţi. Aceşti pacienţi nu necesită, de
obicei, alte investigaţii. Cu toate acestea, dacă testul de screening este pozitiv
(sugerând prezenţa anticorpilor anti HLA) este necesară o evaluare
suplimentară pentru identificarea lor.

TESTUL DE SCREENING AL ANTICORPILOR ANTI HLA

Produsele LabScreen şi LifeScreen utilizează microsfere acoperite cu

antigene HLA purificate de clasă I sau de clasă II şi reactivi optimizaţi în prealabil,
pentru detectarea anticorpilor HLA de clasă I sau de clasă II, în serul uman.

Principiul testului de screening al anticorpilor anti HLA

Serul testat este mai întâi incubat cu bilele LABScreen sau LifeScreen.
Anticorpii anti-HLA prezenţi eventual în serul testat se leagă de antigenele de
pe bile şi apoi sunt marcaţi cu IgG antiumane de capră conjugate cu R-
ficoeritritină (PE). Analizorul (analizoarele) în flux Luminex detectează

55
simultan emisia fluorescentă de PE şi urma colorantului din fiecare bilă,
permiţând achiziţii de date aproape în timp real sub forma Intensităţii Medii a
Fluorescenţei (MFI). Pentru a atribui specificitatea HLA, modelul de reacţie al
serului testat este comparat cu fişa de lucru specifică lotului, definind ordinea
antigenelor. Valoarea cut-off a MFI folosită pentru a distinge un screening
negativ de unul pozitiv este stabilită la nivel de centru de testare. Un MFI mai
mic de 1500 este considerat de obicei negativ la nivelul centrului nostru de
testare.
Dacă testul de screening este pozitiv este necesară o evaluare
suplimentară pentru identificarea anticorpilor.
LABScreen sau LifeScreen detectează atât anticorpii IgG cu legare de
complement cât şi cei fără legare de complement. Cu toate acestea, IgM (care
este de asemenea eficace pentru legarea complementului) nu este detectată prin
LABScreen sau LifeScreen (care utilizează anti-IgG-PE ca cel de-al 2-lea
anticorp).
În ultimii ani, au fost dezvoltate teste care permit identificarea acelor
anticorpi capabili sa activeze complementul (testul C1q screen).
Testul C1q screen: C1q screen este destinat pentru detectarea
anticorpilor anti-HLA cu legare de complement în serul uman.

Principiul testului C1q screen

Setul C1qScreen este utilizat cu un amestec de bile acoperite cu HLA
pentru detectarea anticorpilor anti-HLA cu legare de complement în serul uman.
Microbilele LABScreen® acoperite cu HLA şi bilele de control pozitiv C1q
complement uman sunt incubate cu ser uman şi C1q complement uman.
Anticorpii anti HLA se leagă de antigenele ţintă după care urmează ataşarea
C1q la acei anticorpi care leagă complementul. C1q anti-uman conjugat cu PE
este utilizat ca raportor pentru a indica prezenţa anticorpilor care leagă
complementul. Bilele sunt analizate utilizând un instrument Luminex.
Intensitatea fluorescenţei (IF) măsurată pe oricare dintre dispozitivele Luminex
indică o cantitate relativă de anticorpi legaţi de proba testată. O modificare
semnificativă a fluorescenţei indică o relaţie pozitivă.

SINDROAME MEDIATE DE ANTICORPI

Primul sindrom mediat de anticorpi recunoscut clinic în era modernă a

transplantului a fost descris în 1968 în lucrarea de referinţă a lui Terasaki şi
Patel [21]. Într-un studiu efectuat pe 225 de pacienţi cu transplant renal, în care
32 au avut o disfuncție primară a grefei, 24 din 32 au prezentat dovezi ale unui
factor circulant în serul receptor care a cauzat citotoxicitate dependenta de
complement (CDC) a limfocitelor donatoare, comparativ cu doar 6 din 193 cu

56
funcţie primară de grefă care au avut acest factor. Prezența acestui factor
circulant a fost asociat cu rejetul hiperacut în care tromboza intravasculară şi
necroza apar aproape imediat după reperfuzia grefei. Factorul circulant descris
acum este cunoscut a fi anticorpul anti donor, în majoritatea cazurilor,
anticorpul anti-HLA. Testul CDC utilizat în acest studiu, cu modificări relativ
reduse în ultimii 37 de ani, a constituit baza pentru testul cross-match.
Recunoașterea acestui sindrom mediat de anticorpi şi testul cross-match de a
prezice apariţia acestuia dacă este pozitiv au eliminat virtual posibilitatea
apariţiei unui rejet hiperacut în transplantul modern. Rejetul se referă la
activarea sistemului imunitar al receptorului împotriva alogrefei şi, în funcție de
timpul scurs şi de prezentarea clinică, poate fi clasificat ca fiind subclinic, acut
sau cronic. Rejetul subclinic apare atunci când biopsia renală arată prezenţa
descoperirilor histologice ale rejetului acut fără deteriorare clinică. Rejetul acut
se dezvoltă în decurs de câteva zile şi are ca rezultat o scădere bruscă a funcţiei
renale în asociere cu modificări histopatologice specifice inflamaţiei acute.
Rejetul cronic, totuşi, se caracterizează prin atrofie tubulară şi fibroză
interstiţială în contextul clinic al unui declin lent al funcției renale de-a lungul
lunilor sau anilor.
Utilizarea tehnicii imunoperoxidazei pentru evidenţierea C4d ca
„marker” al activităţii anticorpilor într-o grefă a permis definirea unor
sindroame mai specifice mediate de anticorpi atât în perioadele post-transplant
precoce, cât şi în cele tardive.

ROLUL ANTICORPILOR ÎN REJETUL ACUT

În 1990 Halloran şi colab [22] au raportat pentru prima oară că anticorpii

circulanți pot exercita un rol în patogeneza respingerii acute în plus faţă de
citotoxicitatea celulară care a fost deja bine descrisă şi recunoscută. Într-o serie de
64 de pacienţi, anticorpi anti-HLA clasa I au fost prezenţi în serurile a 100%
dintre pacienţii cu rejet acut, cu modificări histologice de capilarită peritubulară şi
leziuni vasculare, comparativ cu doar 41% dintre pacienţi fără histologie similară.
Raportarea ulterioară a depunerilor de C4d în capilarele peritubulare la pacienţii
la care a fost demonstrat rejetul celular a permis definirea şi rafinarea ulterioară a
constatărilor histologice asociate cu rejetul acut mediat de anticorpi (AAMR).
C4d, ca indicativ al AAMR, este prezent în aproximativ 50% dintre pacienţii cu
biopsie din cauza disfuncției renale şi în până la 32% din biopsiile care
demonstrează rejet acut [23]. Prezenţa C4d în AAMR este puternic corelată cu
anticorpul circulant specific donatorului detectat în serul primitorului, cu
sensibilitate şi specificitate de 95%, şi este superior histologiei singulare, cu
sensibilitate şi specificitate de 68 şi respectiv 96% [23].

57
 Prezenţa C4d ca marker al activităţii anticorpilor corespunzători este
asociată cu un risc mai mare de rejet acut, independent de alţi predictori
cunoscuţi ai rejetului. Herzenberg şi colab. [24] au arătat că, independent de
severitatea rejetului celular, 70% dintre cei cu C4d pozitiv au grefa functională
la 1 an comparativ cu 90% din grupul C4d negativ, cu rezultate similare
raportate de alte grupuri [25,26]. Având în vedere dovezile care leagă rezultate
clinice mai adverse cu rezultatele histologice sugestive ale activităţii
dependente de anticorpi şi cu C4d care susţine legătura dintre anticorpul
circulant şi afectarea ţesuturilor observate, rejetul umoral acut a fost diferenţiat
de rejetul celular, conform actualizării criteriilor Banff din 1997 în 2003 [27].

ROLUL ANTICORPILOR ÎN REJETUL CRONIC ŞI GLOMERULOPATIA DE

TRANSPLANT

Acțiunea anticorpilor asupra alogrefelor joacă, de asemenea, un rol

important în patogeneza glomerulopatiei de transplant, precum şi în rejetul
cronic definit clasic. Rejetul cronic rămâne o problemă semnificativă după
transplant, în ciuda îmbunătăţirii diagnosticului şi a tratamentului rejetului
celular acut (clinic şi subclinic). Rejetul cronic ar trebui diferenţiat de alte cauze
ale disfuncției cronice a alogrefelor (inclusiv medicamente, ischemie,
îmbătrânire etc.), iar studiile recente confirmă faptul că atât anticorpii circulanți,
cât şi cei intragraft sunt într-adevăr asociaţi puternic cu procesele histologice
care sunt în concordanţă cu rejetul cronic. Prezenţa capilară peritubulară a C4d
este asociată cu anticorpi circulanți în biopsii care demonstrează histologie de
rejet acut şi cu anticorpi circulanți în 21 până la 85% din biopsiile care prezintă
modificări cronice ale rejetului, în comparaţie cu 0 până la 22% din biopsiile
care demonstrează leziuni cronice neimune [26]. Mai mult, rejetul cu coloraţie
pozitivă C4d este mai susceptibil de a duce la rejet cronic (32 până la 44%)
comparativ cu cele care sunt negative C4d (8 până la 14%) [29].
Glomerulopatia de transplant este o complicaţie tardivă post-transplant
la aproximativ 3 până la 8% dintre primitori, caracterizată clinic prin
proteinurie de nivel nefrotic şi patologic prin dublarea membranei bazale
glomerulare şi a membranei bazale capilare peritubulare multistrat, posibil
indicator al valurilor repetate de leziune. În seriile de biopsii de alogrefe care
demonstrează diferite boli glomerulare, depunerile de C4d pot fi observate până
la 25% cu glomerulopatie de transplant şi dublarea membranei bazale
glomerulare şi a membranei bazale capilare peritubulare multistrat, în timp ce
C4d este negativ în alte glomerulopatii de alogrefă [30]. Pozitivitatea C4d nu
numai că este asociată cu respingerea cronică şi glomerulopatia de transplant, ci
şi o prezice. Regele şi colab. [28] au demonstrat că în biopsiile din primul an,

58
prezenţa C4d a fost un predictor puternic al glomerulopatiei ulterioare după 12
luni (46% comparativ cu doar 6% în grupul de control). Mai mult, anticorpii
anti HLA nu au fost găsiţi în eluatele de biopsie ale transplanturilor bine
tolerate, susţinând puternic rolul patogen al anticorpului anti-HLA specific
donatorului în rejetul cronic şi nefropatia cronică a alogrefelor. Prin urmare,
analog noilor criterii aprobate pentru rejetul umoral acut, leziunile cronice
mediate de anticorpi sunt recunoscute ca entităţi distincte şi sunt în prezent
adăugate la criteriile Banff pentru rejetul de grefă cronic mediat de anticorpi.

IMPORTANŢA ANTICORPILOR ANTI DONORI CIRCULANȚI

Multe mecanisme de acțiune ale anticorpilor care duc la o eventuală

pierdere a grefei sunt sugerate atât de această imprevizibilitate a duratei
anticorpului înainte de rejet cât şi de variaţia sindroamelor clinice care preced
această rejet. În 2004, a fost descris un model cu patru etape teoretice ale
acţiunii anticorpilor, fiecare dintre acestea fiind o cerinţă pentru următoarea. În
acest model, prima dovadă a activării anticorpilor este reprezentată de detecţia
anticorpilor anti donor circulanţi. Anticorpii posttransplant sunt mai susceptibili
de a fi prezenţi la femei, pacienţii cu antecedente semnificative de transfuzii,
pacienţii cu anticorpi pre-transplant şi pacienţii cu disfuncție a grefei [31].
Detectarea lor poate fi subestimată de sensibilitatea testului utilizat, de
incapacitatea testelor în fază solidă de a detecta anticorpi non-HLA care pot
avea relevanță clinică şi de adsorbiţia semnificativă de către grefă a
anticorpilor. Această ultimă ipoteză este sugerată prin examinarea eluatelor
intragraftale din nefrectomii de transplant în care 70,6% aveau anticorpi anti
donori prezenţi în grefă. Mai mult, la momentul nefrectomiei de transplant,
31,6% dintre pacienţi aveau anticorpi circulanți, dar la 4 săptămâni după aceea,
74% au prezentat anticorpi [32]. Această prezenţă a anticorpului în grefă
constituie baza etapei 2 a modelului propus în care C4d este detectabil în
sistemul microvascular fără disfuncţie a grefei. În stadiul 3, în plus faţă de C4d,
există modificări patologice în concordanţă cu deteriorarea mediată de anticorpi
şi, în stadiul 4, este prezentă disfuncţia grefei. Cu toate că fiecare etapă este o
condiţie prealabilă pentru următoarea, progresul prin toate etapele nu este
cunoscut ca fiind inevitabil. Cu toate acestea, este un model important care
facilitează definiţii mai precise ale proceselor mediate de anticorpi şi permite
dezvoltarea de intervenţii specifice etapelor şi strategii de tratament.
În ultimii ani, a existat un interes din ce în ce mai mare pentru leziunile
mediate de anticorpi la pacienţii cu transplant renal. Acest interes a fost stimulat
de capacitatea îmbunătăţită de a detecta activitatea anticorpilor prin evidenţierea
C4d, precum şi dezvoltarea de metode din ce în ce mai sensibile pentru

59
detectarea anticorpilor circulanți. S-a constatat că leziunea determinată de
anticorpu este asociată atât cu tipurile de leziuni acute, cât şi cu cele cronice,
deşi nu este clar dacă unele dintre leziunile mediate umoral care sunt raportate
în prezent au fost întotdeauna prezente, dar nedetectate sau reprezintă un
răspuns umoral sporit cauzat de modificările medicamentelor imunosupresoare.
Fără îndoială, aceasta va continua să fie un domeniu de mare interes în ceea ce
privește înţelegerea deplină a mecanismelor leziunilor mediate de anticorpi,
precum şi a potenţialului de intervenţie clinică.

TESTUL CROSSMATCH

Scopul testului crossmatch este de a detecta prezenţa, în serul

pacienţilor, a anticorpilor direcţionaţi împotriva antigenelor HLA ale
potenţialului donator de rinichi. Dacă sunt prezenţi, anticorpii semnalizează că
sistemul imun al primitorului a fost sensibilizat faţă de alelele donatorului şi
este susceptibil a rejeta puternic orice alogrefă ce poartă respectivele antigene.
La nivelul rinichiului transplantat, ţinta principală a acestor anticorpi
sunt antigenele HLA de pe endoteliul vascular al capilarelor şi arteriolelor.
Complexele antigen HLA – anticorp de pe endoteliu activează
complementul şi duc la distrugerea celulară, apoi, plăcuţele agregate, eventual
producând cheaguri de fibrină care îngustează vasele, cauzează necroza
ischemică.
Chiar şi titrul scăzut de anticorpi, în particular cei direcţionaţi împotriva
clasei I de antigene, pot contribui la rejetul alogrefei renale.
De asemenea, un alt rol important al testului crossmatch este
performanţa de sensibilitate şi specificitate pentru antigenele HLA.
Testul crossmatch prin metoda limfocitotoxicităţii
Un test crossmatch simplu poate fi performat prin metoda citotoxicitătii
clasice utilizând drept ţintă limfocitele din sângele periferic al donatorului.
Acest tip de crossmatch este folosit curent ca şi evaluare preliminară pentru
potenţialii donatori vii înrudiţi pentru transplant de alogrefă renală. Limfocitele
din sângele periferic sunt aproximativ 80% celule T care poartă numai antigene
HLA de clasa I şi 20% celule B şi monocite care poartă atât antigene HLA de
clasa I cât şi de clasa aII-a.
Un rezultat crossmatch intens pozitiv, prin citotoxicitate dependentă de
complement (CDC) (50% sau mai mult, celule moarte per godeu), indică în
mod clar prezenţa anticorpilor anti-HLA de clasa I.

60
 Astfel, 10-20% din moartea celulară poate rezulta dintr-un anticorp
specific pentru clasa aII-a sau se poat datora unui anticorp slab anti clasa I.
Pentru a rezolva specificitatea anticorpilor, crossmatch-ul este performat apoi
pe preparate celulare îmbogăţite atât cu limfocite T cât şi B.
Testul crossmatch pentru celula T
Crossmatch-ul pentru celula T se performează la temperatura camerei
dar şi la 370C în anumite laboratoare pentru a evita legarea anticorpilor reactivi
la rece, presupuşi a fi autoreactivi. Un test crossmatch pozitiv pe celula T,
prin orice metodă, contraindică transplantul renal indiferent cât de slab
este nivelul de reacţie. Există câteva metode pentru îmbunătăţirea sensibilităţii
testului crossmatch prin CDC pentru celula T:
1. Incubaţia extinsă pentru a creşte sensibilitatea – cea mai simplă modificare
a testului de citotoxicitate este extinderea timpului de incubare al celulelor,
serului şi complementului.
2. Etapa de spălare Amos – această metodă intercalează o etapă de spălare
după incubarea celulelor donatorului cu serul primitorului înainte de
adăugarea complementului, pentru îndepărtarea factorilor
anticomplementari din ser.
3. Globulina anti-umană - citotoxicitatea anumitor anticorpi poate fi
amplificată prin adăugarea unui anticorp, într-o etapă ulterioară, în mod
obişnuit un reactiv policlonal tip imunoglobulină anti-umană (AHG).
În rezumat, testul crossmatch pentru celula T prin metoda CDC
prezintă următoarele etape de lucru:
 1 µL din serul primitorului este dispensat în multiple godeuri ale
plăcuţei microtest; pentru pacienţii imunizaţi sunt puse în reacţie
seruri multiple cu PRA cunoscut.
 Sunt adăugate celulele T ale donatorului (2-3 x 106) şi testul este
incubat pentru 30-60 de minute.
 Pentru a creşte sensibilitatea testului, serurile sunt spălate din
godeuri înainte de adăugarea complementului.
 Adăugarea unui al doilea anticorp, cum este IgG-ul de capră
anti-uman creşte şi mai mult sensibilitatea.
 După câteva minute de incubare cu AHG, este adăugat
complementul şi testul este incubat pentru încă 60 de minute.
 Incubarea de lungă durată a complementului până la 3 ore, este
uneori performată în loc de adaugarea AHG.
 Dacă serul primitorului conţine anticorpi care reacţionează cu
celulele donatorului, celulele sunt omorâte şi colorantul (eozina
sau ethidium bromide) pătrunde în interiorul celulelor indicând
un test crossmatch pozitiv.

61
 Un test crossmatch pozitiv pentru celula T este o contraindicaţie
pentru transplantul renal.
Testul crossmatch pentru celula B
Testul crossmatch pentru anticorpi cu specificitate faţă de antigene HLA
de clasa aII-a necesită folosirea limfocitelor B ca şi ţinte şi aceiaşi timpi de
incubare extinsă ca şi la tipizarea serologică HLA DR şi DQ. Un test
crossmatch pozitiv pe celula B poate apare datorită unor anticorpi care se leagă
la antigene HLA de clasa I sau de clasa a II-a.
Mai mult, celulele B sunt un indicator mai sensibil pentru anticorpii
slabi de clasa I deoarece ei poartă molecule de clasa I într-o mai mare densitate
decât celulele T. Crossmatch-ul prin flowcitometrie poate distinge între
anticorpii B adevăraţi şi anticorpii slabi de clasa I ai unui crossmatch citotoxic
pozitiv pe celulă B.
Pentru evoluţia transplantului renal, anticorpilor preformaţi faţă de
antigenele HLA de clasa aII-a nu este clară încă semnificaţia.
Transplantul renal de succes la pacienţi cu titru scăzut de anticorpi anti
HLA clasa aII-a fost raportat, după cum a fost raportat şi fenomenul de rejet acut
al alogrefei renale în cazul titrului crescut al anticorpilor anti-HLA clasa aII-a.
Este posibil ca pierderea grefelor transplantate în cazul crossmatch-ului
negativ pe celula T şi pozitiv pe celula B să fie datorată componentelor anti-
HLA clasa I ale acestor seruri alloreactive.

Fig. 20. Chrosmatch pozitiv – NU transplant renal

62
CROSSMATCH PRIN TEHNICA ELISA PENTRU CELULA T ŞI B

ELISA foloseşte anticorpi anti-HLA de clasa I şi respectiv clasa aII-a,

care sunt peliculizate în microgodeurile plăcuţei. Ăntr-o primă etapă se pune
lizatul de limfocite extrase din sângele donatorului şi antigenul HLA vor fi
captate şi fixate în godeu de către aceşti anticorpi. Ulterior, este pus în reacţie
serul primitorului, urmat de adăugarea unui anticorp secundar anti IgG uman
cuplat cu o enzimă
Prin adăugarea substratului rezultă o reacţie de culoare a cărei
intensitate este masurata cu ajutorul cititorului ELISA. Interpretarea
rezultatelor testului este bazată pe compararea densităţilor optice ale godeurilor
de testat faţă de godeurile de control pozitiv şi negativ. [37].
Principalul avantaj constă în faptul că nu este nevoie de limfocite viabile
sau de fixare de complement, iar testul imunoenzimatic nu este confruntat cu
interferenţe ale medicamentelor citotoxice cum este globulina anti-timocite sau
muronomab OKT3 [37].
În Centrul de Imunogenetică şi Virusologie din Institutul Clinic
„Fundeni” crossmatch-ul este performat printr-un test calitativ ELISA în fază
solidă pentru detecţia anticorpilor IgG direcţionaţi către antigenele HLA din
clasa I şi aII-a specifice donatorului.
Principiul metodei de lucru

 Prepararea lizatului de limfocite ale donatorului

 Reacţia ELISA propriu-zisă (Fig.21)

Fig. 21. Crossmatch – principiul metodei ELISA

63
 Glicoproteinele HLA sunt preparate din limfocite prin solubilizarea celulelor
cu un detergent neionic. După solubilizare, lizatele de limfocite se adaugă în
godeurile în care au fost imobilizaţi anticorpi monoclonali specifici pentru HLA
clasa I şi clasa a II-a. Glicoproteinele HLA sunt lăsate să se lege de anticorpii
monoclonali şi apoi glico-proteinele nelegate sunt îndepărtate prin spălare.
 Godeurile conţinând glicoproteinele legate sunt testate cu ser uman pentru a
detecta anticorpii anti-molecule HLA. Anticorpii nelegaţi sunt îndepărtaţi prin
spălare.
 Se adaugă apoi în godeuri un reactiv anti-globulină umană (anti-IgG) marcat
cu fosfataza alcalină şi godeurile se incubează. Anti-IgG nelegat se îndepărtează
prin spălare
 Se adaugă substratul PNPP (p-nitrofenil fosfat)(Fig. 21). După 30 minute de
incubare reacţia este oprită cu soluţie de hidroxid de sodiu.
 Densitatea optică a culorii formate se masoară cu un spectrofotometru.

Interpretarea rezultatelor – Criteriul de pozitivitate

Se citesc absorbanţele la 405 sau 410 nm folosind filtrul de referinţă de

490 nm.

 Control negativ 0,300

 Control pozitiv 1,000

 Control lizat 0,900

Rezultatele care au media absorbanţelor > 2X media valorilor

controalelor negative, sunt pozitive.

CROSSMATCH PRIN METODA FLOWCITOMETRIEI

Această tehnică de lucru este între 30 - 250 de ori mai sensibilă decât
metodele serologice vizuale pentru detecţia anticorpilor anti-HLA de tip IgG.
Celulele T sunt separate electronic de celulele B, prin folosirea unui anticorp
faţă de antigene de suprafaţă ale celulelor T (cum ar fi complexul CD3-PCR,
marcat cu fluoresceină).

O poartă electronică poate fi creată astfel încât, numai celule T marcate

cu fluoresceină sunt selectate. Limfocitele donatorului sunt incubate cu serul

64
primitorului pentru a permite legarea oricăror anticorpi anti-donator. Anticorpii
legaţi la populaţia de celule T selectată sunt detectaţi prin adaugarea unui
anticorp anti IgG uman, anti Fc specific.

F(ab’)2 este cuplat cu un fluorocrom de culoare diferită de cea a

anticorpului care marchează celulele T (de exemplu verde dacă anti CD3 a fost
roşu). Flowcitometrul numără celulele T cuplate şi crează o histogramă
proiectând numărul de celule versus intensitatea fluorescenţei. Celulele
necuplate rămân lângă origine iar celulele cuplate la dreapta originii pe axa X.

O deplasare la dreapta a vârfului de celulă T, în comparaţie cu controlul

negativ, indică faptul că anticorpii anti-HLA de clasa I din serul pacientului s-
au legat de celulele T ale donatorului. Flowcitometria se poate performa şi pe
celule B legate cu anticorpi specifici acestora.

Flowcitometria este în general performată pe serul cel mai recent şi pe o

selecţie de seruri istorice, reactive, pentru toţi pacienţii aflaţi pe lista de
aşteptare pentru donatori cadavru şi care au un risc crescut de rejet (cum ar fi
alogrefa rejetată anterior, PRA înalt, donator viu înrudit cu crossmatch
serologic pe celula T negativ şi pe celula B pozitiv).

Câteodată crossmatch-ul pozitiv prin flowcitometrie apare când

crossmatch-ul serologic pe celula T şi B este negativ. Indicaţiile pentru
transplant, în aceste cazuri, rămân controversate. Există două posibile explicaţii
pentru aceste observaţii: existenţa prezenţei anticorpilor anti-HLA care nu sunt
citotoxici sau exista prezenţei anticorpilor blocanţi care interferează cu testarea.

CROSSMATCHING PRIN TEHNOLOGIA LUMINEX

Prin această metodă se poate lucra crossmatch cu sensibilitate şi
specificitate de performanţă comparabile cu cele obtinute prin flowcitometrie.
Totuşi, la ora actuală, utilizarea cea mai de succes a Luminex-ului, ca şi
cost/eficienţă şi acurateţe este pentru detecţia şi identificarea anticorpilor
citotoxici (Fig. 22).

65
 Fig. 22. Principiul tehnologiei Luminex

Crossmatch-ul pentru autoanticorpi

În evaluarea crossmatch a serului primitorului pentru compatibilitate cu

donatorul, cel mai important este să distingem anticorpii nespecifici,
antilimfocitari numiţi autoanticorpi, de anticorpii specifici anti-donator.
Prezenţa autoanticorpilor este detectată de testul auto crossmatch în care serul
pacientului şi limfocitele acestuia sunt combinate în testul standard de
citotoxicitate.
Autoaticorpii pot da rezultate fals pozitive într-un test crossmatch cu
limfocitele potenţialului donator conducând la descalificarea eronată a acelui
donator. Alternativ, anticorpii preexistenţi pot masca prezenţa anticorpilor
specifici anti-donator. Auto crossmatch-ul este performat de rutină în cazul
tuturor crossmatch-urilor cu donatori vii pentru fiecare ser care este testat.
Algoritmul corect de testare crossmatch pentru un receptor aflat pe lista
de așteptare pentru un transplant renal, constă în punerea în reacție a
limfocitelor donatorului cu serul istoric de la data precedentei evaluări și cu
serul din pre-ziua transplantului; concomitent se lucrează și testul
autocrossmatch.
Testarea pentru autoanticorpi prin flowcitometrie este, de asemenea,
recomandată în particular în cazul unui crossmatch serologic negativ cuplat cu
un test crossmatch pozitiv neaşteptat prin flowcitometrie.

66
 Rezultate de crossmatch fals pozitive, prin tehnica flowcitometrică, se
pot produce când pacientul are autoanticorpi de specificitate nedeterminată.
Astfel de autoanticorpi pozitivi prin flowcitometrie nu sunt consideraţi a fi o
contraindicaţie pentru transplantul renal.

ALGORITMUL EVALUĂRII IMUNOLOGICE ÎN TRANSPLANTUL RENAL CU

DONATOR VIU

Grupele sanguine ale donatorului şi receptorului trebuie să fie

compatibile. Tipizarea HLA ajută la selectarea celui mai adecvat donator viu
când sunt disponibili mai mulţi donatori.
Înainte de transplant se efectuează testul crossmatch pentru evitarea
fenomenului de rejet hiperacut. Un test crossmatch pozitiv exclude transplantul
renal de la acel donator.

Fig. 23. Evaluarea imunologică în vederea transplantului renal de la donator viu

67
 ALGORITMUL EVALUĂRII IMUNOLOGICE ÎN TRANSPLANTUL RENAL CU
DONATOR CADAVRU

Donatorul cadavru şi potenţialii receptori trebuie să aibe grupe sanguine

compatibile. Apoi este performată tipizarea HLA şi gradul de compatibilitate
este folosit pentru alocarea rinichilor de la cadavru.
Anumite date sugerează că prezenţa nepotrivirilor HLA care au fost
prezente într-o alogrefă anterioară (în special pentru locusul DR), poate duce la
pierderea timpurie a alogrefei renale. Astfel, ar fi înţelept să evităm astfel de
nepotriviri.
Când PRA este > 10% este prudent să efectuăm teste pentru a determina
dacă unii dintre anticorpi sunt mai mult autoreactivi decât aloreactivi.
Anticorpii autoreactivi nu cresc riscul de rejet dar cei aloreactivi cresc riscul de
pierdere a alogrefei renale. Titrul mare de anticorpi aloreactivi se datorează, de
obicei, sarcinilor anterioare, transplanturilor sau transfuziilor de sânge.
Determinarea anticorpilor citotoxici poate fi utilă în evitarea anumitor
antigene HLA. La pacienţii foarte sensibilizaţi (PRA > 50%) poate fi foarte
dificil de găsit un donator crossmatch negativ. Evitarea transfuziilor poate ajuta
ca titrul anticorpilor citotoxici să scadă în timp.

Fig. 24. Evaluarea imunologică în vederea transplantului renal de la cadavru

68
ALEGEREA UNUI DONATOR VIU VERSUS DONATOR CADAVRU PENTRU
TRANSPLANTUL RENAL

Fig. 25. Donator viu versus cadavru pentru transplantul renal

Folosirea donatorului viu pentru transplantul renal este avantajoasă

deoarece supravieţuirea alogrefei este mai bună şi este posibil transplantul
preemptiv [38]. Cel mai bun donator este, de obicei, un membru din familie.
Donatorul marginal
Deşi nu este acceptată încă o definiţie unanimă, aceşti donatori includ
persoane la vârste extreme, cu hipertensiune sau diabet sau indivizi cu un risc
crescut de transmitere a diferitelor boli. În mod surprinzător, transplantul de
rinichi de la un astfel de donator marginal duce în multe cazuri la o funcţie
renală bună la nivelul receptorului.
S-a constatat că transplantul renal dual de la donatori marginali dă
rezultate similare transplanturilor cu un singur rinichi de la donatori non-
marginali [48]. Transplantul dual nu pare să crească rata complicaţiilor
chirurgicale [48]. Sistemele de scorificare care folosec variabilele donatorului
cum sunt: vârsta, hipertensiunea arterială în antecedente, funcţia renală,
rezultatele biopsiei renale şi missmatch-ul HLA, pot furniza o abordare
cantitativă pentru furnizarea rinichilor marginali [55].

69
Donatori non-heart-beating

Principala problemă legată de transplanturile renale de la acest tip de

donatori este rata crescută de funcţie renală întârziată şi de nefuncţionare primară
comparativ cu rinichii provenind de la donatori cadavru heart-beating [40].

EFECTUL SURSEI DONATORULUI ASUPRA SUPRAVIEŢUIRII ALOGREFEI

Comparaţia între primitorii de rinichi cu diferite surse de donatori, la 3

ani de supravieţuire a alogrefelor renale, a arătat că cea mai bună supravieţuire
a fost observată la cei cu donatori frati, HLA identici [38].
Grefele provenite de la soţi sau soţii şi alţi donatori vii neînrudiţi au
supravieţuit la fel ca şi grefele provenite de la părinţi, toate supravieţuind mai
mult în comparaţie cu grefele provenite de la donatori cadavru [38].

Fig. 26. Impactul sursei donatorului asupra supravieţuirii alogrefei

renale de la donori vii înrudiţi

Aceste date au încurajat centrele de transplant renal pentru a face cât

mai multe transplanturi de la donatori vii, în acest fel evitând şi lunga aşteptare
pentru un donator de rinichi cadavru.

70
EFECTELE POTRIVIRII HLA ASUPRA SUPRAVIEŢUIRII ALOGREFEI RENALE
PROVENITE DE LA UN DONATOR VIU

Fig. 27. Impactul potrivirii HLA asupra supraviţuirii grefei renale de la donatori vii
înrudiţi

Supravieţuirea alogrefei este cea mai bună pentru alogrefe HLA identice
de la fraţi şi este urmată apoi de alogrefe cu un singur haplotip nepotrivit.
Important este că timpul de înjumătăţire (T½) al grefelor care supravieţuiesc la
cel puţin un an este proporţional cu gradul de matching. Această informaţie
poate fi folosită împreună cu alţi factori pentru a selecta cel mai adecvat
potenţial donator de rinichi [59].

MATCHING-UL IMUNOLOGIC: CONCEPTUL DE MATCHING ÎN TRANSPLANTUL

RENAL

Influenţa pozitivă a potrivirii HLA asupra supravieţuirii grefei renale a

fost demonstrată timp de mai bine de 25 de ani [38, 43, 63]. În practică, gasirea
unui donator de rinichi cu zero missmatch HLA este extrem de rară. De aceea,
eforturile se concentrează pentru găsirea unui donator cu minimum de
nepotriviri HLA sau, se merge mai departe, până spre limita maximă de
nepotriviri, astfel încât să putem avea, totuşi, un matching HLA optim.

71
 În acest sens, de exemplu, între 1988 şi 1996 programele de transplant
renal ale Eurotransplant au mers pe minimă potrivire pentru cel puţin un antigen
HLA-B şi un antigen HLA-DR.
Chiar şi în prezent, multe programe continuă să folosească aceste cerinţe
minime pentru potrivirea HLA aşa cum reiese din profilul de matching HLA al
programului de alocare de rinichi al Eurotransplant [41].
În mod regretabil nu există încă un consens general despre definiţia a
ceea ce înseamnă un donator inacceptabil HLA.
În orice caz, anticorpii citotoxici detectaţi în serul actual al pacientului
identifică antigenele HLA de clasa I inacceptabile ale donatorului şi
prognozează un crossmatch pozitiv care este testul final înainte de transplant.
Relevanţa anticorpilor pentru urmatoarele aspecte este controversată:
1) antigenele HLA de clasa a II-a;
2) antigenele HLA de clasa I care au fost identificate numai în serurile istorice
ale pacientului;
3) antigenele HLA ale donatorului care au fost nepotrivite în cazul unui
transplant anterior, dacă acest lucru este aplicabil.
Toate aceste restricţii imunologice afectează aproximativ 30% din
pacienţii aflaţi pe lista de aşteptare a Eurotransplant [41].
În mod ideal ar trebui considerat un index de potrivire şi pentru antigenele HLA
inacceptabile ale donatorului.
Matching-ul imunologic este relevant numai când există un număr
suficient de mare de donatori [63]. Cu cât sunt mai mulţi donatori cu atât este
mai mare şansa unui matching bun, prin aceasta înţelegând o potrivire de 50%
pentru alelele HLA-A, B şi DR.
Orice politică de a maximiza numărul de zero missmatch-uri HLA-A, B,
DR ar trebui să acţioneze pe un număr cât mai mare de donatori posibili.
Acelaşi lucru trebuie să se aplice şi pentru pacienţii înalt sensibilizaţi.
În anii recenţi, progrese mari s-au efectuat prin potrivirea HLA la nivel
de alelă [39]. De asemenea, trebuie menţionat că mulţi primitori de alogrefă
renală cu nepotriviri HLA continuă să aibă o funcţie bună mulţi ani după
transplant, sugerând că anumite nepotriviri HLA sunt totuşi acceptate [40].

72
 În timpurile testării serologice HLA un ser cu PRA înalt era considerat a
fi compus din mulţi anticorpi anti-HLA. Mai târziu s-a observat că serul
pacienţilor înalt sensibilizaţi aşteptând un transplant renal era, în general,
compus dintr-un număr mic de anticorpi direcţionaţi faţă de antigenele publice,
denumite şi CREGs şi mai puţin din anticorpi multipli, fiecare reacţionând cu
un antigen HLA specific convenţional. Mai mult, frecvenţa CREGs era mult
mai mare, 35% până la 88%, faţă de cele mai comune antigene HLA-A şi B.
Prin interferenţă potrivirea pentru antigenele donatorului şi receptorului incluse
în acelaşi CREG, respectiv potrivirea CREG, poate duce la un număr mai mare
de transplanturi potrivite şi la un nivel mai redus de sensibilizare a pacienţilor
având grefe repetate. În completare, datorită includerii unor antigene private
HLA-A şi B în cadrul aceleaşi CREG, un număr de antigene rare pot fi potrivite
mult mai uşor, oferind posibilitatea unei supravieţuiri alogrefei mult
îmbunătăţite pentru un număr mai mare de pacienţi.
Un studiu recent de potrivire pentru “CREGs” (cross reactive groups), a
sugerat că atât donatorii cât şi primitorii care sunt potriviţi pentru aceste grupuri
de antigene, pot avea mai puţine teste crossmatch pozitive şi pot beneficia de o
alogrefă renală cu o supravieţuire de lungă durată [40].
În rezumat, evaluarea imunologică pretransplant renal a pacienţilor
cuprinde: genotipul HLA, anticorpii citotoxici-screening, dacă este cazul
identificare şi testul crossmatch.

TRANSPLANTURILE RENALE ABO INCOMPATIBILE

În mod tradiţional, compatibilitatea de grup sanguin este considerată

esenţială pentru transplantul renal de succes, deoarece rinichii ABO
incompatibili transplantaţi sunt rapid distruşi de fenomenul de rejet hiperacut
datorat anticorpilor anti-A şi/sau anti-B care se leagă de antigenele A şi/sau B
de pe endoteliul grefei, activând cascada complementului şi inducând agregarea
trombocitară şi tromboza intravasculară [40].
În 1981, Slapak şi colaboratorii au observat că plasmafereza rezolvă
rapid rejetul la un transplant renal accidental incompatibil, ABO care s-a produs
din cauza unei erori de lucru a grupelor sanguine.
Recent interesul pentru folosirea rinichilor de la donatori vii ABO
incompatibili a crescut foarte mult, mai ales în ţări unde din motive culturale nu
există sursă alternativă de donatori.

73
 Chirurgii japonezi au raportat faptul că subgrupe selectate de pacienţi
pot atinge o evoluţie acceptabilă după transplantul renal ABO incompatibil,
dacă anticorpii anti-ABO sunt reduşi pretransplant combinat cu splenectomie
şi/sau anticoagulante postoperator şi doze înalte de imunosupresoare.
Titrurile de anticorpi pretransplant sunt reduse prin schimbare de plasmă
(plasma exchange) sau imunoabsorbţie cu înlocuire ulterioară cu plasmă tip AB.

Splenectomia este performată în încercarea de a reduce capacitatea

primitorului de a produce anticorpi anti-A/anti-B în cazul în care transplantul se
efectuează de la un donator de rinichi ABO incompatibil.

Terapia anticoagulantă cu inhibitori ai agregării trombocitare este

utilizată pentru a preveni iniţierea coagulării intravasculare diseminate
intrarenal, datorită rejetului umoral. Acest tip de transplant poate fi aplicat cu
succes pentru pacienţii care primesc rinichi de la donatori vii şi nu este posibil
în cazul donatorilor cadavru.

74
 PROVOCARI ALE IMUNOLOGIEI TRANSPLANTULUI RENAL LA COPIL

Andreea Mirela Caragea, Ileana Constantinescu

POTRIVIREA ÎNTRE DONATOR ȘI PRIMITOR

Boala renală cronică în stadiu final este o noțiune epidemiologică care

pornește de la ideea că afectarea persistentă a rinichilor poate fi consecința mai
multor factori etiologici. Boala renală cronică în stadiu final constă în pierderea
progresivă a nefronului și deteriorarea funcției renale. Când rata de filtrare
glomerulară (RFG) atinge un nivel critic sub 60 ml/minut/1,73m2, mecanismele
renale și sistemice adaptive devin dăunătoare, rezultând o reducere a numărului
de nefroni care duce la bola renală cronică (BRC).
BRC este o boală devastatoare, cu multe consecințe pe termen lung, în
special pentru pacienții pediatrici. [65]. Copiii în comparație cu adulții prezintă
un risc mai mare de a dezvolta complicații cardiovasculare, boli osoase care duc
la întârzierea creșterii și o calitate a vieții semnificativ redusă [66]. Conform
studiului "PREDATORR" realizat în 2013 de Societatea Română de
Nefrologie, aproximativ 7% dintre români sunt afectați de boala cronică renală
și o mică parte din numărul total de cazuri sunt la copii [67]. Un studiu din
America de Nord a arătat că pacienții pediatrici reprezintă mai puțin de 2% din
totalul cazurilor BRC în stadiu final din întreaga lume [68].
Există multe etiologii pentru BRC la copii, dar conform datelor unui
studiu din Japonia cele mai frecvente cauze au fost reprezentate de anomaliile
congenitale ale rinichilor și ale tractului urinar, acestea fiind urmate de
nefropatia ereditară și glomeruloscleroza segmentală focală [69].
Transplantul renal reprezintă tratamentul optim pentru pacienții cu BRC
în stadiul final și oferă beneficii substanțiale în comparație cu dializa. Aceste
beneficii includ înlocuirea funcțiilor reglatoarii, excretorii și endocrine ale
rinichiului. Transplantul renal corectează anemia rezultată ca urmare BRC şi
îmbunătățește calitatea vieții. Prin urmare, pentru pacienţii pediatrici,
transplantul preventiv, definit ca transplant înainte de inițierea dializei,
reprezintă tratamentul de elecţie pentru BRC în stadiu final.

75
 În ultimele decenii, tratamentul imunosupresor, dar și un donator cu o
potrivire HLA cât mai bună au îmbunătățit considerabil speranţa de viață a
primitorilor de grefă renală [70]. Cu toate acestea, îmbunătățirea gestionării pe
termen lung după transplantul de organe solide la copii rămâne o provocare.
Principala provocare în transplantul renal, la copii, rămâne respingerea grefei,
deoarece reactivitatea imună este diferită între copii și adolescenţi/adulţi.
Studiile au arătat că în comparație cu adolescenții/adulţi, copiii au un număr
crescut de limfocite CD2+, CD3+ și CD4+ T. Aceştia au, de asemenea,
răspunsuri blastogenice crescute şi un număr mai mare de celule T şi B [71].

Aceste particularități ale copiilor, precum și faptul că cele mai multe

transplanturi sunt realizate de la donatori înrudiţi (cele mai multe grefe
provenind de la părinţi), deci sunt compatibili numai pe un singur haplotip HLA
conduc la un risc crescut de respingere a grefei.

Progresele recente în managementul pre și post-transplant,

medicamentele imunosupresoare, tehnicile chirurgicale, selecția donatorilor,
precum şi progresele realizate în imunologia de transplant au condus la
supraviețuirea grefei pe termen lung și la îmbunătățirea calităţii vieţii
pacienților transplantaţi.

Tipizarea tisulară

Grefarea clinică a organelor între doi indivizi diferiți din punct de vedere
genetic din aceeași specie produce un răspuns imun de către sistemul imunitar al
gazdei. Alorecunoașterea este determinată de aloantigenele gazdei care sunt
codificate în cadrul complexului major de histocompatibilitate (CMH) [72].

Complexul major de histocompatibilitate reprezintă un grup de gene și

este situat pe brațul scurt al cromozomului 6 (Figura 23).

76
 Fig. 28. Cromozomul 6
(https://www.researchgate.net/publication/221914655_Immune_Dysfunction_in_Autism_
Spectrum_Disorder)

Aceasta este cea mai polimorfă și cea mai studiată regiune din genomul
uman deoarece variantele de la aceşti loci sunt asociate cu compatibilitatea
transplantului, boli autoimune, boli infecțioase și inflamatorii [73]. Genele
CMH, care codifică antigenele leucocitelor umane (HLA), sunt împărțite în
patru regiuni A, B, C și D. Clasa I este reprezentată de regiunile A, B, C și
codifică moleculele de clasa I (HLA-A, - B, -C). Clasa II este reprezentată de
regiunea D și codează moleculele de clasa II (HLA-DR, - DP, -DQ). CMH
conține, de asemenea, regiunea de clasa III, cea mai densă regiune genică din
genom, care codifică molecule precum proteinele complementului, C2, factorul
de complement B (CFB), C4, TNF, proteinele de șoc termic, proteinele de
creștere, care sunt numite molecule CMH de clasa III.
Moleculele HLA de clasa I sunt exprimate pe toate celulele nucleate și
pe trombocite în timp ce moleculele HLA de clasa II sunt exprimate pe celulele
prezintatoare de antigen (APC), celulele dendritice, limfocitele B, macrofagele.
Rolul fundamental al moleculelor de clasa I și clasa II este de a se lega de
peptidele lor self și non-self, care apoi sunt transportate la membrana plasmatică
a celulelor pentru a fi recunoscute de receptorul antigenului celulelor T [74].

77
 Moleculele HLA de clasa I leagă peptidele formate din 8-10 aminoacizi
și prezintă aceste peptide limfocitelor T citotoxice CD8.
Genele MHC de clasa I sunt extrem de polimorfe. Până în prezent au
fost identificate peste 12.200 de alele HLA, peste 9.200 fiind doar variante ale
genelor HLA de clasa I. HLA-B este cea mai polimorfă genă cunoscută în
genomul uman.
Moleculele HLA de clasa II leagă peptidele formate din 13-25
aminoacizi și le prezintă de limfocitele T helper CD4.
Activarea limfocitelor T CD4 și CD8 prin aceste două căi duce la
divizarea și diferențierea celulară, rezultând un răspuns imun celular și umoral.
O alelă reprezintă o variantă a unei gene date care se găsește în același
loc pe un cromozom.
Nomenclatura alelelor HLA este elaborată de către comitetul OMS,
astfel alelele HLA sunt desemnate prin numele genei care e urmată de un
asterisc, urmat de două cifre care definesc alela și acest număr, dar nu
întotdeauna se potrivește cu tipul serologic [75]. Cea de-a treia și a patra cifră
sunt folosite pentru a enumera subtipurile (Figura 3).

Fig. 29. Nomenclatura HLA

(http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1679-45082011000200249 )

Astfel supravietuirea alogrefei renale pe termen lung este performanta

cand donatorul viu este HLA identic.
Cand transplantul renal se face de la un donator viu HLA haploidentic
evolutia este favorabila cand donatorul si receptorul au in comun antigenele
HLA materne.

78
 Fiecare individ moștenește de la părinți un set de gene HLA într-o
transmisie mendeliană (Figura 4). Genele HLA sunt moștenite în mod normal
„en bloc” de la părinți datorită legăturii lor fizice strânse – transmitere linkată.
În ciuda complexității imense a acestor grupuri de gene, există în mod
normal patru genotipuri transmise. Toți copiii moștenesc un haplotip de la
mamă și un haplotip de la tată. Șansa de a găsi între frați un donator 100%
compatibil HLA este de 25%.
În cazul căsătoriilor consanguine, există șansa ca părinții și copiii să fie 100%
compatibili.

Fig. 30. Transmiterea mendeliană a haplotipurilor HLA

(https://www.researchgate.net/publication/6480734_The_HLA_System_Genetics_Immunology
_Clinical_Testing_and_Clinical_Implications)

Grefa de rinichi este percepută de sistemul imunitar al primitorului ca

fiind non-self, astfel încât grefa este infiltrată cu celulele gazdei iar în termen de
șapte până la zece zile se poate merge până la pierderea grefei.
La alogrefele de rinichi, cei mai importanți factori determinanți ai succesului
sau eșecului unui transplant sunt:
 metoda de conservare a organelor
 timpul de ischemie la rece

79
  numărul de transfuzii de sânge
 vârsta primitorului
 cauza principală a insuficienței renale
 transplant de organe în antecedente
 terapia imunosupresoare
Rinichiul transplantat reprezintă o continuă sursa de alogenicitate care
poate induce rejet in orice moment post transplant.
Rolul unui test de histocompatibilitate în transplantul de organe este de
a selecta cel mai bun donator pentru un primitor.
Laboratoarele HLA efectuează diferite teste pentru a sprijini programele
de transplant cum ar fi tiparea HLA, detectarea anticorpilor anti HLA și testul
crossmatch.
Potrivirea HLA îmbunătățește rata de supraviețuire a grefei pe termen
lung. Pentru a crește șansele unui retransplant, atunci când este necesar, trebuie
să mărim durata de supraviețuire a grefei. Tiparea HLA în prezent se face prin
utilizarea metodelor de biologie moleculare, cum ar fi RT- PCR, SSO PCR,
SSP PCR și metode bazate pe secvențiere (secvențiere automată tip Sanger) și
NGS (next generation sequencing) .
Numeroase studii au identificat potrivirea HLA ca o determinare cheie
pentru îmbunătățirea rezultatelor pacientului transplantat.
Rolul tastării HLA în viitor va fi condus de expresia HLA, înțelegerea
haplotipurilor HLA și tastarea HLA rapidă.

POTRIVIREA GRUPELOR DE SÂNGE

Compatibilitatea grupelor sanguine este esențială pentru un transplant

renal de succes (Figura 26).

Fig. 31. Compatiblitatea ABO (https://blood.ca/fr/node/1612 )

80
 Incompatibilitatea în sistemul ABO poate sta la baza unui transplant
nereușit din cauza fenomenului de respingere hiperacută cauzat de anticorpii
anti-A și / sau anti-B. Anticorpii se leagă de antigenele A și / sau B din
endoteliul grefei, activând cascada complementului, și se induce astfel
agregarea trombocitelor cu tromboza intravasculară.
Cele mai importante antigene din sânge sunt antigenele grupului A, B și
O. Aceste antigene se găsesc în multe celule, inclusiv eritrocite, trombocite și
celule endoteliale ale tuturor vaselor vasculare.
Antigenele grupelor sanguine sunt polizaharide și nu au nevoie de
sensibilizarea celulelor T pentru inducerea anticorpilor.
Compatibilitatea grupelor de sânge în sistemul ABO la primitor și
donator este prima condiție pentru efectuarea unui transplant de rinichi.
Pentru pacienții aflați pe listele de așteptare în vederea primirii unei
grefe renale li se vor determina antigeni eritrocitari în sistemele ABO, Rh,
Lewis, P, Ss, Ii și vor fi investigați pentru prezența anticorpilor.
Deoarece numărul pacienților cu ESRD este în creștere și există o lipsă
de donatori de rinichi, cercetătorii din Japonia au dezvoltat noi strategii
terapeutice [76]. Atunci când donatorii compatibili ABO nu sunt disponibili,
traversarea barierei grupei sanguine ABO este singura șansă pentru unii pacienți
de a primi o grefă renală. Transplantul de rinichi din donatorii de grupe
sanguine incompatibile ABOi (ABOi) a devenit singura opțiune pentru pacienții
aflați pe lista de așteptare. Deși transplantul renal ABOi este acum fezabil,
respingerea grefei mediată de anticorpi rămâne o problemă importantă.
Strategiile actuale ale transplantului renal ABOi constau în îndepărtarea pre-
transplant a titrilor izoaglutininei pentru a preveni respingerea mediată de
anticorpi. Protocoalele de desensibilizare se bazează pe plasmafereză sau
schimb de plasmă preoperator sau utilizarea anticorpului monoclonal anti-CD20
(Rituximab) a redus titrurile ridicate ale izoaglutininei.
Splenectomia este o altă procedură care poate fi utilizată pentru a reduce
titrurile ridicate de izoaglutinină care sunt responsabile de respingerea
hiperacută la pacienții cu grupe sanguine ABOi. Dar splenectomia crește și
riscul de septicemie la pacienții cu terapie agresivă de imunosupresie și schimb
de plasmă [77].
Numărul transplanturilor de rinichi ABOi a crescut la nivel mondial datorită
rezultatelor bune și a rezultatelor îmbunătățite obținute de chirurgii japonezi
însă în România nu se practică transplantul cu incompatibilitate de grup.

81
Crossmatch

Scopul testului de crossmatch este de a detecta în serul pacientului

prezența anticorpilor îndreptați împotriva antigenelor HLA ale donatorului.
Testul crossmatch se efectuează pe limfocitele T care exprimă molecule
HLA de clasa I și pe celule B care exprimă molecule de clasă I și clasa II [78].
Dacă sunt prezenți anticorpi, aceasta arată că sistemul imun al primitorului
a fost presensibilizat la antigenele donatorului și este susceptibil de respingerea
hiperacută a alogrefei și / sau de pierdere timpurie a grefei (Figura 27).

Fig. 32. Rejetul indus de anticorpi

(https://cjasn.asnjournals.org/content/13/1/182/tab-figures-data)

82
 Serul unor pacienți cu o boală autoimună, cum ar fi lupusul eritematos
sistematic și al pacienților tratați cu medicamente pentru tensiunea arterială
(hidralazină și procainamidă), pot conține adesea autoanticorpi.
Acești autoanticorpi nu afectează grefa dar sunt importanți deoarece pot
imita anticorpii anti HLA specifici donatorului și, ulterior, pot priva un primitor
de un transplant renal. Anticorpii specifici donatorului și autoanticorpii pot fi
îndepărtați prin tratament cu ditiotreitol (DTT). Testul crossmatch nu trebuie
interpretat niciodată singur, fără nicio informație despre istoricul pacientului.
Crossmatch-ul virtual (v-XM) reduce volumul de lucru în laboratoarele
HLA și facilitează alocarea organelor chiar și la primitorii sensibilizați [79].
Într-un studiu publicat în septembrie 2014 Piazza și colab. a arătat că prin
efectuarea unui V-XM avem o bună sensibilitate în prezicerea compatibilității
imunologice donator-primitor [80].

Presensibilizarea (imunizarea)

Presensibilizarea este un proces prin care pacientul este expus la

antigenele HLA non-self.
În cazul adulţilor sensibilizarea poate apărea în timpul transfuziilor de
sânge, sarcină sau un transplant de organ anterior [81]. În cea mai mare parte
copiii sunt imunizaţi prin transfuziile de sânge.
Numărul pacienților care așteaptă retransplantul renal după o grefă
renală eșuată a crescut în timp. Abordarea pacienţilor retransplantaţi, cu
imunizare ridicată reprezintă o provocare pentru transplantul de organe.
Primitorii supuşi unui retransplant renal prezintă un risc imunologic
ridicat de respingere a grefei. Cauzele de respingere a grefei includ intervenția
chirurgicală anterioară, efectele secundare ale terapiei cronice de imunosupresie
- medicamente nefrotoxice, riscul înalt de sensibilizare cu anticorpi reactivi,
precum și existența unor comorbidități.
Prognosticul pacienții cu retransplant trebuie să includă și factori
precum sursa donatorului (donator viu sau cadavru), durata funcțională a primei
grefe și timpul scurs între prima și a doua grefă.
La pacienții transplantați de la un donator cadavru rata de supraviețuire a grefei
renale este mai mică comparativ cu cei care primesc o grefă de la un donator
viu [82]. Unul dintre motive este timpul crescut de ischemie rece (CIT) care
duce la întârzierea funcției grefei (IFG). Existența unei IFG după primul
transplantul este asociat cu o probabilitate crescută de recurență.

83
Supraviețuirea pe termen lung a grefei scade odată cu retransplantarea
ulterioară datorită intervențiilor chirurgicale repetate, respingere acută, grefa
primară nefuncțională, regimul imunosupresor, numărul de nepotriviri HLA și
complicațiilor chirurgicale.
Nefrectomia grefei eșuate poate fi indicată înainte de retransplantul
renal dacă este asociată cu hipertensiune refractară, infecții ale tractului urinar,
tuberculoză urinară și proteinurie. Nu este încă clar dacă prezența unei grefe
eșuate poate stimula producerea de anticorpi, prin urmare decizia de
nefrectomie ar trebui să se bazeze pe indicații clinice.
Între retransplantul renal și hemodializă, retransplantul rămâne
tratamentul de elecție pentru copii.

TERAPIA IMUNOSUPRESOARE ÎN TRANSPLANTUL RENAL LA COPII

La copii se utilizează inhibitor de calcineurină (CNI; de obicei

tacrolimus) în combinație cu un agent antiproliferativ (de exemplu, micofenolat
mofetil sau azatioprină) și un steroid (de exemplu, prednisolon).
Terapia de întreținere pe termen lung este în doză mai mică decât doza inițială,
pe măsură ce rinichiul transplantat devine mai stabil [83].
Această terapie este continuată pe tot parcursul supraviețuirii grefei [84].
Mulți dintre agenții imunosupresori de inducție utilizați în prezent în Regatul
Unit sunt agenți biologici incluzând anticorpi monoclonali (cum ar fi
basiliximab) și anticorpi policlonali (cum ar fi imunoglobulina anti-timocit de
iepure).

84
EVALUAREA IMUNOLOGICĂ ÎN TRANSPLANTUL HEPATIC

Ileana Constantinescu

Primul transplant de ficat la om, a fost realizat în 1963 de către echipa

chirurgicală condusă de dr. Thomas Starzl, în Denver, SUA. În ciuda
perfecţionării continue a tehnicilor chirurgicale, transplantul hepatic a rămas la
nivel experimental, cu o rată a supravieţuirii la un an de cca. 25%, până prin
anii ’80 când a fost introdusă Ciclosporina ca tratament imunosupresor.
Şi în prezent, deşi rata supravieţuirii la 1an a ajuns la 80 – 85% şi
continuă să se îmbunătăţească, transplantul de ficat rămâne o procedură
formidabilă dar grevată de complicaţii frecvente.
În general, afecţiunile hepatice care induc necesitatea unui transplant,
pot fi divizate în două grupe:
- afecţiuni acute: cum ar fi hepatitele virale fulminante.
- afecţiuni cronice: hepatite virale cronice, hepatite autoimune, hepatopatii
alcoolice (indicaţie controversată, condiţionată de abstinenţa pretransplant),
ciroză biliară primitivă, colangită sclerozantă, boli metabolice (boala
Wilson).
Transplantul hepatic este limitat de numărul de organe cadaverice
disponibile. În ultimii ani, numărul organelor disponibile de la cadavru a rămas
relativ stabil, în timp ce numărul pacienţilor înscrişi anual pe lista de aşteptare
pentru transplantul hepatic este în continuă creştere.
Această discrepanţă între organele disponibile şi nevoia de transplant a
condus la reevaluarea continuă a criteriilor de selecţie şi includere pe lista de
aşteptare. În prezent, scorul MELD (Model for End-Stage Liver Disease) este
recomandat, deoarece se bazează pe 3 parametri biochimici obiectivi, larg
disponibili şi reproductibili (bilirubina serică, creatinina serică şi INR
protrombină), iar pentru populaţia pediatrică se utilizează un model similar,
scorul PELD (Pediatric End- Stage Liver Disease) care foloseşte următoarele
variabile: vârsta, albumina serică, bilirubina serică totală, INR şi retardul
statural. [86, 87, 88, 89]
Donatori marginali:

1. vârstă > 50 ani: deşi vârsta înaintată a donatorului se poate asocia cu

funcţia deficitară a grefei, lipsa de organe şi evoluţia favorabilă post-
transplant par să justifice numărul în creştere al donatorilor > 50 ani.[90]

85
 2. steatoza hepatică: ficatul cu infiltrare grasă uşoară sau moderată poate fi
utilizat cu rezultate bune dacă timpul de ischemie rece este redus.[91]
3. markeri pozitivi pentru virusul hepatitic B sau C: grefele provenind de la
donatori cu markeri de infecţie VHB sau VHC pot fi utilizate la receptori
cu ciroză secundară infecţiei VHB, respectiv VHC, dacă se
administrează tratament profilactic specific.[92,93]
Transplantul cu ficat împărţit (split liver transplantation ): un ficat de
la cadavru este împărţit în două grefe funcţionale, lobul drept fiind folosit
pentru un receptor adult, iar lobul stâng (segmentele 2, 3 şi 4) sau segmentul
lateral stâng (segmentele 2 şi 3) pentru un adult scund sau un copil. Majoritatea
centrelor consideră că împărţirea in vivo este superioară celei ex vivo dacă sunt
luate în considerare rezultatele imediate şi pe termen lung. Principalul
dezavantaj al tehnicii cu ficat împărţit constă în supravieţuirea mai mică a grefei
şi numărul crescut de complicaţii biliare comparative cu transplantul hepatic
integral.

Transplantul hepatic “în domino” reprezintă situaţia în care un pacient

cu o afecţiune genetică şi ficat normal morfologic (de exemplu, amiloidoză
familială) primeşte un ficat de la donator cadavru, iar ficatul pacientului cu
amiloidoză este transplantat unui receptor marginal având în vedere că apariţia
manifestărilor amiloidozei familiale apar după o perioadă lungă (20-30 ani).[94]

Transplantul hepatic cu donator viu (living donor liver transplantation-

LDLT). Este o metodă bazată pe capacitatea remarcabilă de regenerare a
ficatului. Din punct de vedere istoric, metoda se adresa iniţial părinţilor ce
aveau copii cu afecţiuni hepatice şi care erau dispuşi să le doneze o porţiune din
ficatul lor sănătos, dar în prezent se efectuează si transplantul adult – adult.
Ficatul donatorului se regenerează şi este funcţional 100% în circa 4 – 6
săptămâni.

Avantajele LDLT sunt: scurtarea perioadei de aşteptare; posibilitatea alegerii

momentului optim, înainte de apariţia deteriorării progresive a funcţiei hepatice
şi condiţiei pacientului; scăderea timpului de ischemie rece; creşterea
rezervorului de donatori;

Dezavantajul major al LDLT este morbiditatea de aproximativ 10% şi, în

cazuri rare (0.2-0.5%), mortalitatea donatorului [95-98].

86
COMPATIBILITATEA DONATOR – PRIMITOR ÎN TRANSPLANTUL HEPATIC

Potrivirea dintre donator şi receptor implică doi factori:

1. grupul sanguin: donatorul trebuie să aibă grupul sanguin compatibil dar
nu neapărat identic cu al primitorului. Totuşi, studiile au arătat că un
transplant izogrup oferă o supravieţuire mai bună decât un transplant cu
grup compatibil.
2. dimensiunea corpului (body size): este foarte dificil să introduci ficatul
unei persoane bine dezvoltate în corpul unei persoane de statură mică şi
ca urmare potrivirea dimensiunilor între primitor şi donator este
esenţială.
Spre deosebire de transplantul de rinichi sau de măduvă osoasă, în
transplantul hepatic, compatibilitatea HLA nu este necesară cu toate că a fost
raportată o relaţie inversă între compatibilitate şi supravieţuire [99]. Oricum,
genotiparea HLA se efectuează numai în scopuri ştiinţifice nu şi în scopul
alocării alogrefelor hepatice.
Genotipul HLA DRB1*11 este asociat în 70% din cazurile de transplant
hepatic cu episoade de rejet acut şi cu creşterea nivelului seric al neopterinului,
IL-1β, IL-2R, IL-8.
Genotipul HLA DRB1*13 este asociat cu infecţii VHC posttransplant şi
sepsis.
Crossmatch-ul nu se performează de rutină preoperator dar, ocazional,
poate fi realizat retrospectiv. Au fost raportate numai câteva cazuri de rejet
hiperacut datorate prezenţei anticorpilor anti-donor. Motivul acestei aparente
rezistenţe a ficatului la rejet hiperacut nu este încă pe deplin cunoscut. S-a
sugerat că ficatul nu este sensibil la anticorpii preformaţi sau că, datorită
dimensiunilor sale mari, rezultă o diluţie a anticorpilor la nivele la care ei nu
mai sunt nocivi.
Ocazional, în cazul unor transplante combinate, ficat şi rinichi,
crossmatch-ul pozitiv pretransplant s-a negativat posttransplant. Două ipoteze
au fost lansate în ce priveşte mecanismul prin care se produce această scădere a
nivelului anticorpilor citotoxici: 1) formarea de complexe imune solubile; 2)
pierderea de sânge asociată operaţiei de transplant hepatic ce determină o
scădere a titrului anticorpilor [99].

87
Boala acută de grefă contra gazdă (GVHD) în transplantul hepatic
Ficatul face parte din sistemul reticuloendotelial, este un organ mare cu
o reţea vasculară întinsă şi care conţine în parenchim un număr mare de celule
limfoide. Se estimează că numărul limfocitelor din parenchimul unei grefe
hepatice este mult mai mare decât cel dintr-o grefă de măduvă osoasă.
GVHD acut posttransplant hepatic apare când limfocitele
imunocompetente ale donatorului, transferate odată cu ficatul, sunt activate şi
suferă o expansiune clonală. Mecanismul intim al acestui proces nu este încă
bine cunoscut. Lezarea ficatului datorată manevrelor chirurgicale ar induce o
stare de imunosupresie şi alterarea raportului citokinelor TH1/TH2. Recent, o
mai mare atenţie se acordă limfocitelor T reglatoare CD4+ CD25+, deoarece ele
joacă un rol important în imunoreglare şi imunotoleranţă, fiind capabile să
inhibe funcţiile limfocitelor T CD4+, CD8+ şi a celulelor NK [100].
Diagnosticul precoce al acestei afecţiuni şi strategia terapeutică
reprezintă o provocare, întrucât rata de mortalitate este încă mare, în jur de
85%. Din fericire incidenţa acestei boli este scăzută, 1 – 2%, şi pare să fie
influenţată de mai mulţi factori ce ţin atât de donator cât şi de primitor:
compatibilitatea HLA, vârsta înaintată a primitorului, imunodeficienţa
primitorului [101, 102,103].
Legat tot de aceste limfocite imunocompetente ale donatorului,
transferate primitorului odată cu organul transplantat, se descrie aşa-numitul
"sindrom al limfocitelor pasagere" (SLP) [104].
Acest sindrom se referă la fenomenul de hemoliză aloimună mediată de
complement, datorat producției de anticorpi antieritrocitari de către limfocitele
B cu memorie ale donatorului. Faptul că acești anticorpi provin de la donator a
fost demonstrat prin teste de alotipizare a imunoglobulinelor.
De obicei, specificitatea este față de antigene eritrocitare ale sistemelor
ABO și Rh si doar ocazional față de antigene aparținând altor sisteme
eritrocitare (Kidd, Lewis), situație întâlnită atunci când donatorul a fost
sensibilizat prin transfuzii sanguine sau sarcină. Tratamentul imunosupresor
administrat posttransplant joacă un rol etiologic important. Ciclosporina și
tacrolimusul permit proliferarea rapidă a limfocitelor B transferate, care vor
produce anticorpi.
Este o complicație raportată mai frecvent în cazul transplantelor cu
mismatch minor ABO si poate fi cauza unor hemolize "neexplicate" apărute în
perioada postoperatorie. Incidența SLP biochimic (haptoglobină scăzută,
transaminaze și bilirubină indirectă crescute) în transplantul hepatic este de
circa 30 – 40% .

88
 De obicei apare în săptămânile 1 – 3 posttransplant și are o evoluție
autolimitată cu remisiune completă în circa 3 luni. Dintre factorii ce
influențează severitatea hemolizei amintim: cantitatea de țesut limfoid
transferată, nivelul izoaglutininelor eritrocitare la donator înainte de transplant,
capacitatea de clearence a acestor anticorpi de către primitor [105-108].
În cele mai multe cazuri tratamentul implică doar substituția cu masă
eritrocitară, izogrup cu donatorul, și numai rareori sunt necesare și alte mijloace
terapeutice: plasmafereză, Ig intravenos, corticosteroizi sau anticorpi
monoclonali anti CD20 (Rituximab) [109].

MONITORIZAREA PACIENTULUI POSTTRANSPLANT HEPATIC

Evaluare imunologică

Fenomene de rejet post transplant hepatic pot fi întâlnite la peste 50%

din pacienti și sunt tratate relativ ușor și cu succes dacă sunt diagnosticate
precoce. Din păcate, semnele și simptomele clinice (febră, dureri abdominale,
ascită, hepatomegalie, inapetență ) și testele paraclinice (creșterea nivelelor
serice ale bilirubinei, transaminazelor, fosfatazei alcaline) sunt nespecifice.
Uzual, diagnosticul se pune prin biopsie hepatică percutană aspectul
histopatologic sugestiv fiind reprezentat de infiltratul celular mixt în spațiul
port, cu epiteliul ductelor biliare și al venei centrale/porte alterat.
O provocare continuă pentru imunologii şi cercetătorii ce activează în
domeniul transplantului, este descoperirea unor noi markeri, cât mai specifici şi
cât mai accesibili, care să permită un diagnostic cât mai precoce şi prin metode
neinvazive, a fenomenelor de rejet.
Citokinele TH1 şi alte citokine proinflamatorii, incluzând TNF-α, IFN-
γ, IL-2, sunt mediatori primari ai rejetului alogrefei [110, 111]. Pe de altă parte
citokinele TH2, cum ar fi IL-4 sau IL-10, inhibă răspunsul TH1 şi compromite
imunitatea gazdei, dar promovează tolerenţa transplantului (112).
În plus, limfocitele T helper, sub acţiunea Transforming Growth Factor
TGF-β şi a IL-6, se pot diferenţia într-un subset de celule ce secretă IL-17,
citokină recent recunoscută ca inductoare a răspunsurilor inflamatorii.
IL-1β, IL-2R, IL-6, IL-8, TNF-α şi neopterina serică reprezintă
indicatori fideli ai răspunsului imun mediat celular la pacienţii cu transplant
hepatic şi din acest considerent sunt markeri imunologici prognostici pentru
fenomenul de rejet acut.

89
 Algoritmul immunologic de evaluare posttransplant trebuie să cuprindă,
în mod obligatoriu, cel puţin determinarea IL-2R, TNF-α şi neopterinei pentru o
monitorizare imunologică de acurateţe, care să ofere o imagine cât mai fidelă
asupra răspunsului imun celular.
Evaluarea imunologică este cu atât mai importantă în condiţiile
imunosupresiei cu inhibitor de calcineurin şi în cazul infecţiilor posttransplant
induse de virusuri din familia herpesviridae care, la rândul lor, manipulează
răspunsul imun al gazdei.

Evaluarea virusologică

Evaluarea virusologică pre și posttransplant este foarte importantă

pentru monitorizarea pacienților cu transplant hepatic.
Recurenţa afecţiunii iniţiale post-transplant este o provocare majoră pentru
hepatolog.
Afecţiunea care ridică cele mai importante probleme legate de recidiva
post-transplant este infecţia cu VHC. Reinfecţia grefei cu VHC este universală,
recurenţa histologică fiind notată la 50-80% din pacienţi la 1 an post-transplant.
O proporţie de 15-30% dintre pacienţii cu hepatită cronică C recurentă
dezvoltă ciroză hepatică la 5 ani post-transplant.
O serie de factori se asociază cu riscul hepatitei VHC recurente post-
transplant: încărcătura virală mare pre-transplant şi precoce posttransplant,
genotipul 1b şi 4, anumite antigene HLA ( HLA DRB1*13 ), timpul de
ischemie rece prelungit, steatoza severă (> 30%), asocierea carcinomului
hepatocelular, vârsta donatorului > 50 ani, tipul de imunosupresie (utilizarea
OKT3), numărul episoadelor de rejet acut tratate cu bolusuri de
metilprednisolon, tratamentul rejetului cu anticorpi anti-limfocitari, infecţia cu
virusul citomegalic, absenţa coinfecţiei VHB pretransplant [91, 94, 113, 114].
Rareori recurența infecției VHC se asociază cu forme agresive de
hepatită ce pot duce la pierderea grefei, iar câteva rapoarte recente sugerează că
incidența și severitatea recurenței sunt mai crescute în cazul transplantului de
ficat de la donatori vii [116].
Eradicarea infecţiei VHC pre-transplant reprezintă modalitatea optimă
de profilaxie a infecţiei grefei. Regimul antiviral optim pentru tratamentul
hepatitei C recurente post-transplant este regimul combinat interferon,
preferabil pegylat, plus ribavirină. Durata şi doza optimă a fiecărui agent
antiviral nu sunt încă standardizate. Retransplantarea pacienţilor cu infecţie
VHC recurentă rămâne controversată datorită rezultatelor slabe.

90
 Până în urmă cu aproximativ o decadă, pacienţii transplantaţi pentru
ciroză de etiologie VHB prezentau cel mai nefavorabil prognostic dintre toţi
pacienţii transplantaţi pentru afecţiuni hepatice non-maligne cu o proporţie de
73% din decesele înregistrate în primele 60 zile posttransplant.
Reinfecţia VHB a grefei se poate produce cu particule VHB circulante,
cu particule virale provenind din sursele de replicare extrahepatice ale VHB
(sistemul hematopoetic, pancreas) sau ambele.
Factorii asociați cu o rată de reinfecție mai mică și cu îmbunătățirea
supraviețuirii posttransplant includ [116]:
1. replicare virală absentă (absența în ser a ADN-HBV și/sau AgHBe);
2. profilaxia pe termen lung a hepatitei VHB;
3. hepatita HBV fulminantă;
4. coinfecția cu virus delta (VHD);
Combinaţia imunoglobulină specifică anti-VHB (HBIG)-lamivudină
reprezintă în momentul actual regimul profilactic preferat în majoritatea
centrelor de transplant hepatic din lume, fiind asociată cu o rată de reinfecţie
cuprinsă între 0 şi 9.5% [115, 117], iar rata de supraviețuire la 5 ani a acestor
pacienți este asemănătoare cu a pacienților transplantați pentru alte afecțiuni
non-virale. Monoterapia cu HBIG sau lamivudină se asociază însă cu
dezvoltarea de mutaţii ce conferă rezistenţă la tratament (mutaţii în gena S
pentru HBIG sau mutaţii în gena P a polimerazei virale – mutaţii YMDD pentru
lamivudină).
Retransplantare pacienților cu infecție VHB recurentă poate fi realizată
cu succes dacă se asociază o terapie antivirală și cu HBIG în doze crescute.
Citomegalovirusul (CMV) este un patogen frecvent implicat în
infecțiile posttransplant, contribuind semnificativ la creșterea morbidității și
mortalității în transplantul deorgane solide. Un risc mai mare de a dezvolta
infecție primară simptomatică prezintă primitorii seronegativi care au avut un
donator seropozitiv. Alți factori de risc pentru activarea CMV sunt: tipul de
organ transplantat, mismatch-ul HLA dintre donator și primitor, intensitatea
terapiei imunosupresoare, sexul feminin.
Pe lângă efectul direct determinat de invazia țesuturilor, CMV este
implicat în patogeneza rejetului acut sau cronic și de asemenea crește riscul de
recurență al infecției VHC si scade supraviețuirea globală a pacientului și a
grefei [118].

91
 O dovadă a rolului jucat de CMV în rejetul alogrefei este observația că
terapia profilactică și antivirală îmbunătățește funcția grefei și inhibă rejetul
acut. Deși reactivitatea imună în infecțiile CMV a fost intens studiată în ultimii
ani, mecanismul imunologic prin care CMV induce rejetul alogrefei rămâne
controversat. Una din ipoteze susține că limfocitele T CMV-specifice, cu
potențial citotoxic și producătoare de citokine proinflamatorii, cum ar fi TNF-α,
pot reacționa direct cu anumite complexe CMH/peptide alogene, proces
cunoscut sub denumirea de "imunitate heteroloagă". O altă ipoteză se referă la
stimularea indirectă a aloimunității. Infecția CMV induce producția locală de
citokine proinflamatorii, cum ar fi TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8, sau chemokine CC
și CXC, care determină recrutarea și activarea leucocitelor din grefă (119, 120).
Este deja bine cunoscut rolul pe care îl joacă imunitatea celulară în
controlul infecției. Concentrațiile crescute de neopterină reflectă răspunsul imun
mediat celular și în infecțiile produse de CMV sau EBV, fiind un marker
imunologic foarte util în diagnosticul acestor infecții la pacienții cu transplant
hepatic, deoarece nivelele serice de neopterină cresc în stadiile timpurii ale
acestor infecți, de obicei chiar înainte de seroconversie.

92
 EVALUAREA IMUNOLOGICĂ ÎN TRANSPLANTUL
MEDULAR

Ileana Constantinescu

În prezent, transplantul autolog sau alogeneic de celule stem

hematopoietice (TCSH), reprezintă o opţiune terapeutică bine–cunoscută, având
un loc bine stabilit în algoritmul de tratament al multor afecţiuni: afecţiuni
hematologice congenitale sau dobândite, tumori solide, boli autoimune,
amiloidoză, anomalii ereditare de metabolism [121]. Sursele de celule stem sunt
reprezentate de măduvă osoasă, sânge periferic, sânge din cordonul ombilical.
Rezultatele clinice obţinute par să fie similare, indiferent de sursă, iar alegerea
modalităţii de recoltare depinde de vârsta primitorului şi/sau donatorului,
indicaţia de transplant, preferinţa donatorului, experienţa şi dotarea centrului
unde se face transplantul.
Rezultatul unui TCSH depinde în mare măsură de următorii factori de
risc: stadiul bolii, intervalul de timp scurs de la diagnostic pâna la momentul
transplantului, vârsta pacientului (în general, se obţin rezultate mai bune la copii
decât la adulţi), histocompatibilitatea donator-primitor, combinaţia de sex
donator-receptor (riscul de rejet este mai mare dacă donatorul este femeie iar
primitorul bărbat). De asemenea, există un risc potenţial de transmitere a unor
boli, de la donator la primitor, cum ar fi: infecţii, boli congenitale, boli
autoimune, cancere [122].

Stabilirea compatibilităţii HLA

Federaţia Europeană de Imunogenetică (EFI) este forul european ce

defineşte standardele în laboratoarele de histocompatibilitate şi stabileşte
criteriile minime privind tipizarea HLA pentru TCSH de la donator înrudit sau
neânrudit.
Dar, dacă în transplantul de organe solide, putem vorbi de mismatch-uri
HLA “acceptabile” situaţia este complet diferită în cazul transplantului de
măduvă osoasă sau de celule stem. Acest tip de transplant implică chiar celulele
sistemului imun şi orice nepotrivire între donator şi receptor, chiar și
modificarea unui singur aminoacid în situsul de recunoaștere a antigenului,
poate determina fenomene grave de rejet, fie în sensul unei boli gazdă contra
grefă fie în sens invers ca boală de grefă contra gazdă.

93
 Determinarea unui potențial donator implică o apreciere riguroasă a
disponibilității și statusului de potrivire HLA a membrilor familiei, și
identificarea unui donator neînrudit potrivit, dacă nu există donator înrudit
disponibil. Deoarece antigenele HLA determină un răspuns aloimun, potrivirea
HLA joacă un rol preventiv critic în reducerea riscului de afectare a
grefei și de apariție a bolii de grefă contra gazdă. Pe de altă parte, efectul de
grefă contra leucemie, asociat cu mismatch-ul HLA, reprezintă un mijloc
imunologic de a reduce riscul de recurență de boală la pacienții cu risc crescut.

Selecția donatorului înrudit

Cel mai adecvat donator este un frate potrivit din punct de vedere al
genotipului HLA.
Conform recomandărilor EFI este obligatorie tipizarea imediată a HLA
– A, B, DRB1 la toţi membrii familiei disponibili. Iniţial se poate face un
screening prin tipizare fenotipică dar ulterior, la perechile compatibile fenotipic,
tipizarea se definitivează prin metode de biologie moleculară de rezoluţie înaltă
care permit descrierea alelelor HLA la nivel de 4 digits.
Tipizarea ABDR poate confirma identitatea genotipică pentru întregul
set de gene HLA ( potrivire 12/12 ). Din cauza unui slab ”dezechilibru de
legare” între locusul DP şi locii DR/DQ, în 1 – 2% din cazuri, datorită
recombinărilor pot apare mismatch-uri DP între fraţi altfel identici.
Probabilitatea ca un frate să fie identic HLA este de 25%, în timp ce
probabilitatea unui frate haploidentic este de 50%.

Selecţia donatorului neînrudit

Dacă un frate, identic din punct de vedere al genotipului HLA, nu este

disponibil, transplantul cu celule stem hematopoietice potrivite HLA – A, B, C,
DRB1/DQB1 de la un donator neînrudit are aceleași rate de supraviețuire fără
boală, mai ales pentru pacienții cu risc scăzut, dar se asociază cu o frecvență
crescută a complicațiilor posttransplant [123, 124]. Mismatch-urile alelice de
obicei implică diferențe în situsul de legare al peptidului, ceea ce influențează
recunoasterea dependentă de celulele T.
”Standardul de aur” este reprezentat de tipizarea cu rezoluție înaltă a
locusurilor HLA – A, B, DRB1, DQB1, DPB1. Dacă transplantul se face pentru
o afecțiune nemalignă, nu este necesar efectul de grefă contra leucemie, mediat
prin incompatibilitatea DP, și potrivirea DPB1 poate fi luată în considerare când
sunt disponibili mai mulți donatori compatibili HLA – A/B/C/DR/DQ (125).

94
 Realizarea în siguranță a transplanturilor de celule stem de la donatori
neînrudiți se datorează, în mare parte, progreselor obținute în domeniul
imunogeneticii. La începutul anilor '90, stabilirea compatibilității tisulare era
stânjenită de metodele de tipizare HLA de rezoluție slabă (metode serologice), în
special pentru alelele HLA de clasa I. Studiile recente, bazate pe metode de
tipizare de rezoluție înaltă (metode moleculare), au arătat că potrivirea la nivel de
alelă se asociază cu rezultate mai bune oricare ar fi regimul de condiționare,
mieloablativ sau de intensitate redusă [123]. Oricum, importanța relativă a
fiecărui locus în parte rămâne o problemă discutabilă. În timp ce efectul
mismatch-urilor A/B/C/DRB1 a fost bine documentat prin multiple studii
retrospective, rolul incompatibilității DQ sau DP rămâne controversat. Date
recente privind transplantul de celule stem cu depleție de limfocite T, de la
donator neînrudit, arată că matching-ul HLA- DPB1 se asociază cu risc crescut de
recădere independent de statusul de compatibilitate a celorlalte locusuri [126].
Rezultate diferite au fost raportate și în studii ce implicau pacienți de
etnii diferite. În populația japoneză, mismatch-urile A/B/C/DRB1 reprezintă
factor de risc semnificativ pentru GVHD acută de gradul III sau IV, și numai
diferențele A, B sau DRB1 se asociază cu mortalitate crescută [127]. Un alt
studiu din SUA arată că nepotrivirile HLA-A/B/C/DRB1, dar nu și mismatch-
urile DQ sau DP, se însoțesc de o scădere a ratei de supravietuire [128].
În cazul potrivirii alelice HLA în proporție de 80-90%, în completarea
tipizării HLA de înaltă rezoluție se efectuează și testul crossmatch. În cazul în
care testul crossmatch este pozitiv, acest fapt nu reprezintă o contraindicație
absolută pentru transplantul medular, dar regimul imunosupresor trebuie
reconfigurat în totalitate.
În concluzie, toate aceste aspecte legate de potrivirea sau nepotrivirea
alelelor HLA, trebuie luate în considerare, în funcție și de particularitățile
clinico-biologice ale cazului care urmează a fi transplantat medular.
Selectia donatorului din banca de sânge din cordonul ombilical
În general, în acest caz se face tipizare HLA-A/B cu rezoluție joasă și
tipizare HLA-DRB1 cu rezolutie înaltă și matching-ul se stabilește la acest
nivel, deoarece se pare că incompatibilitățile HLA sunt mai puțin dăunătoare și
cel mai important parametru, de care depinde rezultatul transplantului, este
cantitatea de celule stem conținută de unitatea de sânge recoltată [129].
Aprecierea probabilității de a găsi un donator neînrudit
Identificarea unui donator neînrudit potrivit la nivel de alele HLA, este
un proces mare consumator de timp și bani. Pe baza noilor cunoștiințe privind
frecvența alelelor și haplotipurilor în populații diferite, se apreciază că următorii
parametri au un impact negativ [130]:

95
  prezența unor alele rare la pacient (B*4405);
 un haplotip HLA-ABDR care nu se numără printre cele 10 mai
frecvente haplotipuri la populația caucazoidă;
 asocieri B-DR neobișnuite (ex. B65-DRB1*0101);
 asocieri DR-DQ neobișnuite (ex. DRB1*1501-DQB1*0603);
 prezența alelelor B*2705, B18, B*4402, B*4403, B51 ce se însoțesc de
un risc crescut de mismatch HLA-C;
 primitor și donator de etnii diferite;
În concluzie: Sistemul HLA, cu circa 100 de specificități definite
serologic și peste 2500 de alele, reprezintă o barieră majoră în transplantul de
celule stem hematopoetice. Consensul actual este că, selectarea donatorilor
neînrudiți pe baza genotipării HLA prin metode moleculare de rezoluție înaltă
se însoțește de cele mai bune rezultate.
Dacă sunt disponibili mai mulți donatori HLA identici, se recomandă
alegerea unui bărbat, ABO identic și/sau CMV negativ.
Oricum, importanța fiecărui locus individual rămâne încă o problemă
deschisă, ce necesită o definire mai clară și, în acest sens, o contribuție
importantă vor avea studiile multicentrice. De asemenea, mai rămâne de stabilit
care este rolul pe care îl joacă alți factori imunogenetici care pot fi implicați,
cum ar fi: antigenele sistemului minor de compatibilitate, genele citokinelor și
chemokinelor, genele KIR.

GENELE KIR ȘI TRANSPLANTUL DE CELULE STEM HEMATOPOETICE

Receptorii KIR (Killer cell immunoglobulin-like receptors) sunt

molecule care fac parte din familia imunoglobulinelor și care se găsesc pe
suprafața celulelor NK. Locusul genelor KIR se află pe cromozomul 19 și face
parte dintr-un complex mai mare numit Complexul Receptorului Leucocitar
(leukocyte receptor complex – LRC). Din punct de vedere structural, receptorul
KIR este constituit dintr-o porțiune extracelulară, cu 2 sau 3 domenii
imunoglobulinice (2D sau 3D), și o porțiune intracelulară, lungă sau scurtă, L
(long) și S (short). KIR-urile cu domeniul intracelular lung au o acțiune
inhibitoare asupra celulelor NK, pe când cele cu domeniul intracelular scurt
transmit semnale activatoare.

96
 Prin interacțiunea izotipurilor inhibitoare cu anumite molecule HLA de
clasa I, celulele sănătoase sunt protejate de acțiunea citolitică a celulelor NK.
Astfel, receptorii KIR par șă joace un rol semnificativ în controlul
răspunsului imun, ceea ce explică asocierile observate între anumite gene KIR
și boli autoimune (artrita reumatoidă), psoriazis, progresia infecției HIV [131,
132, 133].
KIR 2DL1 au ca ligand alelele HLA-C de grup 2, caracterizate prin
prezența resturilor de lizină în poziția 80 și asparagină în poziția 77 (Cw2, Cw4,
Cw5, Cw6), pe când KIR 2DL2 si 2DL3 recunosc alelele HLA-C de grup 1, cu
asparagină în poziția 80 si serină în poziția 77 (Cw1, Cw3, Cw7, Cw8). KIR
3DL1 este receptor pentru alelele HLA-Bw4.
Deoarece sunt localizate pe cromozomi diferiți, genele receptorilor KIR
și liganzilor se transmit independent descendenților. Genotipul HLA clasa I
determină în final ce repertoriu de receptori KIR va fi exprimat pe suprafața
celulelor NK, astfel încât fiecare celulă NK funcțională să exprime cel puțin un
receptor KIR inhibitor pentru antigenele HLA proprii. Coexpresia a două sau
mai multe KIR-uri inhibitoare este mult mai rară [134].
Celulele NK care exprimă receptori KIR pentru propriul HLA de clasa I,
dacă întâlnesc celule cu un alt fenotip HLA (așa cum se poate întâmpla în cazul
unui alotransplant), sesizează lipsa ligandului specific și mediază alloreacțiile
(”missing self” recognition) [135].
Aceste mismatch-uri KIR - ligand apar deseori in transplantul cu
donator haploidentic. Când alloreactivitatea NK se exercită în direcția donor –
versus- primitor pare să aibe un rol crucial în îmbunătățirea rezultatelor
posttransplant haploidentic și se asociază cu [16]:
 rată de recădere de boală, semnificativ mai mică;
 rată de supraviețuire fără evenimente mai bună, atât la pacienții
transplantați în perioada de remisiune cât și la cei cu recădere de boală;
 reducerea riscului global de recădere sau deces;
În ceea ce privește receptorii KIR activatori, liganzii lor specifici nu
sunt pe deplin cunoscuți. Se pare că există o interacțiune slabă între KIR2DS1
și moleculele HLA-C Lys80 și între KIR2DS2 și moleculele HLA-C Asn80.
Spre deosebire de KIR-urile inhibitorii, cele activatoare prezintă o mare
varietate și heterogenitate în populația generală și în diverse grupuri etnice.
Circa 25% din caucazieni, care sunt homozigoți pentru așa-numitul
haplotip A, nu posedă receptori KIR activatori, restul, homo- sau heterozigoți
pentru haplotipul B, prezintă gene inhibitorii și variate combinații de gene
activatoare.

97
 În cazul unui transplant de la donator cu NK aloreactive, prezența
haplotipului B la donator se asociază cu scăderea incidenței mortalității legate
de transplant, mortalitate datorată în special infecțiilor.
Receptorii KIR activatori stimulează secreția de citokine și
citotoxicitatea celulelor NK împotriva celulelor infectate, în contextul absenței
selfului, și de asemenea pot controla infecția printr-un mecanism indirect
rezultat din interacțiunea celulelor NK cu celulele dendritice. In vivo, această
interacțiune conduce la o creștere a raportului Th1/Th2 [17,18].
În concluzie, creșterea numărului de transplante de celule stem
hematopoetice cu mismatch HLA este fezabilă în prezent, în condițiile unei
înțelegeri cât mai complete a mismatch-urilor ”permise” și a rolului genelor KIR.

IMUNOGENETICA NON -HLA ȘI TRANSPLANTUL DE CELULE STEM

HEMATOPOETICE

Deși tipizarea HLA rămâne elementul central în selecția donatorilor și

este un factor determinant major în ce privește rezultatele obținute
posttransplant, secvențierea genomului uman a relevat existența a mii de
polimorfisme genice (single nucleotide polymorphisms) a căror semnificație și
importanță în ce privește transplantul autolog rămâne încă a fi elucidată.

Polimorfismul genelor citokinelor

Multe din polimorfismele genelor citokine apar in regiunea reglatoare a

genei și astfel este influențată cantitatea de citokine produsă ca răspuns la un
stimul infecțios sau allogeneic.
Studiile inițiale s-au făcut în transplantul de organe solide și s-a
demonstrat că pacienții cu genotip high-secretor de TNF-α și low-secretor de
IL-10 prezintă risc mai mare de rejet al grefei. Ulterior studiile au fost extinse și
în transplantul de CSH.
GVHD acuta este rezultatul eliberării de citokine proinflamatorii (IL-1,
IL-6, IL-8, TNF-α) în timpul ”furtunii de citokine” consecutivă radioterapiei și
chimioterapiei din regimul de condiționare. La aceasta se adaugă și activarea
limfocitelor T și NK ale donatorului, activare urmată de secreția predominantă
de citokine de tip Th1 (IL-2, IFN-γ, TNF-α ).
Citokinele inflamatorii sunt de asemenea implicate în patogenia
pneumoniei interstițiale, bolii venoocluzive, în susceptibilitatea la infecții sau în
metabolismul medicamentelor.

98
 Un studiu japonez, facut pe pacienți transplantați de la donatori potriviți,
neînrudiți, a arătat o asociere între polimorfismul TNF-863 si 857 la donator
și/sau primitor și o incidență mai mare a GVHD grad III-IV și o rată mai mică
de recădere de boală [19]. Polimorfismele TNF-α (-308) si TNF-β (+1069) s-
au asociat cu complicații toxice [20].
Polimorfismele IL-10 -1082 și -592 determină apariția a trei posibile
haplotipuri care sunt low-, intermediate- sau high-secretoare de IL-10.
Haplotipul low-secretor la primitor se asociază cu GVHD severă la pacienții
tratați numai cu Ciclosporină sau Ciclosporină cu Methotrexat și cu
supraviețuire mai mică [21].
Polimorfismul IL-6 -174G/G la primitor se asociază cu GVHD acut și
cronic.
Polimorfismul IL-1α -889 la donator sau la primitor se asociază cu
îmbunătățirea ratei de supraviețuire și reducerea mortalității legate de transplant
[22].

Antigenele minore de histocompatibilitate

GVHD care apare după un transplant de la frate HLA identic este inițiat
de limfocitele T care recunosc antigene minore de histocompatibilitate ( peptide
derivate din proteinele intracelulare, codate de gene de pe cromozomi
autozomali sau de pe cromozomul Y ). Unele antigene (ex: HA-1, HA-2) se
găsesc numai pe celulele sistemului hematopoietic, iar altele (ex: H-Y, HA-3)
sunt exprimate ubicuitar pe țesuturile normale. Cele codate de gene de pe
cromozomul Y sunt implicate în transplantul cu mismatch de sex. Nepotrivirile
între donator și primitor pentru HA-1, HA-2, HA-4, HA-5 se asociază cu
creșterea incidenței GVHD [23].
Alte gene implicate în apariția complicațiilor posttransplant (GVHD,
episoade infecțioase) includ familia supergenelor receptorilor hormonilor
steroidieni (printre care receptorul pentru estrogen și receptorul pentru vitamina
D), genele care reglează răspunsul gazdei la microorganisme (mieloperoxidaza,
receptorul Fcγ), genele TLRs (Toll-like receptors care activează celulele
prezentatoare de antigen), genele NOD (nucleotide-binding oligomerisation
domain) [24-26].

INCOMPATIBILITATEA ABO ȘI SUPORTUL TRANSFUZIONAL

Aproximativ 15 – 25% din perechile primitor – donator frate HLA-

identic, sunt incompatibile ABO. În transplantul mieloablativ,
incompatibilitatea ABO se asociază cu risc crescut de întârziere în grefarea

99
celulelor roșii, aplazie eritrocitară pură, hemoliză. Mismatch-ul ABO nu
afectează grefarea neutrofilelor, incidența rejetului de grefă, progresia bolii sau
supraviețuirea globală [27].
Posttransplant se adoptă următoarea politică transfuzională:

 pentru incompatibilitate ABO majoră (ex. primitor grup 0-donator grup

A) se utilizează masă eritrocitară de grup 0, indiferent de grupul sanguin
al donatorului sau receptorului, până când anticorpii ABO-specifici ai
primitorului sunt nedetectabili și testul antiglobulinic este negativ;

 pentru incompatibilitate ABO minoră (ex. primitor grup A-donator grup

0) se utilizează masă eritrocitară de grupul donatorului;

 pentru incompatibilitate ABO majoră și minoră (ex. primitor grup B-

donator grup A) se utilizează masă eritrocitară de grup 0, până când
anticorpii ABO-specifici ai primitorului sunt nedetectabili și testul
antiglobulinic este negativ și apoi se trece la grupul donatorului;

RECONSTITUIREA SISTEMULUI IMUN DUPĂ TRANSPLANTUL DE CELULE STEM

HEMATOPOETICE

Transplantul de celule stem oferă un model unic de reconstituire imună

graduală și ilustrează perfect relația dintre tipul imunodeficienței și infecțiile cu
anumiți patogeni [28].
Imediat după regimul de condiționare apare o fază de aplazie până la
regenerarea neutrofilelor de la donator. În această fază există un risc foarte mare
pentru infecții bacteriene, fungice (aspergiloză), virale (în special cu HSV).
A doua etapă, primele 3-4 luni, se caracterizează prin refacerea
celulelor răspunsului imun înăscut (granulocite, monocite, macrofage celule
NK) și printr-o deficiență a imunității celulare. Infecția CMV, datorată în
special reactivării, reprezintă cea mai mare problemă în această fază și, mai
puțin frecvent apar infecții cu virusuri respiratorii/enterice sau adenovirusuri.
În a treia etapă, după 4 luni, majoritatea pacienților prezintă o deficiență
a imunoglobulinelor, în special IgG2. Regenerarea limfocitelor B, CD19+ se
realizează, de obicei, în decursul primului an posttransplant. Primitorii de
transplant alogeneic sunt în mod particular vulnerabili la infecții cu bacterii
încapsulate (S. Pneumoniae, H. Influenzae).

100
PROTOCOL DE EVALUARE A PACIENTULUI ÎN VEDEREA EFECTUĂRII PROCEDURII
DE TRANSPLANT

TESTAREA DONATORULUI
Testele necesare pentru evaluarea pretransplant a donatorului:
o analize de laborator (hemoleucogramă cu frotiu, teste pentru funcţia
hepatică/renală / ionogramă / glucoză / sideremie/feritină/proteina C
o reactivă /coagulare/test de sarcină), ECG, ecografie abdominală,
radiografie pumlmonară – pentru a descoperi eventualele
contraindicaţii.
o Diagnostic virusologic indirect: screening pentru infecţiile cu
virusuri hepatitice (B, C), HIV, herpesvirusuri (CMV, EBV, HSV),
toxoplasma gondii, HTLV 1/2, sifilis.
o Diagnostic virusologic direct: RT-PCR pentru depistarea SARS CoV
2 şi determinarea încărcăturii virale (ADN/ARN) în cazul în care
screening-ul evidenţiază prezenţa unei infecţii virale.
o Markeri tumorali (în special la primitorii peste 50 de ani): AFP,
CEA, CA 125, CA 19-9, CA15-3, PSA.
Tipizarea HLA:
o Se vor testa toţi membrii de familie de gradul I disponibili, respectiv
părinţi şi copii, pentru care se va efectua tipizare HLA cel puţin
pentru alelele HLA-A, B şi DRB1 prin tehnici de biologie
moleculară, minim 2 digits. Aceasta reprezintă testarea iniţială =
proba 1.
o În cazul identificării unui donator familial potenţial compatibil se va
efectua testarea de verificare cu grad de rezoluţie 4 digits = proba 2.
o Tipizarea HLA a unui donator selectat pentru donare trebuie să fie
efectuată obligatoriu pentru alelele - A, B, C, DRB1, DQB1, prin
testarea a 2 probe de sânge distincte (proba 1 = testarea iniţială şi
proba 2 = testarea de verificare), prin 2 tehnici de biologie
moleculară diferite de 4 digits, fără ambiguităţi.
o Tipizarea HLA-DPB1 se va efectua în cazul donatorilor pentru
haplo-transplant şi a donatorilor neînrudiţi.
o În cazul donatorilor neînrudiţi, tipizarea HLA preluată de
RNDVCSH din registrul donatorului este considerată testarea iniţială
(proba 1).

Donatorul trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:

o Compatibiltate HLA 10/10 sau 9/10, respectiv 5/10 în cazul haplo,
pentru alelele HLA-A, B, C, DRB1, DQB1, la nivel de rezoluţie
înaltă, 4 digits

101
 o Fără incompatibilităţi HLA corespunzătoare anticorpilor anti-HLA ai
pacientului
o Fără infecţii active
o Fără boli asociate care contraindică donarea

TESTAREA RECEPTORULUI
Testele necesare pentru evaluarea pretransplant a receptorului:
o Analize de laborator (hemoleucogramă cu frotiu, teste pentru funcţia
hepatică/renală/tiroidiană/ionogramă/glucoză/sideremie/feritină/prote
ina C reactivă /coagulare/test de sarcină).
o Evaluare hematologică: reprezintă totalitatea investigaţiilor ce
evaluează statusul bolii de bază înainte de recoltare sau transplant.
o Investigaţii paraclinice: totalitatea examinărilor şi consulturilor
necesare pentru evaluarea funcţiei diferitelor aparate şi sisteme
înainte de iniţierea procedurii de recoltare sau transplant (radiografii,
examen CT/RMN, EKG, echografie cardiacă, etc).
o Diagnostic virusologic indirect: screening pentru infecţiile cu
virusuri hepatitice (B, C), HIV, herpesvirusuri (CMV, EBV, HSV),
toxoplasma gondii, HTLV 1/2, sifilis.
o Diagnostic virusologic direct: RT-PCR pentru depistarea SARS CoV
2 şi determinarea încărcăturii virale (ADN/ARN) în cazul în care
screening-ul evidenţiază prezenţa unei infecţii virale.
o Examene imunohematologice: reprezintă totalitatea analizelor
realizate pentru determinarea profilului imunohematologic (grup
0AB, fenotip Rh, Kell, Kidd, Duffy, MN al pacientului internat în
vederea recoltării respectiv transplantului de CSH.
o Markeri tumorali (în special la primitorii peste 50 de ani): AFP,
CEA, CA 125, CA 19-9, CA15-3, PSA.

Tipizarea HLA:
o Alelele HLA A, B, C, DRB1, DQB1 efectuată prin testarea a 2 probe
de sânge distincte (proba 1 = testarea iniţială şi proba 2 = testarea de
verificare), prin 2 tehnici de biologie moleculară diferite, 4 digits,
fără ambiguităţi (SBT/NGS).
o Tipizarea HLA-DPB1 se va efectua în cazul pacienţilor care sunt
propuţi pentru haplo-transplant şi/sau transplant de la donator
neînrudit.
Pacienţii propuşi pentru recoltare celule stem, vor fi trecuţi într-un
registru, cu număr de înregistrare şi dată, nume, prenume, vârstă, sex,

102
diagnostic, medic curant, dacă este considerat urgenţă şi data de programare
pentru internare pentru recoltarea de celule stem, respectiv analize ulterioare
necesare pentru completarea dosarului, versus negarea indicaţiei efectuării
procedurii cu motivul acestuia. Registrul de prelevare a celulelor stem
reprezintă act medical şi poate fi controlat de autorităţile competente.
Lista de aşteptare pentru recoltare va fi actualizată lunar. Pacienşii propuşi
pentru autotransplant vor fi chemaţi la recoltare în ordinea numerică în care se află
pe lista de aşteptare şi de numărul de paturi libere disponibile pe secţie.

ÎN CAZUL CAZURILOR CU DONATOR COMPATIBIL NEÎNRUDIT

Dosarele cu privire la propunerea pacienţilor către allotransplant

medular cu CSH de la donator neînrudit trebuie să conţină:
• Formularul – „Prezentarea unui pacient pentru allotransplant cu CSH
de la donator neînrudit” completat în întregime, semnat, datat şi parafat de
medicul curant;
• Referat medical de la medicul curant cu istoricul bolii, data
diagnosticului, tratamentul efectuat, complicaţiile asociate, comorbidităţiile
pacientului şi statusul actual al bolii;
• Tipizarea HLA (A, B, C, DRB1, DQB1) prin metode de rezoluţie
înaltă - în 4 digits a pacientului – efectuată pe două probe de sânge distincte.
HLA-DPB1 va fi testat pentru a putea fi luat în considerare la selectarea unui
donator neînrudit compatibil, în cazul în care sunt disponibili mai mulţi
donatori 10/10.
Medicul care propune pacientul în vederea efectuării procedurii şi
completează formularul de transplant medular va specifica pe formular: dacă
consideră pacientul ca fiind urgenţă de transplant, criteriul pentru care consideră
pacientul urgenţă şi va propune o dată în vederea efectuării procedurii, dacă
pacientul este considerat urgenţă.
Dosarele cu privire la propunerea pacienţilor către procedura de
transplant medular de CSH vor fi trimise către centrul de transplant medular
prin următoarele prin: poştă/fax/mail.
Dosarele primite pentru allotransplant medular de la donator neînrudit
vor fi discutate şi analizate de către „Comisia de Transplant Medular a
Centrului Universitar” unde sunt trimise. Aceasta are obligaţia de a accepta sau
de a respinge dosarele propuse. Decizia „Comisia de Transplant Medular a
Centrului Universitar” va fi comunicată în scris medicului curant.
Pacienţii a căror dosare au fost acceptate în vederea efectuării procedurii
de allotransplant medular de la donator neînrudit vor fi trecuţi pe lista de
aşteptare de allotransplant medular cu CSH, în ordine numerică, după ultimul
pacient programat. Dacă pacientul este considerat urgenţă de transplant sau
devine urgenţă de transplant, este trecut pe lista de aşteptare, ţinând cont de

103
indicaţiile medicului curant, fiindu-i găsită prima dată disponibilă în cadrul
acesteia. Înscrierea pe lista de aşteptare a pacienţilor propuşi pentru
allotransplant cu CSH se va face de către personalul medical al secţiei.
Pacienţii propuşi pentru allotransplant medular de la donator neînrudit,
vor fi trecuţi în „Registrul pacienţilor pentru allotransplant medular de la
donator neînrudit” cu număr de înregistrare, nume, prenume, vârstă, diagnostic,
medic curant şi unde este cazul caracterul de urgenţă. „Registrul pacienţilor
pentru allotransplant medular de la donator neînrudit” se găseşte în Secţia
Transplant Medular, şi poate fi completat doar de către medicii titulari ai
secţiei.
Lista de aşteptare pentru allotransplant medular va fi actualizată lunar şi
poate fi consultată la solicitarea autoritătţilor.
Odată cu identificarea donatorului, ţinând cont de ordinea în care
pacienţii se află pe lista de aşteptare, bolnavii consideraţi eligibili pentru
allotransplant medular de la donator neînrudit, vor fi trecuţi pe panoul de
programări. În ordinea în care se află pe panoul de programări, pacienţii vor fi
chemaţi la internare în vederea efectuării procedurii în funcţie de numărul de
paturi libere disponibile pe secţie.

ASPECTE LEGATE DE DONATOR

ALEGEREA DONATORULUI

Recomandări generale:
Principiul de bază al alegerii donatorului fie că vorbim de un donator înrudit sau
de un donator neînrudit, îl reprezintă compatibilitatea HLA. Tipizarea HLA se
face prin metode moleculare prin analiza ADN-HLA (SBT, NGS de rezoluţie
înaltă 6-8 digits). Tipizarea iniţială se face prin metode de rezoluţie joasă (2
digits) apoi prin metode de rezoluţie înaltă (4 digits – 2 probe distincte,
succesive). Verificarea tipizării HLA este obligatorie şi se face printr-o metodă
de rezoluţie înaltă (4 digits – SBT sau 6-8- digits NGS).
În afara compatibilităţii HLA importante în alegerea donatorului sunt:
o Sexul donatorului – preferabil sexul masculin
o Vârsta - preferabil donatorul mai tânăr
o Compatibilitatea de grup 0AB
o Statusul CMV la donator şi primitor – preferabil un donator cu anticorpi
anti-CMV negativi sau primitorul şi donatorul să aibe acelaşi status: +/+
sau -/-
Protocol de alegere a donatorului:
o HLA de la frate/soră - transplant de la donator înrudit HLA compatibil 10/10
= HLA A, B, C, DRB1, DQB1/ HLA singeneic (frate/soră univitelini).

104
o HLA de la donator neînrudit (transplant de la donator neînrudit HLA
compatibil 10/10 = HLA A, B, C, DRB1, DQB1);
o HLA neînrudit cu mismatch (transplant de la donator neînrudit HLA
compatibil 9/10 = HLA A, B, C, DRB1, DQB1);
o Haploidentic (transplant de la donator înrudit cu mismatch, compatibilitate
minim 5/10 şi mai mică de 9/10) - cu identificarea confirmată a haplotipului
comun. Cu excepţia rudelor de gradul I, este obligatoriu studiul familial
pentru confirmarea haplotipului comun.
Donatorul înrudit HLA 10/10 compatibil (prin tipizare de rezoluţie înaltă)
reprezintă încă “gold standard” în allotransplantul de celule stem
hematopoietice.
o Dacă pacientul are mai mulţi fraţi/surori compatibili HLA 10/10, se va
alege de preferinţă donator bărbat, tânăr, compatibil din punct de vedere
al grupului sanguin 0AB.
o Alt criteriu de alegere este statusul CMV (se preferă acelaşi status CMV
donator/primitor, iar când pacientul este CMV IgG pozitiv se preferă
donator cu CMV IgG pozitiv).
Donatorul neînrudit HLA 10/10, găsit în timp util, reprezintă varianta a doua de
donator preferat.
Donatorul neînrudit cu MM (HLA 9/10): toate mismatch-urile antigenice sau
alelice reprezintă un risc crescut de boală de grefă contra gazdă, de rejet sau de
complicaţii de tip imun şi infecţios, având astfel impact asupra mortalităţii şi
supravieţuirii. În literatura de specialitate se descriu mismatch-urile antigenice
ca fiind mai imunogenice decât cele alelice. În ultimii ani aceste diferenţe par să
se estompeze prin diversificarea regimurilor de condiţionare şi a metodelor şi
schemelor de profilaxie a bolii de grefă contra gazdă. Doar în locusul C rămâne
valabil imunogenicitatea mai mare a incompatibilităţii antigenice decât alelice.
Algoritmul de alegere a donatorului cu MM (HLA 9/10- HLA A, B, C, DRB1,
DQB1) în ordinea preferinţei mismatch-ului este:

105
 Donatorul haploidentic înrudit HLA 5/10, este o opţiune atunci când:
o pacientul nu are donator înrudit (frate/soră), (HLA-A, B, C, DRB1, DQB1
10/10 sau 9/10). HLA compatibil 10/10 pentru alelele A, B, C, DRB1 şi
DQB1 sau 9/10 cu evidenţa de crossing-over prin studiu familial.
o donatorul înrudit (frate/soră), ( 10/10 sau 9/10 definit mai sus) nu doreşte să
doneze.
o donatorul sibling (10/10 sau 9/10 definit mai sus) are o afecţiune care
contraindică donarea.
o nu s-a găsit un donator neînrudit după 3 luni de căutare în registrele
internaţionale
o în condiţii de urgenţă care nu permit căutarea unui donator neînrudit
o în condiţii epidemiologice rare
Criteriile în funcţie de care se alege cel mai potrivit donator pentru procedura
de haplotransplant de CSH sunt:
 Prezentă/absenţa anticorpilor specifici donatorului (DSA)
 Vârsta (cât mai tanar)
 Sex (de preferat bărbat )
 Grad de rudenie (fraţi/surori > copii > părinţi > veri, etc)
 Grup sanguine 0AB de preferat grup în grup sau incompatibilitate
minoră)

106
  CMV pozitiv/negativ (dacă pacientul este CMV IgG pozitiv se preferă
donator cu acelaşi status CMV)
 Prezenţa DSA (a anticorpilor specifici anti-HLA-ul donatorului):
prezenta DSA creşte riscul de reject de 10 ori. Cutoff-ul de pozitivitate
este MFI>1500 (MFI – mean fluorescence intensity). Riscul de rejet
apare la MFI>1500. Dacă nu există altă variantă de donator se vor aplica
tratamente de desensibilizare a pacientului.
 Pentru limfoamele maligne, transplantul haploidentic poate fi o
opţiune prioritară, datorită rezultatelor similare sau chiar mai bune
(cu rată mai mică de apariţie a GVHD) comparativ cu HLA
neînrudit.
Evaluarea, aviyarea şi donarea pentru donatorul sănătos înrudit de celule stem
hematopoietice se efectuează strict conform protocolului stabilit, pentru
siguranţă, atât a donatorului cât şi a receptorului de celule stem, şi se efectuează
în secţiile/compartimentele de transplant medular.

Etapele pe care le parcurge donatorul înrudit de celule stem hematopoiteice

sunt:
o Evaluarea statusului clinic, biologic şi a consimţământului donatorului
în vederea eligibilităţii pentru donarea de CSH
 Donatorul sănătos înrudit de celule stem este invitat la o discuţie
preliminară cu medicul din transplant care va prelua pacientul,
moment în care i se va descrie în detaliu procedura de donare de
celule stem, precum şi beneficiile pentru persoana care va primi
aceste celule. De asemenea se vor explica riscurile celor două
proceduri de donare: CSH din periferie sau din măduva osoasă.
 La această discuţie preliminară se efectuează şi o anamneză a
donatorului.
 Se înmânează Formularul de consimtământ informat şi Chestionar de
evaluare a riscului de transmitere a bolilor infecţioase de către
donatorii de ţesuturi/celule conform legii 95/2006).
 Se explică donatorului cele două documente şi se oferă informaţii
legate de donare.
 De asemenea, va primi un numar de telefon de contact, prin care se
va putea reprograma pentru explicarea eventualelor nelămuriri legate
de procedura de recoltare de celule stem.

107
Evaluarea clinică şi biologică cuprinde:

 Grup sanguin, fenotip Rh-Kell, anticorpi iregulari

 Hemogramă cu frotiu de sânge periferic şi reticulocite
 CRP
 Coagulare
 Test de sarcină (femei), PSA/PSA liber (bărbaţi)
 Biochimie completă (AST, ALT, BT, BD, FAS, GGT,
proteine totale, albumină, globuline LDH, uree, creatinină,
acid uric, glicemie, colesterol, trigliceride, lipază, amilază,
sodiu, potasiu, calciu, magneziu, fier, feritină)
 Proba de chimerism pretransplant
 Urocultura, coprocultura/tampon rectal, exudat faringian şi
nazal
 AgHbs, anti Hbc, anti Hbs, antiVHC, sifilis, anticorpi IgG şi
IgM pentru HIV, HTLV, CMV, EBV, toxoplasmă
 Testare HLA de verificare
 Testare anticorpi anti HLA ai primitorului împotriva
donorului pentru haplotransplant
 FT3, FT4, TSH
 Investiigaţii imagistice la nevoie

o Consult ATI
 Pentru montarea cateterului, în cazul recoltării CSH din sângele
periferic
 Pentru anestezie generală, în cazul recoltării de MO
După rezultatele anamnezei, examenului obiectiv, probelor biologice şi
imagistice, verificarea compatibilităţii HLA pe proba de verificare, şi prezenţa
titrului de anticorpi anti HLA în caz de haplotransplant, medicul din transplant
stabileşte dacă donatorul este eligibil.

Criteriile de excludere de la donare sunt:

o Refuzul de a semna consimţământul informat
o Sarcina
o Hepatita B acută sau cronică activă (ADN VHB prezent)
o Seropozitivitate pentru VHC, HIV, HTLV
o Infecţie sistemică care nu poate fi controlată la momentul donării
o Boli psihice: personalitate multiplă sau psihoză
o Existenţa unor factori de risc de transmitere de boli infecţioase pe baza
răspunsurilor

108
 o Antecedente de neoplazie sau neoplazie activă (excepţie carcinom
bazocelular şi carcinoma cervical in situ excizate chirurgical)
o Afecţiuni cardiovasculare sau respiratorii severe (Covid 19)
o Boli autoimune sistemice cu risc de transmitere către pacient sau cu risc
de agravare pentru donator
o Rezultate, teste de laborator anormale semnificativ sau suspiciunea clinică
de risc potenţial pentru donator
o Risc de transmitere de boli cauzate de prioni (boala Creutzfeldt-Jacob
CJD).
o Imunizare sau vaccinare cu virusuri vii atenuate în ultimele 8 săptămâni.

În condiţiile în care donatorul este de acord şi semnează consimţământul

informat şi este apt de donare, acesta se va prezenta împreună cu pacientul
pentru care donează celulele în faţa Comisiei de Avizare a Donării de la Donator
Viu a Centrului de Transplant, comisie alcătuită din 3 membri numiţi prin Ordin
de Ministrul Sănătăţii Publice. Donatorul şi primitorul vor semna un înscris
autentic prin care declară că donarea se face în scop umanitar, are caracter
altruist şi nu constituie obiectul unor acte şi fapte juridice în scopul obţinerii
unui folos material sau de altă natură, conform modelului de formular aprobat
prin ordin al ministrului sănătăţii. Comisia va evalua atât donatorul cât şi
primitorul pentru stabilirea motivaţiei donării şi va consemna în formularele
specifice dacă actul donării se încadrează în condiţiile legii. După avizul
comisiei se poate demara procedura de recoltare de celule stem.
Dacă donatorul nu este de acord cu procedura de recoltare de celule stem
din măduva osoasă, în cazul eşecului de mobilizare, atunci recoltarea se va iniţia
anterior începerii procedurii de condiţionare a pacientului pentru allotransplant
şi celulele stem recoltate se vor crioprezerva până la folosirea ulterioară.
Dacă donatorul îşi dă acordul pentru ambele proceduri, atunci procedura
de recoltare se poate efectua în acelaşi timp cu condiţionarea pacientului, şi
grefonul obţinut se va administra proaspăt.

Internarea în vederea donării de celule stem hematopoietice

Evaluarea la internare, care va cuprinde:
 Evaluare clínică
 Hemograma cu frotiu de sânge periferic,
feritină, biochimie, coagulare, CRP.
 Virusologie (VHB, VHC, CMV, EBV,
TOXOPLASMA, HTLV, HIV, SIFILIS)

109
  Tipizare de verificare HLA A, B, C, DRB1,
DQB1, DPB1 în 4 digits
 Ecografie abdominală
 Radiografie pulmonară
 EKG
 Grup, Rh

Se începe administrarea de G-CSF 10-15 microg/kgc subcutanat divizat la

12 ore timp de 4-5 zile.
Pe perioda internării donatorul este monitorizat din punct de vedere clinic
şi biologic. Se va urmări apariţia reacţiilor adverse la factorul de creştere
granulocitar (durere, inflamaţie, discomfort la nivelul locului de administrare,
cefalee, dureri osoase sau musculare, sindrom pseudogripal). Se vor trata aceste
reacţii simptomatic. În mod excepţional (1 : 10 000 cazuri) există riscul de
ruptură de splină, motiv pentru care se va evalua prompt orice durere
abdominală nou apărută.
În ziua 4 se recoltează nivelul celulelor stem CD 34 + prin flowcitometrie,
în sângele periferic şi, în cazul în care donatorul nu are abord venos periferic
satisfăcător, se montează CVC femural prin transfer temporar în secţia de ATI.
În ziua 4 sau 5 de la iniţierea G-CSF donatorul este trimis în
compartimentul de afereze –pentru recoltarea de celule stem conform
procedurii.
La finalul procedurii de afereză, sau în ziua urmatoare, după aflarea
rezultatului numărătorii CD 34+, dacă grefonul recoltat este insuficient, se va
efectua a doua recoltare de celule stem în ziua 5 sau 6. În cazul în care pacientul
este internat şi se efectuează procedeul de condiţionare, grefonul va fi
administrat proaspăt în ziua a 6-a. În caz contrar, grefa va fi crioprezervată
pentru utilizare ulterioară.
După certificarea succesului recoltării (peste 2 x 10 6 celule CD34
pozitive) se scoate CVC femural cu supraveghere medicală, urmat de compresie
locală de minim 15 minute, de aplicaţie de pansament compresiv, gheaţa local şi
imobilizare în clinostatism cu membrul inferior nemişcat timp de minim 2 ore.
Ulterior donatorul se poate mobiliza şi poate fi externat cu recomandarea de a
evita eforturile fizice pentru o perioada de 7-10 zile.
Dacă donatorul are contraindicaţie, sau nu doreşte donarea de celule
stem periferice, sau la numărătoarea de CD 34+ se stabileşte eşec de
mobilizare, se va efectua prelevare de celule stem din maduva osoasă.

110
 La externare se recomandă evaluare clinicobiologică la o lună, 3 luni,
6 luni şi un an postdonare şi ulterior la nevoie justificată, evaluari prevazute
de lege (art. 144 legea nr. 95 din 2006).
Evaluarea, aviyarea şi donarea pentru donatorul sănătos neînrudit de
celule stem hematopoietice este supusă strict unui protocol riguros pentru
siguranţă, atât a donatorului cât şi a receptorului de celule stem, dar NU se
efectuează în secţiile/compartimentele de transplant medular ci în secţiile de
hematologie din cadrul centrelor de transplant, pentru a nu exista posibilitatea
întâlnirii donator/primitor, dacă donatorul este din Romania.
Urmează aceleaşi etape ca şi donatorul înrudit, doar că la distantă de
secţiile/compartimentele de transplant medular.

TESTARE COMPATIBILITATE CROSS-MATCH /IMUNIZAREA ANTI-HLA

Pentru toţi pacienţii candidaţi pentru transplant se va efectua testul de

Screening pentru anticorpi anti-HLA, la momentul testării iniţiale sau al testării
de verificare. Este recomandată repetarea testului de Screening pentru anticorpi
anti-HLA înainte de iniţierea procedurii de transplant medular.
Pentru toţi pacienţii candidaţi pentru haplotransplant şi pentru pacienţii
care urmează a primi un transplant 9/10 se va efectua, la momentul testării de
verificare, testul de screening a anticorpilor Anti-HLA clasa I şi clasa II, pentru
decelarea anticorpilor HLA anti-donor specifici (DSA).
În cazul în care anticorpii anti HLA sunt pozitivi, se continuă cu
identificarea acestora. Dacă intervalul de timp până la iniţierea procedurii de
transplant depăşeste 3 săptămâni, identificarea anticorpilor anti-HLA clasa I şi
clasa II trebuie repetată dacă screening-ul anti-HLA a fost pozitiv.

111
 BIBLIOGRAFIE

[1]. Ljungman P, Urbano-Ispizua A, Cavazzana-Calvo M, et al. Allogeneic and autologous

transplantation for haematological disease, solid tumors and immune disorders:
Definitions and current practice in Europe. Bone Marrow Transplant 2006; 37: 439-449

[2]. Niederweiser D, Gentilini C, Hegenbart U, et al. Transmission of donor illness bz stem

cell transplantation: should screening be different in older donors? Bone Marrow
Transplant 2004; 34: 657-665

[3]. Petersdorf EW. Risk assessment in hematopoietic stem cell transplantation. Best Pract Res
Clin Haematol 2007; 20: 155-170

[4]. Hurley CK, Wagner JE, Setterholm MI, Confer DL. Advances in HLA: Practical
implications for selecting adult donors and cord blood units. Biol Blood Marrow
Transplant 2006; 12: (1 Suppl 1): 28-33

[5]. Tiercy JM. The rol of HLA in HSCT. The EBMT Handbook, 5th edition 2008; 46-92

[6]. Shaw BE, Marsh SG, Mayor NP, et al. HLA- DPB1 matching status has significant
implications for recipients of unrelated donor stem cell transplants. Blood 2006; 107:
1220-1226

[7]. Morishima Y, Sasazuki T, Inoko H, et al. The clinical significance of HLA allele
compatibility in patients receiving a marrow transplant from serologically HLA-A, B, DR
matched unrelated donors. Blood 2002; 99: 4200-4206

[8]. Flomenberg N, Baxter-Lowe LA, Confer D, et al. Impact of HLA class I and class II high
resolution matching on outcomes of unrelated donor bone marrow transplantation. Blood
2004; 104: 1923-1930

[9]. Gluckman E, Rocha V. Donor selection for unrelated cord blood transplants. Curr Op
Immunol 2006; 18: 565-570

[10]. Tiercy JM, Bujan-Lose M, Chapuis B, et al. Bone marrow transplantation with unrelated
donors: What is the probability of identifying an HLA-A/B/C/w/DRB1/B3/B5/DQB1-
matched donor? Bone Marrow Transpl 200; 26: 437-441

[11]. Warrington KJ, Takemura S, Goronzy JJ, Weyand CM. CD4+,CD28- T cells in
rheumatoid arthritis patients combine features of the innate and adaptive immune systems.
Arthritis Rheum 44:13; 2001.

112
[12]. Martin MP, Nelson G, Lee JH, Pellett F, et al. Susceptibility to Psoriatic Arthritis:
Influence of Activating Killer Ig-Like Receptor Genes in the Absence of Specific HLA- C
Alleles. J Immunol 169:2818; 2002.

[13]. Martin MP, Gao X, Lee JH, Nelson GW, Detels R, Goedert JJ, Buchbinder S, Hoots K,
Vlahov D, Trowsdale J, et al. Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B
delays the progression to AIDS, Nat Genet 31:429; 2002.

[14]. Yawata M, Yawata N, Draghi M, et al. Roles for HLA and KIR polymorphisms in natural
killer repertoire selection and modulation of effector function. J Exp Med 2006; 203: 633-
645

[15]. Gloor JM, Sethi S, Stegall MD, et al. Transplant glomerulopathy: subclinical incidence
and association with alloantibody. Am J Transplant. 2007;7:2124.

[16]. Issa N, Cosio FG, Gloor JM, et al. Transplant glomerulopathy: risk and prognosis related
to anti-human leukocyte antigen class II antibody levels. Transplantation. 2008;86:681.

[17]. Hidalgo LG, Campbell PM, Sis B, et al. De novo donor-specific antibody at the time of
kidney transplant biopsy associates with microvascular pathology and late graft failure.
Am J Transplant. 2009;9:2532.

[18]. Hodges AM, Lyster H, McDermott A, et al. Late antibody-mediated rejection after heart
transplantation following the development of de novo donor-specific human leukocyte
antigen antibody. Transplantation. 2012;93:650

[19]. Taner T, Stegall MD, Heimbach JK. Antibody-mediated rejection in liver transplantation:
current controversies and future directions. Liver Transpl. 2014;20:514–527

[20]. Niederhaus SV, Leverson GE, Lorentzen DF, et al. Acute cellular and antibody-mediated
rejection of the pancreas allograft: incidence, risk factors and outcomes. Am J Transplant.
2013;13:2945

[21]. Patel R, Terasaki PI: Significance of the positive crossmatch test in kidney transplantation.
N Engl J Med 280: 735–739, 1969

[22]. Halloran PF, Wadgymar A, Ritchie S, Falk J, Solez K, Srinivasa NS: The significance of
the anti-class I antibody response. I. Clinical and pathologic features of anti-class I-
mediated rejection. Transplantation 49: 85–91, 1990

113
[23]. Mauiyyedi S, Crespo M, Collins AB, Schneeberger EE, Pascual MA, Saidman SL,
Tolkoff-Rubin NE, Williams WW, Delmonico FL, Cosimi AB, Colvin RB: Acute humoral
rejection in kidney transplantation: II. Morphology, immunopathology, and pathologic
classification. J Am Soc Nephrol 13: 779–787, 2002

[24]. Herzenberg AM, Gill JS, Djurdjev O, Magil AB: C4d deposition in acute rejection: An
independent long-term prognostic factor. J Am Soc Nephrol 13: 234–241, 2002

[25]. Bohmig GA, Exner M, Habicht A, Schillinger M, Lang U, Kletzmayr J, Saemann MD,
Horl WH, Watschinger B, Regele H: Capillary C4d deposition in kidney allografts: A
specific marker of alloantibody-dependent graft injury. J Am Soc Nephrol 13: 1091–1099,
2002

[26]. Lorenz M, Regele H, Schillinger M, Exner M, Rasoul-Rock enschaub S, Wahrmann M,

Kletzmayr J, Silberhumer G, Horl WH, Bohmig GA: Risk factors for capillary C4d
deposition in kidney allografts: Evaluation of a large study cohort. Transplantation 78:
447–452, 2004

[27]. Racusen LC, Colvin RB, Solez K, Mihatsch MJ, Halloran PF, Campbell PM, Cecka MJ,
Cosyns JP, Demetris AJ, Fishbein MC, Fogo A, Furness P, Gibson IW, Glotz D, Hayry P,
Hunsickern L, Kashgarian M, Kerman R, Magil AJ, Montgomery R, Morozumi K,
Nickeleit V, Randhawa P, Regele H, Seron D, Seshan S, Sund S, Trpkov K: Antibody-
mediated rejection criteria: An addition to the Banff 97 classification of renal allograft
rejection. Am J Transplant 3: 708–714, 2003

[28]. Regele H, Bohmig GA, Habicht A, Gollowitzer D, Schillinger M, Rockenschaub S,

Watschinger B, Kerjaschki D, Exner M: Capillary deposition of complement split product
C4d in renal allografts is associated with basement membrane injury in peritubular and
glomerular capillaries: A contribution of humoral immunity to chronic allograft rejection.
J Am Soc Nephrol 13: 2371–2380, 2002

[29]. Piazza A, Poggi E, Borrelli L, Servetti S, Monaco PI, Buonomo O, Valeri M, Torlone N,
Adorno D, Casciani CU: Impact of donor-specific antibodies on chronic rejection
occurrence and graft loss in renal transplantation: Posttransplant analysis using flow
cytometric techniques. Transplantation 71: 1106–1112, 2001

[30]. Vongwiwatana A, Tasanarong A, Hidalgo LG, Halloran PF: The role of B cells and
alloantibody in the host response to human organ allografts. Immunol Rev 196: 197–218, 2003

114
[31]. Hourmant M, Cesbron-Gautier A, Terasaki PI, Mizutani K, Moreau A, Meurette A, Dantal
J, Giral M, Blancho G, Cantarovich D, Karam G, Follea G, Soulillou JP, Bignon JD:
Frequency and clinical implications of development of donor-specific and non-donor-
specific HLA antibodies after kidney transplantation. J Am Soc Nephrol 16: 2804–2812,
2005

[32]. Martin L, Guignier F, Mousson C, Rageot D, Justrabo E, Rifle G: Detection of donor-

specific anti-HLA antibodies with flow cytometry in eluates and sera from renal transplant
recipients with chronic allograft nephropathy. Transplantation 76: 395–400, 2003

[33]. American Society for Histocompatibility and Immunogenetics, http://www.ashi-hla.org

[34]. Baxter-Lowe, L.A, and Colombe, B.W., Histocompatibility Testing (19), in Lange
Medical Immunology, Tenth Edition, 2001.

[35]. Callaghan, C. J., and Bradley, J. A., Current status of Renal Transplantation Cpt. 1 in
Transplantation Immunology Methods and Protocols edited by Philip Horniclx, Marlene
Rose, Humana Press Inc. 2006.

[36]. Campbell, R.D. and Trowsdale, J. Immunology Today 18, 43, 1997.

[37]. Cecka, J.M. and Reed F.E., Histocompatibility Testing, Cross-Matching, and Allocation of
Kidney Transplants in Handbook of Kindey Transplantation, Fourth Edition, Gabriel M.
Danovitch, 2005 by Lippincott Williams & Wilkins.

[38]. Cecka, J.M., The role of HLA in renal transplantation. Human Immunology 56: 6-16,
1997.

[39]. Chua, M.S., Sarwal, M. Microarrays: New tools for transplantation research. Pediatric
Nephrology, 18:319-327, 2003.

[40]. Danovitch, G.M., Handbook of Kindey Transplantation Fourth Edition, Lippincott

Williams & Wilkins, 2005

[41]. De Meester, J., Persijn, G.G., Claas, F.H.J., Frei, U: In the queue for a cadaver donor
kidney transplant: new rules and concepts in the Eurotransplant International Foundation.
Nephrology Dialysis Transplantation 15,3, 333-338, 2000.

[42]. European Bioinformatics Institute, http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla

[43]. Gilks, W.R., Gore, S.M., Bradley, B.A., Matchability in kidney transplantation. Tissue
Antigens; 32:121-129, 1988.

115
[44]. Hariharan, S., McBride, M.A., Cherikh, W.S., Tolleris, C. B., Bresnahan, B. A., and
Johnson, C. P., Posttransplant renal function in the first year predicts long-term kindey
transplant survival. Kidnei Int. 62, 311-318, 2002.

[45]. Harrison, J, Navarrete, C., Selection of Platelet Donors and Provision of HLA Matched
Platelets, in Histocompatibilitz Testing. Imperial Collage Press, 2000; 379

[46]. Herczyk, W.F., Luminex, Vendor Forum, ASHI Quarterly, 104, Third Quarter, 2003.

[47]. Janeway, C.A., Travers P: Antigen recognition by T lymphocytes. Ed 3 Immunobiology

41-46, 1997, Garland Publishing, New York and London.

[48]. Jerius, J. T., Taylor, R. J., Murillo, D., and Leone, J. P. Double renal transplants from
marginal donors: 2-year results. Journal of Urology, 163, 423-425, 2000.

[49]. Johnson, A.H., Katovich, Hurley. C., Hartzman, R.J., Wade, J.A., Human Leucocyte
Antigen: The Major Histocompatibility Complex of Man, 40, 927-946, in Clinical
Diagnosis and Management by Laboratory Methods, John Bernard Henry, M.D., 2001,
Saunders, Twentieth Edition.

[50]. Little, A-M., Parham, P: Polymorphism and evolution of class I and class II genes and
molecules. Reviews in Immunogenetisc, 1Ş105-123, 1999.

[51]. Lucas, D.P., Paparounis, M.L., Meyers, L., Mart, J.M., Zachary, A.A.: Detection of HLA
class I specific antibodies by the QuikScreen Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Clin
Lab Diagn Lab Immunol, 1997;4:252

[52]. Luminex Corporation, 1998-2000. Luminex 100 User Manual Version 1.7 Rev B.

[53]. Marsh, S.G.E., Parham, P. Barber., Barber L.D., The HLA FactsBook, Academic Press,
2000.

[54]. Moore, S.B., Ploeger, N.A., DeGoey, S.R.: HLA antibody screening: Comparison of a
solid phase enzyme-linked immunoassay with antiglobulin augmented
lymphocytotoxicity. Transplantation 1997; 64:1617.

[55]. Nyberg, S. L., Matas, A. J., Kremers, W. K., et. al. Improved scoring system to assess
adult donors for cadaver renal transplantation. American Journal of Transplantation. 3,
715-721, 2003.

[56]. Rhodes, D.A., Trowsdale, J.: Genetics and molecular genetics of the MHC. Reviews in
Immunogenetics, 1:21-31, 1999.

[57]. Rodey Glenn E. HLA Beyond Tears. De Novo, Inc. 2000;213.

116
[58]. Sanger Centre, http://www.sanger.ac.uk./HGP/Chr6/MHC/shtml

[59]. Thelan, D., Rodey, G., American Society of Histocompatibility and Immunogenetics
Laboratory Manual, edn. Lenxa, K.S: ASHY.

[60]. Trowsdale, J. Immunogenetics 41,1-17,1995.

[61]. Trowsdale, J. In HLA and MHC: Genes, Molecules and Function (Browning, M. And
McMichael, A. Eds), 1996, Bios Scientific Publishers, Oxford.

[62]. Williams, T.M., Human Leucocyte Antigen Gene Polymorphism and the
Histocompatibility Laboratory, The Journal of Molecular Diagnostics, 3, 3, 2001.

[63]. Wujciak, T., Opelz, G., Matchabililty as an important factor for kidney allocation
according to the HLA Match. Transplantation Proceedings; 27: 1403-1405, 1997.

[64]. Zachary, A.A., Delaney, N.C., Lucas, D.P., Laffell, M.S., Characterization of HLA Class I
Specific Antibodies by ELISA Using Solubilized Antigen Targets: I. Evaluation of the
GTI Quik-ID Assay and Analysis of Antibody Patterns. Human Immunology 2001; 62:3,
228-235

[65]. Becherucci F, Roperto RM, Materassi M, Romagnani P. Chronic kidney disease in

children. Clin Kidney J, 2016; 9(4): 583–591. doi: 10.1093/ckj/sfw047

[66]. Maurer E, Neuhaus T, Weitz M, Kuehni C, Laube G. Paediatric end-stage renal disease
and renal replacement therapy in Switzerland: survival and treatment trends over four
decades. Swiss Med Wkly, 2020;150: w20300. doi: 10.4414/smw.2020.20300

[67]. Pleavă R, Moșteoru S, Dumitrescu A. The management of patients with kidney chronic
disease. Medichub Media, 2016. Reference to a website:
https://www.medichub.ro/managementul-pacientilor-cu-boala-cronica-de-rinichi-id-181-
cmsid-62

[68]. BA. Warady, V Chadha. Chronic kidney disease in children: the global perspective.
Pediatr Nephrol, 2007; 22(12): 1999–2009. doi: 10.1007/s00467-006-0410-1

[69]. N Nishimura, M Kasahara, K Ishikura, S Nakagawa. Current status of pediatric

transplantation in Japan. J Intensive Care, 2017; 5:48. doi:10.1186/s40560-017-0241-0 [6]
SE Lipshultz, JJ Chandar, PG Rusconi, A Fornoni, CL Abitbol, GW Burke, GE
Zilleruelo, SM Pham, EE Perez, VR Karnik, JA Hunter, DD Dauphin, JD Wilkinson.
Issues in solid-organ transplantation in children: translational research from bench to
bedside. Clinics, 2014; 69: 55-72. doi: 10.6061/clinics/2014(Sup01)11

117
[70]. SI Alexander, SB Younes, D Zurakowski, N Mirza, D Dubey, MP Drew, WE Harmon, JJ
Yunis. Cell-mediated cytotoxicity: a predictor of chronic rejection in pediatric HLA
haploidentical renal transplants. Transplantation, 1997; 27;63(12):1756-61.

[71]. doi: 10.1097/00007890-199706270-00009

[72]. Andrea A. Zachary, Mary S. Leffell. (2013) Transplantation Immunology: Methods and
Protocols, Second Edition, Humana Press, pp. 3-30

[73]. R.G. Lahita, G. Tsokos, J. Buyon, T. Koike, (2011) Systemic Lupus Erythematosus, Fifth
Edition, Academic Press, pp. 3-21

[74]. Fernando Michelle Stevens, Christine C. Walsh, Emily De Jager, Philip Goyette, Philippe
M. Plenge, Robert Vyse, Timothy D. Rioux, John. (2008) Nomenclature of HLA and non-
HLA alleles, ResarchGate,

[75]. M.L. Turgeon (2014) Immunology and Serology in Laboratory Medicine, Elsevier, pp.
436-460

[76]. CF Lee, CH Cheng, YC Wang, RS Soong, TH Wu, HS Chou, TJ Wu, KM Chan, CS Lee,
WC Lee. Adult Living Donor Liver Transplantation Across ABO-Incompatibility,
Medicine Baltimore, 2015, vol.94, No.42: e1796

[77]. EP Weledji. Benefits and risks of splenectomy, International Journal of Surgery, 2014,
Volume 12, Issue 2, pp. 113-119

[78]. Kute VB, Vanikar AV, Trivedi HL, Shah PR, Goplani KR, Patel HV, Gumber MR, Patel
RD, Kanodia KV, Suthar KS, Trivedi VB, Modi PR. Desensitization protocol for highly
sensitized renal transplant patients: A single-center experience. Saudi journal of kidney
diseases and transplantation, 2011, 22(4):662-9

[79]. Moise, C. Baston, N. Cucu, L. D. Ursu, M. M. Iacob, Ileana Constantinescu, (2017)

Challenges and Clinical Significance of Virtual Crossmatch in Kidney Transplantation:
Our Experience, SM J Urol. 2017; 3(3): 1032

[80]. A Piazza, G Ozzella, E Poggi, D Caputo, A Manfreda, D Adorno. Virtual crossmatch in

kidney transplantation. Transplant Proc 2014 Sep;46(7):2195-8.

[81]. doi: 10.1016/j.transproceed.2014.07.053.

[82]. Constantinescu, (2009) Imunologia Transplantului, Ed. „Carol Davila” Bucharest, pp. 35-59

118
[83]. M.A. Bakr, A.A. Denewar, M.H. Abbas, (2016) Challenges for Renal Retransplant: An
Overview, Baskent University, Experimental and Clinical Transplantation suppl 3:21-26.

[84]. National Institute for Health and Care Excellence. (2014) FINAL SCOPE:
Immunosuppressive therapy for kidney transplantation in adults (review of technology
appraisal guidance 85). London: NICE.

[85]. Woodroffe R, Yao GL, Meads C, Bayliss S, Ready A, Raftery J, et al. (2005) Clinical and
cost-effectiveness of newer immunosuppressive regimens in renal transplantation: A
systematic review and modelling study. Health Technology Assessment. 9, (21):1-179.]

[86]. Forman LM, Lucey MR. Predicting the Prognosis of Chronic Liver Disease: An Evolution
From Child to MELD. Hepatology 2001; 33: 473-5

[87]. Garcia-Tsao G, Elferink RO. MELD: the end of Child-Pugh classification? J Hepatol
2002; 36: 141-5

[88]. Kamath PS, Wiesner RH, Malinchoc M et al. A model to predict survival in patients with
endstage liver disease. Hepatology 2001; 33: 464-70

[89]. Wiesner R, Edwards E, Freeman R et al. The model for end-stage liver disease (MELD)
and allocation of donor livers. Gastroenterology 2003; 124: 91-6

[90]. Hoofnagle JH, Lonbardero M, Zetterman RK et al. Donor age and outcome of liver
transplantation. Hepatology 1996; 24: 89-96

[91]. Keeffee EB. Selection of patients for liver transplantation. In Transplantation of the Liver,
edited by Maddrey WC, Schiff ER, Sorrell MF. Lippincott Williams & Wilkins 2001; 5-34

[92]. Vergas HE, Laskus T, Wang LF et al. Outcome of liver transplantation in hepatitis C
virusinfected who received hepatitis C virus-infected grafts. Gastroenterology 1999;
117:149-53

[93]. Dodson SF, Bonham CA, Geller DA et al. Prevention of de novo hepatitis B infection in
recipients of hepatic allografts from anti-HBc positive donors. Transplantation 1999; 68:
1058-61

[94]. Wiesner RH, Rakela J, Ishitani MB et al. Recent Advances in Liver Transplantation. Mayo
Clin Proc 2003; 78: 197-210

[95]. American Society of Transplant Surgeons, Ethics Committee. Position paper on adult-to
adult living donor liver transplantation. Liver Transpl 2000; 6: 815-817

119
 [96]. Broering DC, Sterneck M, Rogiers X. Living donor liver transplantation. J Hepatol 2003;
38: S119-S135

[97]. Renz JF, Roberts JP. Long-term complications of living donor liver transplan-tation. Liver
Transpl 2000; 6(6 suppl 2): S73-S76

[98]. Ghobrial RM, Saab S, Lassman C et al. Donor and recipient outcomes in right lobe adult
living donor liver transplantation. Liver Transpl 2002; 8: 901-909

[99]. Manikkam S, Stock P, et al. Clinical transplantation, in Medical Immunology, tenth edition
edited by Parslow TG, Stites DP, Terr AI, Imboden JB. McGraw-Hill 2001; 719-742

[100]. Edinger M, Hoffman P, Ermann J, et al. CD4 + CD25+ regulatory T cells preserve graft–
versus-tumor activity while inhibiting graft vs. host disease after bone marrow
transplantation. Nat Med 2003; 9:1144 -50

[101]. Perri R, Assi M, Talwalkar J, et al. Graft vs. host disease after liver transplantation: a new
approach is needed. Liver Transpl 2007; 13: 1092-9

[102]. Smith DM, Agura E, Netto G, et al. Liver transplant- associated graft vs. host disease.
Transplantation 2003; 75:118-26

[103]. Chan EY, Larson AM, Gernsheimer TB, et al. Liver Transpl 2007; 13: 516-22

[104]. Audet M, Panaro F, Piardi T, et al. Passenger Lymphocyte Syndrome and Liver
Transplantation.Clinical and Developmental Immunology 2008;

[105]. Yazer MH and Triulzi DJ Immune hemolysis following ABO-mismatched stem cell or
solid organ transplantation Current Opinion in Hematology 2007;14, 6,664– 670.

[106]. Sternberg A J, Lee G, Croxton T, et al. Severe hemolysis after minor ABO unmatched
kidney transplant—a non-secrector transplanted from a donor with high anti-A titre.
Transfusion Medicine2000;10;1, 87–89

[107]. Sokol RJ, Stamps R, Booker DJ, et al.. Posttransplant immune-mediated hemolysis
Transfusion 2002 , vol. 42, no. 2, pp. 198–204

[108]. Shortt J, Westall GP, Roxby D, et al. A ‘dangerous’ group O donor: severe hemolysis in
all recipients of organs from a donor with multiple red cell alloantibodies. American
Journal of Transplantation, vol. 8, no. 3, pp. 711–714, 2008.

[109]. Panaro F, DeChristopher PJ, Rondelli D, et al. Severe hemolytic anemia due to passenger
lymphocytes after living-related bowel transplant Clinical Transplantation 2004; 18, 3,
332–335

120
[110]. Amirzargar A, Lessanpezeshki M, Fathi A, et al. TH1/TH2 cytokine analysis in Iranian
renal transplant recipients. Transplant Proc 2005; 37(7): 2985-7

[111]. Lessanpezeshki M, Amirzargar A, Fathi A, et al. Value of pretransplantation cytokine

profiles for predicting acute rejection in renal transplant recipients. Transplant Proc 2005;
37(7): 2982-5

[112]. Moore KW, de Waal Malefyt R, Coffman RL, et al. Interleukin-10 and the interleukin-10
receptor. Annu Rev Immunol 2001; 19:683-765

[113]. Gheorghe L, Gheorghe C. Transplantul hepatic: indicaţii, contraindicaţii, selecţia

pacienţilor, evaluare şi alegerea momentului optim. Revista pentru Educaţie Medicală
Continuă 2002; 1: 107-114.

[114]. Ponce M, Berenguer M, Prieto M et al. Should we discard old donors for hepatitis C
candidates? The importance of donor steatosis. Hepatology 2003: 38: 226A.

[115]. Han SH, Ofman J, Holt C et al. An efficacy and cost-effectiveness analysis of combination
hepatitis B immune globulin and lamivudine to prevent recurrent hepatitis B after
orthotopic liver transplantation compared with hepatitis B immune globulin monotherapy.
Liver Transpl 2000; 6: 741-748.

[116]. Imperial JC, Keeffe EB. Liver transplantation in Handbook of liver disease, second
edition, edited by Lawrence S. Friedman, Emmet B. Keeffe, Churchill-Livingstone, 2004;
401-415

[117]. Rao W, Wu X, Xiu D. Lamivudine or lamivudine combined with hepatitis B

immunoglobulin in prophylaxis of hepatitis B recurrence after liver transplantation: a
meta-analysis. Transplant International 2009; 22 (4): 387-395

[118]. Razonable RR. Cytomegalovirus infection after liver transplantation: current concepts and
challenges. World Gastroenterology 2008; 14(31):4849-60

[119]. Reinke P, Prosch S, Kern F. Mechanisms of human cytomegalovirus (re)activation and its
impact on organ transplant patient. Transpl Infect Dis 1999; 1(3): 157-64

[120]. Adams AB, Williams MA, et al. Heterologous immunity provides a potent barrier to
transplantation tolerance. J Clin Invest 2003; 111(12): 1887-95

[121]. Ruggeri L, Aversa F, Martelli MF, Velardi A. Haploidentical transplantation and NK cells
recognition of missing self. Immunol Rev 2006; 214: 202-218

121
[122]. Ruggeri L, Mancusi A, Capanni M, et al. Donor NK cell allorecognition of missing self in
haploidenrical haematopoietic transplantation for acute myeloid leukemia. Challenging its
predictive value. Blood 2007; 110: 433-440

[123]. Smith HRC, Heusel JW, Mehta IK, et al. Recognition of a virus-encoded ligand by a
natural killer cell activation receptor. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 8826-8831

[124]. Degli Esposti MA, Smyth MJ. Close encounters of different kinds: Dendritic cells and NK
cells take centre stage. Nature Reviews Immunology 2005; 5: 112-124

[125]. Ishikawa Y, Kashiwase K, Akaza T, et al. polymorphisms in TNFA and TNFR2 affect
outcomes of unrelated bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant 2002; 29:
569-575

[126]. Mullighan CG, Bardy PG. Advance in the genomics of allogeneic haematopoietic stem
cell transplantation. Drug Development Research 2004; 62: 273-292

[127]. Lin MT, Storer B, Martin PJ, et al. Relation of an IL-10 promoter polymorphism to
GVHD and survival after haematopoietic -cell transplantation. N Engl J Med 2003; 349:
2201-2210

[128]. Cullup H, Stark G. IL-1 polymorphism and GVHD. Leuk Lymphoma 2005; 46: 517-523

[129]. Goulmy E. Human minor histocompatibility antigens. Curr Opin Immunol 1996; 8:75-81

[130]. Middleton PG, Cullup H, Dickinson AM, et al. Vitamin D receptor gene polymorphism
associates with GVHD and survival in HLA-matched sibling allogeneic bone marrow
transplantation. Bone Marrow Transplant 2002; 30:223-228

[131]. Napolitani G, Rinaldi A, Bertoni F, et al. Selected Toll-like receptor agonist combinations
synergistically trigger a T helper type 1-polarizing program in dendritic cells. Nature
Immunology 2005; 6: 769-776

[132]. Holler E, Rogler G, Brenmoehl J, et al. Prognostic significance of NOD2/CARD15

variants in HLA-identical sibling haematopoietic stem cell transplantation: Effect on long
term outcome is confirmed in 2 independent cohorts and may be modulated by the type of
gastrointestinal decontamination. Blood 2006; 107: 4189-4193

[133]. Helbig G, Stella-Holowiecka B, Woinar J, et al. Pure red cell apasia following major and
bidirectional ABO-incompatible allogeneic stem cell transplantation: Recovery donor-
derived erythropoiesis after long-term treatment using different therapeutic strategies. Ann
Hematol 2007

122
[134]. Toubert A. Immune reconstitution after allogeneic HSCT. The EBMT Handbook, 5th
edition 2008; 297-316

[135]. Hall N (mai 2007). „Advanced sequencing technologies and their wider impact in
microbiology”. J.Exp.Biol. 209 (Pt9): 1518 1525. doi:10.1242/jeb.001370. PMID 17449817

[136]. Church GM (ianuarie 2006). Genomes for all”. Sci.Am. 294 (1):46–
54. doi:10.1038/scientificamerican0106-46. PMID 16468433

123
 Director: Prof. Dr. Ing. Victor Lorin Purcărea
Secretar Ştiinţific: Șef Lucrări Dr. Vlad Mihai Voiculescu
Redactare: autorul
Tehnoredactare: autorul, Elena Celărel
Copertă: Elena Celărel

Format: 176 x 250 mm

Bun de tipar: septembrie 2021
Aparută: noiembrie 2021
Toate drepturile aparţin Editurii Universitare “Carol Davila”
© Copyright 2021

Editura Universitară „Carol Davila”

B-dul Eroii Sanitari nr. 8, sector 5, Bucureşti

Tel: 021.318.08.62 int. 199