LP-Romana-Imunologia Transplantului

[TITLU DOCUMENT]
[Subtitlu document]
[DATA]
[NUME COMPANIE]
[Adresă companie]
Prefață
Imunologia este studiul sistemului imunitar și este o ramură foarte importantă a științelor
medicale și biologice. Sistemul imunitar protejează organismul de infecție prin diferite linii de
apărare. Imunologia fundamentală sau clasică implică studierea componentelor care alcătuiesc
sistemul imunitar: înnăscut și adaptiv.
Imunitatea înnăscută este prima linie de apărare și este nespecifică. Răspunsurile sunt
aceleași pentru toți potențialii agenți patogeni, indiferent de cât de diferiți ar putea fi ei.
Imunitatea înnăscută include barierele fizice (pielea, saliva etc.) și celulele (de exemplu,
macrofagele, neutrofilele, bazofilele, celulele mastocitare etc.). Aceste componente protejează un
organism în primele zile de infecție. În unele cazuri, acest lucru este suficient pentru a elimina
agentul patogen, dar în alte cazuri prima apărare devine copleșită și este necesară intervenția
celei de-a doua linii de apărare.
Imunitatea adaptivă este cea de-a doua linie de apărare, care implică anticorpi, ce vizează,
în general, agenții patogeni străini prezenți în sânge. De asemenea, sunt implicate celulele T,
care sunt îndreptate în special spre agenți patogeni care au celule colonizate și pot ucide direct
celulele infectate sau pot ajuta la controlul răspunsului la anticorpi.
Dacă sistemul imunitar nu funcționează așa cum ar trebui, poate determina boli, precum
autoimunitatea, alergia și cancerul. Răspunsurile imune contribuie la dezvoltarea multor tulburări
comune care nu sunt în mod obișnuit văzute ca fiind imunologice, precum afecțiuni metabolice,
cardiovasculare și neurodegenerative (ex. Alzheimer).
Imunologia, în practica medicală, este importantă atât în clinică pentru orientarea
diagnosticului și tratamentului, cât și în laboratoare pentru efectuarea analizelor medicale.
Clinica și laboratorul sunt extrem de importante în realizarea conceptului de medicină bazată pe
dovezi.
O altă componentă importantă a imunologiei este imunologia transplantului.
Înțelegerea bazei imunologiei transplantului este necesară pentru a înțelege rolul
laboratorului de genotipare a alelelor HLA, de detecție și identificare a anticorpilor anti-HLA în
gestionarea potențialilor beneficiari ai transplantului, pentru a înțelege mecanismele de acțiune
ale imunosupresiei și pentru a putea diagnostica și trata în mod corespunzător respingerea acută
sau cronică a grefelor. Genotiparea alelelor HLA (ex. prin metoda SSP, SSO, SBT), se poate
realiza utilizând ADN genomic uman extras din sânge recoltat pe EDTA prin diferite tehnici.
Cursurile de Imunologie și Imunologia transplantului din UMF „Carol Davila” se
desfășoară în cadrul Centrului de Imunogenetică și Virusologie din Institutul Clinic Fundeni-
București, Centru de Referință în Imunologia Transplantului pentru România.
1
Cuprins
PREFAȚĂ.....................................................................................................................................................................................4
1. METODE DE DETERMINARE A MARKERILOR IMUNOLOGICI...............................................................................5
ETAPELE REACȚIEI ELISA................................................................................................................................................................ 6
IMUNOBLOTAREA....................................................................................................................................................................................... 6
WESTERN BLOT........................................................................................................................................................................................... 6
CITOMETRIA ÎN FLUX/FLOW-CITOMETRIA......................................................................................................................................7
2. METODE PENTRU PUNEREA ÎN EVIDENŢĂ A REACŢIILOR DE HIPERSENSIBILITATE................................8
TESTE CUTANATE....................................................................................................................................................................................... 8
DOZAREA IMUNOGLOBULINELOR E TOTALE..................................................................................................................................8
DIAGNOSTICUL REACŢIEI DE HIPERSENSIBILITATE DE TIP II..................................................................................................8
REACŢIA DE HIPERSENSIBILITATE DE TIP III.................................................................................................................................9
DIAGNOSTICUL REACŢIEI DE HIPERSENSIBILITATE ÎNTÂRZIATĂ (DE TIP IV)...................................................................9
3. EXTRACŢIE ADN MANUALĂ CARE FOLOSEŞTE COLOANE CU DIOXID DE SILICIU (QIAGEN)..................10
PRINCIPIUL METODEI............................................................................................................................................................................. 10
COMPONENTELE KIT-ULUI...................................................................................................................................................................10
METODA DE LUCRU.................................................................................................................................................................................12
ETAPELE EXTRACTIEI............................................................................................................................................................................ 12
4. EXTRACŢIE DE ADN AUTOMATĂ CU BILE MAGNETICE.......................................................................................13
ECHIPAMENTE ȘI CONSUMABILE NECESARE.................................................................................................................................15
METODA DE LUCRU.................................................................................................................................................................................15
ETAPELE EXTRACȚIEI AUTOMATE....................................................................................................................................................16
5. MĂSURAREA CONCENTRAȚIEI ȘI A PURITĂȚII ADN............................................................................................17
(NANOFOTOMETRUL IMPLEN P300).............................................................................................................................17
MODUL DE UTILIZARE AL NANOFOTOMETRULUI IMPLEN P300.......................................................................................17
6. GENOTIPAREA HLA SSP- REZOLUȚIE MEDIE ȘI INTERPRETAREA ALELELOR HLA..................................19
PRICIPIUL METODEI................................................................................................................................................................................19
METODA DE LUCRU.................................................................................................................................................................................21
Probele de ADN..................................................................................................................................................21
Prepararea mixturii de amplificare....................................................................................................................21
Amplificarea........................................................................................................................................................22
Electroforeza în gel de agaroză..........................................................................................................................23
7. GENOTIPAREA HLA SSP PRIN METODA SSP –REZOLUȚIE ÎNALTĂ (INVITROGEN) ȘI INTERPRETAREA
ALELELOR HLA.......................................................................................................................................................................24
2
ECHIPAMENTE ȘI CONSUMABILE NECESARE............................................................................................................................. 25
METODA DE LUCRU.................................................................................................................................................................................25
Probele de ADN..................................................................................................................................................25
Electroforeză în gel de agaroză..........................................................................................................................27
8. GENOTIPAREA HLA SBT – METODA SANGER (SECORE INVITROGEN) – INTERPRETAREA
AMBIGUITĂȚII ALELICE......................................................................................................................................................28
METODA DE LUCRU.................................................................................................................................................................................30
Probele de ADN..................................................................................................................................................30
Amplificarea locus specifică...............................................................................................................................30
Purificarea ampliconilor cu ExoSAP-IT...........................................................................................................32
Pregătirea reacției de amplificare pentru secvențiere.......................................................................................32
Precipitarea cu etanol.........................................................................................................................................33
Pregătirea plăcuței pentru electroforeză capilară.............................................................................................34
Analiza electroferogramelor...............................................................................................................................34
INTERPRETAREA AMBIGUITĂȚII ALELICE.....................................................................................................................................35
9. GENOTIPARE HLA SSO-LUMINEX CU KIT-URI LABTYPE (ONE LAMBDA)......................................................35
METODA DE LUCRU.................................................................................................................................................................................37
Probele de ADN..................................................................................................................................................37
Amplificarea locus specifică...............................................................................................................................37
Pregătirea reactivilor pentru hibridizare...........................................................................................................39
Etapa de denaturare/neutralizare......................................................................................................................39
Etapa de hibridizare............................................................................................................................................39
Etapa de conjugare cu streptavidină..................................................................................................................40
INTERPRETAREA REZULTATELOR.....................................................................................................................................................40
10. GENOTIPAREA GENELOR KIR PRIN METODA SSP...............................................................................................41
COMPONENTELE KIT-ULUI ȘI MATERIALE NECESARE..............................................................................................................41
DESCRIEREA PROCEDURII....................................................................................................................................................................41
ELECTROFOREZA ÎN GEL DE AGAROZĂ..........................................................................................................................................42
11. POLIMORFISMUL GENELOR CITOKINE PRIN METODA SSP.............................................................................42
(PEL-FREEZ CYTOKINE GENOTYPING)...........................................................................................................................42
METODA DE LUCRU.................................................................................................................................................................................43
Probele de ADN..................................................................................................................................................43
Amplificarea........................................................................................................................................................44
Interpretarea rezultatelor...................................................................................................................................44
3
12. ELECTROFOREZA ÎN GEL DE AGAROZĂ ȘI FOTOGRAFIEREA GELULUI........................................................45
SCOP....................................................................................................................................................................................................... 45
PREPARAREA GELULUI DE AGAROZĂ..............................................................................................................................................45
Verificarea ADN-ului extras sau a produșilor de amplificare pentru metodele SSOP, SBT..........................46
Fotografierea gelului..........................................................................................................................................46
Verificarea produșilor de amplificare pentru metoda SSP...............................................................................47
Asigurarea calității rezultatelor.........................................................................................................................48
13. EXTRACȚIE DE ARN TOTAL DIN ȚESUT CU ACID-PHENOL: CHLOROPHORM (INVITROGEN-
MIRVANA MIRNA ISOLATION KIT)..................................................................................................................................48
METODA DE LUCRU.................................................................................................................................................................................49
EXTRACȚIA PROPRIU-ZISĂ................................................................................................................................................................... 49
14. REVERSTRANSCRIEREA ARN......................................................................................................................................51
SCOP............................................................................................................................................................................................................ 51
METODA DE LUCRU.................................................................................................................................................................................51
Probele de ARN...................................................................................................................................................51
Pregătirea reactivilor, a mastermix-ului și amplificarea..................................................................................52
15. CUANTIFICAREA SPECIILOR DE MICROARN PRIN METODA REAL-TIME PCR.........................................53
SCOP............................................................................................................................................................................................................ 53
COMPONENTELE UTILIZATE ÎN REACȚIE.......................................................................................................................................53
MANIPULAREA ȘI PREGĂTIREA REACTIVILOR.............................................................................................................................54
16. MODELUL DE CALCUL PENTRU CUANTIFICAREA RELATIVĂ A MODIFICĂRILOR EXPRESIEI GENICE
......................................................................................................................................................................................................55
4
Prefață
Imunologia este studiul sistemului imunitar și este o ramură foarte importantă a științelor
medicale și biologice. Sistemul imunitar protejează organismul de infecție prin diferite linii de
apărare. Imunologia fundamentală sau clasică implică studierea componentelor care alcătuiesc
sistemul imunitar: înnăscut și adaptiv.
Imunitatea înnăscută este prima linie de apărare și este nespecifică. Răspunsurile sunt
aceleași pentru toți potențialii agenți patogeni, indiferent de cât de diferiți ar putea fi ei.
Imunitatea înnăscută include barierele fizice (pielea, saliva etc.) și celulele (de exemplu,
macrofagele, neutrofilele, bazofilele, celulele mastocitare etc.). Aceste componente protejează un
organism în primele zile de infecție. În unele cazuri, acest lucru este suficient pentru a elimina
agentul patogen, dar în alte cazuri prima apărare devine copleșită și este necesară intervenția
celei de-a doua linii de apărare.
Imunitatea adaptivă este cea de-a doua linie de apărare, care implică anticorpi, ce vizează,
în general, agenții patogeni străini prezenți în sânge. De asemenea, sunt implicate celulele T,
care sunt îndreptate în special spre agenți patogeni care au celule colonizate și pot ucide direct
celulele infectate sau pot ajuta la controlul răspunsului la anticorpi.
Dacă sistemul imunitar nu funcționează așa cum ar trebui, poate determina boli, precum
autoimunitatea, alergia și cancerul. Răspunsurile imune contribuie la dezvoltarea multor tulburări
comune care nu sunt în mod obișnuit văzute ca fiind imunologice, precum afecțiuni metabolice,
cardiovasculare și neurodegenerative (ex. Alzheimer).
Imunologia, în practica medicală, este importantă atât în clinică pentru orientarea
diagnosticului și tratamentului, cât și în laboratoare pentru efectuarea analizelor medicale.
Clinica și laboratorul sunt extrem de importante în realizarea conceptului de medicină bazată pe
dovezi.
O altă componentă importantă a imunologiei este imunologia transplantului.
Înțelegerea bazei imunologiei transplantului este necesară pentru a înțelege rolul
laboratorului de genotipare a alelelor HLA, de detecție și identificare a anticorpilor anti-HLA în
gestionarea potențialilor beneficiari ai transplantului, pentru a înțelege mecanismele de acțiune
ale imunosupresiei și pentru a putea diagnostica și trata în mod corespunzător respingerea acută
sau cronică a grefelor. Genotiparea alelelor HLA (ex. prin metoda SSP, SSO, SBT), se poate
realiza utilizând ADN genomic uman extras din sânge recoltat pe EDTA prin diferite tehnici.
Cursurile de Imunologie și Imunologia transplantului din UMF „Carol Davila” se
desfășoară în cadrul Centrului de Imunogenetică și Virusologie din Institutul Clinic Fundeni-
București, Centru de Referință în Imunologia Transplantului pentru România.
5
1. METODE DE DETERMINARE A MARKERILOR IMUNOLOGICI
În laboratorul clinic determinarea markerilor imunologici se realizează prin metode

automate sau manuale imunochimice bazate pe reacția antigen-anticorp. În funcție de tipul
substanțelor folosite pentru marcarea Ag sau a Ac testele imunochimice se împart în:
-teste radioimunologice (RIA): utilizează marcarea cu radioizotopi (ex. 32P);
-teste imunoenzimatice (EIA): utilizează marcarea cu enzime
Procesul de legare a antigenului la anticorpii specifici reprezintă baza unui test numit
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) care poate fi utilizat pentru a măsura cantitatea de
antigen într-un fluid biologic.
Ex: o probă de fluid biologic cum este serul sanguin, este adaugată într-un godeu
(adâncitură) al unei plăcuțe, godeu care este tapetat cu anticorpi care recunosc în mod specific o
anumită parte a antigenului care se dorește a fi identificat în sânge. Acest antigen se leagă la
anticorpii din godeu și complexul format este detectat prin adăugarea unui alt anticorp care
recunoaște în mod specific un alt determinant al antigenului legat. Acest anticorp detector este
cuplat cu o enzimă care reacționează în mod specific cu un substrat care adăugat la amestec
determină o reacție de culoare. Intensitatea culorii soluției indică cantitatea de antigen din proba
biologică analizată (cu cât culoarea este mai intensă cu atât cantitatea de antigen prezent în proba
testată este mai mare). Astfel, legarea unui antigen la anticorpul specific furnizează medicului un
mijloc prin care poate măsura concentrația unui antigen specific în fluidele biologice.
6
Etapele reacției ELISA
-teste imunochimice cu detecție prin fluorescență (FIA): utilizează marcarea cu molecule

fluorescente (fluorocromi);
-teste imunochimice cu detecție prin chemiluminiscență (CLIA): utilizează pentru marcare
molecule care generează chemiluminiscență, precum esteri acridinici.
Chemiluminescenţa este o metodă imunologică de laborator ce foloseşte indicatori care
generează lumina – substanţe luxogene (ex. peroxidaza din hrean - HRP61) - pentru marcarea Ac
şi detectarea complexelor Ag – Ac din tipurile de reacţie descrise mai sus. Testul este folosit
pentru detectarea proteinelor, oligonucleotidelor, secvenţelor de acizi nucleici în combinaţie cu
electroforeza şi blotarea.
Imunoblotarea
Imunoblotarea este tehnica de detectare a antigenelor (proteine) prin separare
electroforetică, transfer pe suport carrier (de exemplu membrana de nitroceluloză sau
poliacrilamidă) şi apoi se identifică prin metode specifice coloraţia aparută datorita contactului
cu anticorpii. Vizualizarea spotului de probă obţinută prin EF şi blotată se face prin cuplarea cu
anticorpi antiproteine de studiu marcate cu: coloranţi/fixare (cu argint), radioizotopi, enzimă şi
substrat, substanţe chemiluminescente (luminol) sau fluorescente. Imaginile obţinute sunt apoi
colectate în camera obscură (UV-VIS sau Rx), preluate pe filme radiografice, foto sau scanate,
prelucrate computerizat cu softuri specializate. Prin această metodă se pot face determinări
calitative şi cantitative privind AND, ARN şi proteine celulare (constitutive sau de sinteză),
normale sau mutate.
Western blot
Testul Western blot este utilizat pentru identificarea unei proteine specifice într–un
amestec complex de proteine. Astfel, procesul are loc în mai multe etape :
- amestecul de proteine este separat electroforetic
- proteinele cercetate sunt identificate şi marcate cu Ac anti proteina cercetată marcat cu
etichetă radioactivă (125) sau enzimă cu substrat (vezi tehnica ELISA)
7
- vizualizare şi cuantificare
În practica medicală testele de screening (ELISA/Chemiluminescență) pentru
anticorpii anti-HIV1/2 sunt urmate de Western-Blot și teste de confirmare bazate pe PCR.
Citometria în flux/flow-citometria
Flow-citometria reprezintă piatra de temelie a diagnosticului de imunologie celulară
și depinde de disponibilitatea anticorpilor monoclonali care reacționează cu antigene de suprafață
și intracelulare. Tehnica presupune trecerea unui flux de celule marcate fluorescent prin dreptul
unui laser excitant și detectarea lor ulterioară. Metoda este aplicabilă numai suspensiilor
monocelulare, celulelor sanguine sau celulelor din culturi celulare.
Tehnica presupune trecerea unui flux de celule marcate fluorescent prin dreptul unui laser
excitant și detectarea lor ulterioară. Metoda este aplicabilă numai suspensiilor monocelulare,
celulelor sanguine sau celulelor din culturi celulare.
Flow-citometrele moderne utilizează un singur laser excitant (lumină monocromă) și pot
detecta mai multe lungimi de undă diferite emise de coloranții fluorescenți. Există detectoare de
dispersie a luminii înainte și la 90°, care identifică dimensiunea și granularitatea celulelor.
Software-ul permite analize complexe, multiparametrice, inclusiv colectarea și analiza datelor în
timp real.
Anticorpii monoclonali conjugați cu coloranți fluoroscenți sunt folosiți împotriva
antigenelor de suprafață. Tehnicile de permeabilizare celulară permit colorarea antigenelor
intracelulare. Coloranții de suprafață și intracelulari pot fi combinați. Reactivi de control adecvțti
sunt necesari pentru a detecta colorare nespecifică.
Avantajul major al citometrie în flux este faptul că este semi-automată și poate analiza un
număr foarte mare de celule, foarte rapid, în comparație cu microscopia cu fluorescență. În plus,
este mult mai precisă. Cuantificarea absolută și exactă a celulelor este disponibilă pe analizoare
cu o singură platformă folosind tehnologia cu microsfere. Calibrarea regulată a instrumentului
este obligatorie și se face cu microsfere cu fluorescență cunoscută.
8
2. METODE PENTRU PUNEREA ÎN EVIDENŢĂ A REACŢIILOR DE
HIPERSENSIBILITATE
Investigaţiile imunologice în cazul reacţiei de hipersensibilitate de tip I urmăresc punerea

în evidenţă a anticorpilor Ig E specifici fie prin teste cutanate fie prin dozarea nivelului Ig E în
serul bolnavului.
Teste cutanate
Se administrează alergenul prin înţepare (prick test), scarificare sau administrare
intradermică la nivelul pielii pacientului. Apariția unei reacții cutanate datorate anticorpilor Ig E
pe mastocitele din pielea pacientului testat certifică reacția alergică de tip I la alergenul respectiv.
Testarea pozitivă se apreciază în funcţie de dimensiunile papulei comparativ cu dimensiunile
unei papule martor (obţinută prin administrarea de ser fiziologic). De obicei pentru a evita
reacţiile sistemice se efectuează mai întâi testarea epicutană (prin escoriație) urmată de testarea
intradermică cu alergenii care au dat rezultate negative la testul precedent. Testarea cutanată
pentru alergia alimentară este indicată când pacientul prezintă simptome asemănătoare cu o
alergie mediată de Ig E (urticarie, anafilaxie) în decurs de două ore de la ingestia alimentului
suspicionat. Testarea cutanată pentru alergia medicamentoasă este utilă în cazul medicamentelor
proteice cu greutate moleculară mare (seruri heterologe, insulina) și nu în cazul compuşilor cu
greutate moleculară mare care trebuie să se lege de proteine cu greutate moleculară mare pentru
a deveni imunogene. Testele cutanate sunt preferabile testărilor in vitro deoarece acestea
detectează prezența anticorpilor Ig E la un nivel tisular, sunt mai sensibile, dau rezultate imediate
și sunt mai ieftine.
Dozarea imunoglobulinelor E totale

Dozarea imunoglobulinelor E totale se realizează prin tehnica radioimunologică - RISt
(radio immuno sorbent test) sau PRIST (paper radio immuno sorbent test) din serul bolnavului
prin intermediul radioizotopilor. Se mai poate utiliza metoda ELISA. Rezultatele prezintă un
anumit grad de reactivitate dar sunt importante în special în cazul în care anamneza nu sugerează
contactul pacientului cu un anumit alergen.
Diagnosticul reacţiei de hipersensibilitate de tip II

Diagnosticul reacţiei de hipersensibilitate de tip II se face punând în evidență antigene
celulare sau anticorpi specifici prezenţi în ser. Metodele cele mai utilizate sunt testul Coombs şi
imunofluorescenţa.
Testul Coombs este metoda standard pentru punerea în evidență a autoanticorpilor
antieritrocitari. Pe suprafaţa eritrocitelor bolnavilor cu anemii hemolitice imunologice sunt fixaţi
Ac antieritrocitari şi/sau componente ale complementului. Aceşti Ac sunt incompleţi, nu pot
aglutina eritrocite decât prin adăugarea unui ser antiglobulinic. Unii Ac sunt liberi în plasmă.
Când se cercetează autoanticorpii antieritrocitari se execută testul Coombs atât direct (pentru
evidenţierea Ac fixaţi pe eritrocite) cât şi indirect (pentru evidenţierea Ac circulanţi).
Testul Coombs direct (testul eritrocitar): eritrocitele ce au pe suprafață Ac incompleţi
sau/şi complement sunt aglutinate de către un ser anti – imunoglobuline umane (ser
antiglobulinic) şi respectiv serul anti – complement (testul non – gamma). Testul Coombs
9
indirect (testul seric): Ac serici nefixaţi pe eritrocite) pot fi evidenţiaţi prin fixarea pe eritrocite
normale de grup 0 (I), eritrocitele sunt apoi aglutinate de serul antiglobulinic.
Teste de imunofluorescenţă: se pun în evidență antigenele tisulare sau cuplarea acestora
cu anticorpi din serul bolnavilor. Anticorpii legați de o substanță fluorescentă permit vizualizarea
dispunerii celulare a antigenelor sau a complexelor antigen – anticorp la nivel tisular.
Reacţia de hipersensibilitate de tip III

Reacția de hipersensibilitate de tip III (hipersensibilitate mediată prin complexe imune)
poate fi pusă în evidență prin teste și tehnici de precipitare în gel a nticorpilor Ig G care se găsesc
în cantităţi crescute în ser. Testul ELISA poate detecta și cantități mici de anticorpi Ig G.
Diagnosticul reacţiei de hipersensibilitate întârziată (de tip IV)

Diagnosticul reacţiei de hipersensibilitate întârziată (de tip IV) se face prin teste
epicutane şi teste de transformare limfoblastică. În cazul testelor epicutane se aplică pe
tegumentul pacienţilor rondele de hârtie de filtru (sau plasturi) îmbibate cu substanțe chimice
diverse bănuite că ar declanşa hipersensibilitatea de contact. După 48 de ore de la aplicaţie
substanţa la care pacientul a fost sensibilizat anterior dezvoltă sub rondele eritem, edem şi
papule.
Testul de transformare limfoblastică (TTL) constă în punerea în contact a limfocitelor
bolnavului în cultură cu alergenul bănuit a produce hipersensibilitate. Dacă după 72 de ore în
cultura de limfocite se găsește un număr semnificativ de blaşti, se consideră că pacientul a fost
sensibilizat anterior la alergenul indus în cultură. Testele evidenţiază hipersensibilitatea de tip
celular.
10
3. EXTRACŢIE ADN MANUALĂ CARE FOLOSEŞTE COLOANE CU
DIOXID DE SILICIU (QIAGEN)
Principiul metodei
Extracția cu QIAamp DNA Blood Mini kit este o metodă rapidă și ușoară bazată pe
membrane cu dioxid de siliciu, care permite purificarea ADN-ului total (genomic, mitocondrial)
din sânge integral, concentrat leucocitar, măduva osoasă, culturi celulare).
Metoda este adecvată atât pentru sânge proaspăt cât și congelat, recoltat pe citrat sau
EDTA. Nu necesită separarea prealabilă a leucocitelor.
ADN-ul extras poate fi eluat în buffer AE sau apă, este liber de proteine, nucleaze,
inhibitori și se utilizează ca atare în reacțiile de amplificare genică.
Fragmentele de ADN obținute pot fi până la 50kb dar sunt predominant de 20-30 kb ceea
ce permite o denaturare completă și o amplificare eficientă.
Kit-urile sunt markate CE-IVD.
Componentele kit-ului
❖ Coloane cu membrană de dioxid de siliciu
❖ Tuburi de colectare
❖ Buffer AL – pentru liza celulară
❖ Buffer AW1 (concentrat) – soluție de spălare
❖ Buffer AW2 (concentrat) – soluție de spălare
❖ Buffer AE – soluție de eluție
❖ Protează Qiagen liofilizată
❖ Solvent pentru protează
Toate componentele kitului se păstrează la temperatura camerei. Dacă kit-ul se stochează
mai mult de 1 an, se recomandă ca proteaza liofilizată să fie păstrată la frigider (2 - 80C ).
Echipamente și consumabile necesare
● Mănuși de unică folosință fără talc
● Etanol 96 – 100%
● Tuburi de microcentrifugă de 1,5 – 2 ml
11
● Pipete cu volum ajustabil cu vârfuri de pipetă aferente
● Microcentrifugă
(pentru a aduna tot
conținutul tubului la fundul
acestuia)
● Vortex (pentru o bună omogenizare a amestecului)
● Baie de apă care să permită încălzirea la 56oC
12
● Nanofotometrul (pentru determinarea concentrației și purității ADN-ului ce va fi folosit
pentru genotipare HLA)
Metoda de lucru
Dacă un kit este la prima utilizare:
●Se reconstituie proteaza cu solventul existent în kit apoi se porționează în cantități
mai mici – 1ml. O eprubetă se păstrează la frigider (2 - 8 0C ) pentru utilizare curentă și este
stabilă în acest fel 2 luni. Restul eprubetelor se păstrează la congelator la -200C.
●În soluțiile concentrate de AW1 și AW2 se adaugă etanol absolut, 96-100% în
cantitatea care este menționată pe fiecare recipient. Pe capacul recipientului se bifează faptul că
s-a făcut această diluție. Soluțiile astfel preparate sunt stabile 1 an la temperatura camerei.
Înainte de a începe extracția:
o Se pornește baia de apă (560C).
o Se aduc probele la temperatura camerei.
o Se verifică dacă soluțiile de spălare AW1 și AW2 au fost preparate cu etanol.
o Se verifică buffer-ul AL și dacă prezintă precipitate acestea se dizolvă prin
incubare câteva minute la 560C.
Etapele extractiei
1) Pentru fiecare probă de sânge se pregătește câte un tub de microcentrifugă de 1,5-
2 ml pe care se notează codul de înregistrare al probei.
2) Se pipetează 20 μl protează în fundul tubului de microcentrifugă de 1,5-2ml;
3) Proba de sânge se vortexează 15 sec, apoi se adaugă 200 μl sânge total în tubul
de microcentrifugă;
4) Se adaugă 200 μl tampon AL;
5) Se vortexează amestecul aprox.15 sec și apoi scurtă centrifugare (5 sec) pentru a
aduna conținutul tubului de pe capac și pereți;
6) Tubul de microcentrifugă se incubează 10 min în baia de apă la 56 0C; în timpul
incubării se pregătesc tuburile cu coloană, câte unul pentru fiecare probă și se marchează cu
codul probei; la sfârșitul incubării - scurtă centrifugare (5 sec);
7) Se adaugă 200 μl ETANOL concentrație 96% - 100%, se vortexează 15 sec și
apoi urmează scurtă centrifugare (5 sec);
8) Se transferă tot conținutul tubului de microcentrifugă într-un tub cu coloană și se
închide capacul; centrifugare la 8000 rpm timp de 1 minut
13
9) Se transferă coloana într-un tub nou, se deschide capacul coloanei și se adaugă
500 μl soluție tampon AW1, după care se închide capacul coloanei;
10) Centrifugare la 8000 rpm timp de 1 minut;
11) Se transferă coloana într-un tub nou, se deschide capacul coloanei și se adaugă
500 μl soluție tampon AW2, după care se închide capacul coloanei;
12) Centrifugare la 14000 rpm timp de 3 minute;
13) Se transferă coloana într-un tub nou de microcentrifugă, se deschide capacul
coloanei și se adaugă 200 μl soluție tampon AE; se lasă aprox. 1 min la temperatura camerei;
14) Centrifugare la 8000 rpm timp de 1 minut;
15) Se aruncă coloana, în tub rămânând ADN-ul extras.
Din 200 μl de sânge total se pot obține obișnuit 3-12 μg de ADN în 200 μl eluat (15-60
ng/μl). ADN-ul pentru utilizare curentă se păstrează la frigider. Stocarea pe timp îndelungat se
face la -200C.
După extracție se măsoară concentrația și puritatea (A 260nm/A280nm) ADN-ului în eluatul
obținut cu ajutorul nanofotometrului IMPLEN P300.
Se consideră acceptabile concentrații >20 ng/μl și raportul A 260nm/A280nm = 1,7 – 1,9.
Concentrații mai mici se obțin la pacienți leucopenici (aplazii medulare, imediat după
chimioterapie, etc.). În această situație conduita este următoarea:
• Dacă genotiparea HLA poate fi temporizată se așteaptă câteva zile până leucocitele cresc
peste 1000/mmc și atunci se recoltează o nouă probă de sânge din care se repetă extracția.
• Dacă este o urgență se repetă extracția din aceeași probă folosind metoda manuală la care
se modifică ușor protocolul (se poate crește cantitatea de sânge total din care se face extracția
și/sau la sfârșit se poate scădea cantitatea de soluție de eluție).
4. EXTRACŢIE DE ADN AUTOMATĂ CU BILE MAGNETICE
Principiul metodei
În LAM II este utilizat kit-ul iPrep PureLink gDNA Blood Kit pentru extracția
automată de ADN genomic uman, folosit ulterior la genotipare HLA. ADN-ul uman se poate
extrage din probe de sânge proaspete sau congelate (350 µl), recoltat pe citrat sau EDTA, și
preparate leucocitare concentrate (buffy coat-300 µl). Kit-ul este destinat utilizării cu
extractorul iPrep Purification Instrument.
Metoda are la bază tehnologia « ChargeSwitch Technology », bazată pe bile magnetice (1
µm). La un pH scăzut, bilele au o încărcătură pozitivă și de aceea vor atrage moleculele de acizi
nucleici care au încărcătură negativă. Proteinele și alți contaminanţi nu sunt legați și vor fi
îndepărtați printr-o etapă de spălare. Pentru a desprinde acizii nucleici de pe bile, încărcătura
electrică a bilelor este neutralizată prin folosirea unei soluții slab saline (buffer de eluție) care
crește pH-ul la 8,5. Acizii nucleici purificați vor elua instantaneu în buffer-ul de eluție și pot fi
folosiți mai departe pentru amplificare. Etapele de reacție sunt următoarele :
14
 Celulele sunt lizate cu ajutorul Lysis Buffer iar proteinele din ser sunt digerate cu
Proteinaza K;
 ADN-ul eliberat din nucleu este captat pe bilele magnetice iar detritusurile celulare și
proteinele rămân în soluție;
 Bilele tapetate cu ADN sunt izolate din lizat prin separare magnetică și sunt spălate foarte
bine cu soluție Wash Buffer pentru îndepărtarea urmelor de contaminanţi;
 ADN-ul purificat astfel este apoi eluat în soluția de Elution Buffer (200 µl).
Kit-ul permite efectuarea a 52 de extracții și conține:
 cartușe iPrep PureLink Blood Cartridge cu 12 godeuri sigilate, în care reactivii
necesari sunt gata plasați de producător, în ordine, după cum urmează, de la godeul 1 până la 10:
 Lysis Buffer
 Proteinase K
 Rinse Buffer
 Bile magnetice Dynabeads suspendate în Bead Storage Buffer
 Isopropanol100%
 Wash Buffer 1
 Wash Buffer 1
 Wash Buffer 2
 Wash Buffer 2
 Elution Buffer
 Godeu gol în care se va pune proba de sânge
 Godeu gol în care se vor face spălările
 iPrep Sample and Elution Tubes - Tuburi Eppendorf de 1,5 µl pentru probe și eluat
 Vârfuri iPrep cu căpăcele
Toate componentele kitului se păstrează la temperatura camerei.
15
 Instrumentul iPrep Purification Instrument
 Mănuși de unică folosință fără talc

 Pipete cu volum ajustabil cu vârfuri de pipetă aferente
 Vortex
Metoda de lucru
ADN-ul uman se poate extrage din probe de sânge proaspete sau congelate (350 µl),
recoltat pe citrat sau EDTA, și preparate leucocitare concentrate (buffy coat-300 µl).
NB: În LAM-2, extracția se face în mod obișnuit din sânge proaspăt recoltat pe EDTA,
excepțional din sânge recoltat pe citrat.
Dacă un pacient este leucopenic și este necesară extracție din concentrat leucocitar,
acesta se poate prepara astfel:
 Sângele integral se centrifughează 10 min la 300 x g
 După centrifugare se vor separă 3 straturi: unul inferior format din eritrocite, unul
superior din plasmă și, între ele, un strat foarte subțire format din leucocite și trombocite
(concentratul leucocitar).
 Cu o pipetă de transfer sterilă se îndepărtează plasma până la 1-2 mm de interfață
cu stratul de leucocite
 Apoi stratul de leucocite și cu 1-2 mm din cel cu eritrocite se transferă într-un tub
de microcentrifugă și va fi utilizat mai departe pentru extracție de ADN.
 Concentratul leucocitar poate fi păstrat la 4 °C pentru o săptămână sau la -20 - -
40°C timp îndelungat.
16
Etapele extracției automate
Pregătirea probelor și a instrumentului
 Se vortexează probele de sânge.
 Pentru fiecare probă se pregătește câte 1 tub iPrep Sample Tube și 1 tub iPrep
Elution Tube pe care se notează codul probei.
 Se pipetează în unul din tuburi 350 µl sânge uman/300 µl concentrat leucocitar.
NB: extracția se poate face și dintr-un volum mai mic de sânge, dar nu mai puțin de 150 µl
 Tubul cu proba de sânge se pune în poziția 11 a cartușului cu reactivi.
 Se pornește instrumentul iPrep Purification Instrument, se încarcă cu reactivi și
consumabile și se stabilește protocolul de lucru.
 Se pot face minim 1 extracție și maxim 13 extracții.
 La sfârșitul procedurii de extracție, ADN-ul extras se regăsește în tuburile de
eluție.
 ADN-ul pentru utilizare curentă se păstrează la frigider.
Stocarea pe timp îndelungat se face la -200C.
După extracție se măsoară concentrația și puritatea (A260nm/A280nm) ADN-ului în eluatul
obținut cu ajutorul nanofotometrului IMPLEN P300. Se consideră acceptabile concentrații >20
ng/μl și raportul A260nm/A280nm = 1,7 – 1,9.
Din 350 μl de sânge total se pot obține obișnuit 6-8,7 μg de ADN în 200 μl eluat (30-45
ng/μl) cu puritatea 1,81-1,83, iar din 300 μl concentrat leucocitar, 23 μg de ADN în 200 μl eluat
(115 ng/μl) cu puritatea 1,84.
17
5. MĂSURAREA CONCENTRAȚIEI ȘI A PURITĂȚII ADN
(NANOFOTOMETRUL IMPLEN P300)
Principiul metodei
Determinarea concentrației și purității ADN-ului este importantă pentru obținerea
ampliconilor rezultați în urma reacției PCR. Se consideră acceptabile concentrații >20 ng/μl și
raportul A260nm/A280nm = 1,7 – 1,9.
Concentrații mai mici se obțin la pacienți leucopenici (aplazii medulare, imediat după
chimioterapie, etc.). În această situație conduita este următoarea:
• Dacă genotiparea HLA poate fi temporizată se așteaptă câteva zile până
leucocitele cresc peste 1000/mmc și atunci se recoltează o nouă proba de sânge din care se repetă
extracția.
• Dacă este o urgență se repetă extracția din aceeași proba folosind metodă manuală
la care se modifică ușor protocolul (se poate crește cantitatea de sânge total din care se face
extracția și/sau la sfârșit se poate scădea cantitatea de soluție de eluţie).
Modul de utilizare al nanofotometrului IMPLEN P300
 Se pornește instrumentul.
 Se apasă tasta 1 pentru a selecta aplicația NanoVolume
 Se apasă tasta 1 pentru a selecta Nucleic Acid
 Se apasă tasta 1 pentru a selecta dsDNA
Pe display vor apare mai mulți parametri ale căror valori pot fi modificate folosind tastele
de săgeți și keypad-ul de numere. Pentru scopul propus vor fi utilizate următoarele setări :
● Lid Factor : 10
● Dilution Factor : 1.000
● Units : ng/µl sau µg/ml
● Factor : 50.0
18
● Background : On
● Se apasă tasta verde Sample (echivalent cu OK)
Notă : ori de câte ori se deschide instrumentul, înainte de a începe măsurătorile
probelor, trebuie măsurat Blank-ul (Referință)
 Se îndepărtează capacul Lid 10 de pe celula de citire a absorbantei și se pun pe aceasta 3
µl din soluția de eluţie folosită la extracția ADN-ului.
 Se pune iarăși capacul Lid 10 și se apasă tasta albastră Blank
 Pe display-ul cu rezultate va apare la parametrul Sample numele de Reference iar valorile
concentrației și absorbanţelor la 230, 260, 280 și 320 nm vor fi 0.
 Folosind o bucată de tifon uscat, fără scame se curată eluția de pe celula de citire și de pe
capacul Lid.
Notă : această operațiune se execută după fiecare probă măsurată
 Proba se vortexează foarte bine și apoi se pun 3 µl pe celula de citire și se acoperă cu
capacul Lid 10.
 Se apasă tasta verde Sample
Pe display-ul cu rezultate vor apare valorile concentrației, absorbanţelor la 230, 260,
280 și 320 nm și valorile A260/A280 și A260/A230. Aceste rapoarte reflectă puritatea ADN-ului
extras. Valorile optime sunt : A260/A280 ≥ 1.8 și A260/A230 ≥ 2. Valoarea A280 este dată de
contaminarea cu proteine iar valoarea A230 este dată de contaminarea cu buffer utilizat la
extracție (TRIS, EDTA, etc.).
Procedura descrisă mai sus se aplică pe rând pentru fiecare probă
 La sfârșitul măsurătorilor se apasă tasta roșie Escape și apoi tasta verde Sample
(echivalent cu OK) și se închide instrumentul de la butonul ON/OFF (ⱷ)
19
6. GENOTIPAREA HLA SSP- REZOLUȚIE MEDIE ȘI INTERPRETAREA
ALELELOR HLA
Pricipiul metodei
Primerii sunt secvențe de oligonucleotide monocatenare, complementare pentru
extremitățile 3’ și 5’ ale secvenței de ADN țintă. Ei se leagă de acest ADN și determină
amplificarea specifică a secvenței țintă.
Pentru genotipare HLA, kit-urile sunt alcătuite dintr-un panel de mixturi de primeri,
fiecare mixtură conținând cel puțin 2 perechi de primeri: o pereche specifică pentru amplificarea
HLA și o pereche de primeri care sunt considerați primeri de control intern al amplificării și care
determină amplificarea unei secvențe de ADN care nu aparține genelor HLA (la kit-urile
Innotrain controlul intern este reprezentat de gena HGH-Human Growth Hormone).
După amplificare, ampliconii obținuți sunt vizualizați prin electroforeză în gel de agaroză
1,5-2% și examinare în lumina UV și se observă sub formă unor benzi galben-strălucitoare.
Interpretarea pattern-ului de amplificare se realizează cu ajutorul unui soft specializat (ex. Ready
Gene Online).
Genotiparea HLA ssp- rezoluție medie se pretează la donatorii de organe, perechi înrudite
pentru transplant renal, donatori din Registrul Donatorilor Voluntari de CSH, genotipare de
verificare în transplantul medular.
❖ Plăcuțe de amplificare cu număr diferit de stripuri (godeuri) și culoare diferită în funcție
de locusul testat:
● HLA-A: 3 stripuri (24 godeuri) - verde
● HLA-B: 6 stripuri (48 godeuri) - galben
● HLA-C: 3 stripuri (24 godeuri) - portocaliu
● HLA-DRB1: 3 stripuri (24 godeuri) - roșu
● HLA-DQB1: 1 strip (8 godeuri) - albastru
● HLA-DPB1: 6 stripuri (48 godeuri) - albastru
Există kituri care permit și tipizarea combinată:
● HLA-ABDRB1: 12 stripuri (96 godeuri) - transparent
● HLA-ABC: 12 stripuri (96 godeuri) - albastru
● HLA-DRB1DQB1: 4 stripuri (32 godeuri) – violet
● HLA-DRDQDP: 12 stripuri (96 godeuri) - roșu
❖ Tuburi cu 0,5 ml PCR buffer
❖ Folii adezive de acoperit plăcuțele sau capace sub formă de strip
Kitul se păstreză la congelator la -200C.
20
● pipete automate : 1-10μl, 10-100μl, 100-1000μl
● suport pentru plăcuțele de amplificare
● vârfuri cu barieră 1-10μl, 10-100μl, 100-1000μl ;
● mănuși fără talc
● gel de agaroză
● TBE 0,5x
● Taq polimeraza (Innotrain sau Ampli-Taq DNA Polymerase)
● apă nuclease free
● apă distilată
● marker de greutate moleculară pentru ADN
● termocycler
● centrifugă
● vortex
● timer
● hotă cu flux de aer laminar
● cuva electroforeză
● Transluminator – lampa UV pentru electroforeză

● sistem de fotografiere a benzilor electroforetice
21
● program PC- ReadyGene Online
Metoda de lucru
Probele de ADN
ADN-ul de testat este obținut prin extracție din sânge integral recoltat pe EDTA sau
citrat. Se poate folosi extracția manuală cu kit-uri Qiagen sau extracția automată cu instrumentul
iPrep Purification Instrument.
Concentrația optimă de ADN este 25-100ng/µl, puritate 0,7-2, dar rezultate
satisfăcătoare se obțin și la concentrații mai mici (în acest caz se poate modifica protocolul de
preparare al master-mix-ului: se crește cantitatea de ADN și se scade cu același volum cantitatea
de apă).
Prepararea mixturii de amplificare

Notă: Indiferent de locusul tipizat, prepararea mix-ului de amplificare și programele de
amplificare sunt identice.
1. Se scot de la congelator și se dezgheață plăcuțele cu godeuri specifice pentru locusurile
dorite și buffer-ul de amplificare.
Notă: buffer-ul de amplificare este identic la toate kiturile Innotrain => dacă la un pacient
se dorește genotiparea HLA-A și B se poate folosi buffer-ul din trusa HLA-A).
2. Plăcuțele sunt marcate cu un punct negru în dreptul godeului H1 care reprezintă godeul
de control negativ, exceptând HLA-DQB1 care nu are godeu de control negativ.
3. Într-un tub Eppendorf se prepară master mix-ul din apă, buffer și Taq polimeraza
(5UI/μl) conform tabelului:
22
Nota1: Taq polimeraza se păstrează la congelator, se scoate numai în momentul utilizării
și apoi se reintroduce în congelator
Nota2: volumul de apă poate fi ajustat în funcție de concentrația ADN-ului (vezi pct.
4.1.)
Nr. Stripuri Apă Buffer PCR Taq polimeraza ADN
Locusul
(godeuri) (μl) (μl) (μl) (μl)
DQB1 1 (8 godeuri) 60 30 0,8 10
A, C, DRB1 3 (24 godeuri) 168 84 2,2 26
DRDQ 4 (32 godeuri) 222 111 3 35
B, DPB1 6 (48 godeuri) 324 162 4,3 52
ABDR1,
ABC, 12 (96 godeuri) 624 312 8,3 102
DRDQDP
4. Se vortexează ușor și apoi din amestecul preparat se pun 10 μl în godeul H1 (control
negativ)
5. Se adaugă ADN-ul în cantitatea adecvată (vezi tabelul).
6. Se vortexează ușor și se centrifughează 2-3 sec.
7. Se pun câte 10 μl în restul godeurilor.
8. Se verifică dacă mixtura este pe fundul godeului (în caz contrar se poate lovi plăcuța de
masă, ușor, prin mișcări scurte sau se poate centrifuga 4-5 sec).
9. Se acoperă godeurile cu capace/folia adezivă și se introduce plăcuța în termocycler
pentru amplificare.
Amplificarea
Programul de amplificare este identic indiferent de locusul testat:
Number of cycles Temperature Time
1 96oC 2 min
10 96oC 15 sec
65oC 60 sec
20 96oC 15 sec
61oC 50 sec
72oC 30 sec
1 4oC ∞
23
Electroforeza în gel de agaroză
La sfârșitul amplificării vizualizarea produșilor de amplificare se realizează prin
electroforeza în gel de agaroză 1,5-2%. Transferul mixturii din placă în gel se face începând cu
godeul H1 (H1->A1 apoi H2 ->A2 etc.). În godeurile de pe mijlocul gelului se pune markerul de
greutate moleculară. Pentru un godeu dat putem avea următoarele situații:
Bandă de control Bandă de amplificare Reactivitate
intern specifică
prezentă absentă negativ
prezentă prezentă pozitiv
absentă prezentă pozitiv
absentă absentă amplificare eșuată
Notă: pentru un locus dat, sunt considerate ca acceptabile plăcuțele care au maxim 2
godeuri cu amplificare eșuată, în afară godeului de control negativ. În caz contrar se repetă
amplificarea.
Markerul de greutate este utilizat pentru a determina mărimea fragmentelor de
amplificare obținute.
Controlul intern poate avea 3 mărimi posibile:
• 430 bp – apare în godeul de control negativ în caz de contaminare
• 1070bp – funcționează și ca un indicator al poziției stripului (apare în godeul 2 din
stripul 2, în godeul 3 din stripul 3, în godeul 4 din stripul 4, etc)
• 800bp – apare în restul godeurilor
Ampliconul specific apare ca o bandă suplimentară și are mărimi variabile de la un godeu
la altul. Dimensiunea ampliconilor specifici este precizată în Worksheet-ul care însoțește fiecare
kit de amplificare și este apreciată prin comparație cu markerul de greutate moleculară. Benzile
fals pozitive se exclud pe baza greutății moleculare.
Analiza pattern-ului de reacție și generarea genotipului se face automat cu ajutorul soft-

ului Ready Gene Online. Baza de date internațională IMGT/HLA cu care se face
comparație când se interpretează rezultatele este actualizată permanent automat de către
soft.
24
Fiecare probă va fi interpretată de cel puțin două persoane independent.
7. GENOTIPAREA HLA SSP PRIN METODA SSP –REZOLUȚIE ÎNALTĂ

(INVITROGEN) ȘI INTERPRETAREA ALELELOR HLA
Pricipiul metodei
Primerii sunt secvențe de oligonucleotide monocatenare, complementare pentru
extremitățile 3’ si 5’ ale secvenței de ADN țintă. Ei se leagă la ADN pe bază de
complementaritate și determină amplificarea specifică a secvenței țintă.
Pentru genotipare HLA, kit-urile sunt alcătuite dintr-un panel de mixturi de primeri,
fiecare mixtură conținând cel puțin 2 perechi de primeri: o pereche specifică pentru amplificarea
HLA și o pereche de primeri care sunt considerați primeri de control intern al amplificării și care
determină amplificarea unei secvențe de ADN care nu aparține genelor HLA.
După amplificare, ampliconii obținuți sunt vizualizați prin electroforeză în gel de agaroză
1,5-2% și examinare în lumină UV și se observă sub forma unor benzi galben-strălucitoare.
Interpretarea pattern-ului de amplificare se realizează cu ajutorul unui soft specializat
(UniMatch).
Kit-urile Invitrogen de rezoluție înaltă (A, B, C, DRB1, DQB1, DPB1) sunt utilizate
pentru genotipare HLA la primitori și donatori compatibili pentru transplant medular, genotipare
de verificare/confirmare la donatori din Registrul Donatorilor Voluntari de CSH, complementar
la SBT (în cazuri selecționate), pentru rezolvarea ambiguităților obținute la genotiparea de
rezoluție joasă/medie.
❖ Plăcuțe de amplificare separate pentru fiecare probă, cu număr diferit de stripuri
(godeuri) în funcție de locusul testat și nivelul de rezoluție:
● HLA-A (high resolution): 12 stripuri (96 godeuri)
● HLA-B (high resolution): 12 stripuri (96 godeuri)
● HLA-C (high resolution): 12 stripuri (96 godeuri)
● HLA-DRB1 (high resolution): 12 stripuri (96 godeuri)
● HLA-DQB1 (high resolution): 4 stripuri (32 godeuri)
● HLA-DPB1 (high resolution): 6 stripuri (48 godeuri)
În fiecare godeu al plăcuței se află o mixtură liofilizată de cel puțin 2 perechi de primeri:
o pereche de primeri de control intern care sunt identici în toate godeurile și o pereche de primeri
specifici care sunt diferiți de la un godeu la altul și amplifică secvențe (regiuni) diferite din gena
HLA pe care dorim să o analizăm.
❖ Tuburi cu PCR buffer alicotat (cate 1 tub pentru fiecare probă/plăcuță)
❖ Folii adezive de acoperit plăcuțele
Kitul se păstrează la frigider la 2 - 80C.
25
● vârfuri cu barieră 1-10μl, 10-100μl, 100-1000μl
● gel de agaroză
● TBE 0,5x
● apă distilată
● termocycler
● centrifugă
● vortex
● timer
● cuvă electroforeză
● transluminator – lampă UV pentru electroforeză
● program PC-UniMatch
Metoda de lucru
Probele de ADN
citrat. Se poate folosi extracția manuală sau extracția automată cu instrumentul iPrep Purification
Instrument.
Concentrația optimă de ADN este 50ng/µl, puritate 1,7-2, dar rezultate satisfăcătoare se
obțin și la concentrații mai mici (în acest caz se poate modifică protocolul de preparare al
master-mix-ului: se crește cantitatea de ADN și se scade cu același volum cantitatea de apă).

1. În funcție de locusul HLA ce se dorește a fi genotipat, se scoate din kit-ul de la
frigider o plăcută de amplificare și tubul cu buffer PCR aferent.
2. Se notează pe plăcuță și pe tubul cu buffer codul probei
3. Se pun într-un suport.
26
4. În tubul cu buffer se adaugă apă nuclease free și Taq polimeraza (5 U/µl) în
cantitățile corespunzătoare, în funcție de numărul de godeuri al plăcuței, conform tabelului:
Număr Buffer PCR Taq(μl) Apă(μl) Volum

(μl)
reacții 5 UI/μl ADN(μl)
96 (12 stripuri) 460 7 608 125
48 (6 stripuri) 230 3.5 304 62.5
32 (4 stripuri) 153 2.3 203 42
24 (3 stripuri) 115 1.8 152 31.3
16 (2 stripuri) 80 1.2 105.8 21.7
8 (1 strip) 66 1 87 18

Nota2: volumul de apă poate fi ajustat în funcție de concentrația ADN-ului
5. Se amestecă cu atenție prin răsturnare.
6. Se pipetează 10 μl din acest amestec în ultimul godeu al plăcuței corespunzătoare
(godeul de control negativ – are primeri de culoare albastră pe fundul godeului).
NB: godeul nr.1 este totdeauna H1
7. Se adaugă la mixtură cantitatea de ADN necesară conform tabelului.
8. Scurtă vortexare
9. Centrifugare 1-2 sec.
10. Se pipetează apoi câte 10μl din amestecul obținut în fiecare godeu, exceptând
godeul de control negativ.
11. Se acoperă placă cu folie adezivă și se bate ușor pentru a nu rămâne picături pe
pereții godeurilor sau se centrifugheaza 4-5 sec.
12. Se introduce placă în termocycler
13. Selectează programul de amplificare corespunzător.
27
Programul de amplificare este identic indiferent de locusul testat:
Etape Temperatura (°C) Timp (secunde) Actiune
Denaturare 96 60 Denaturare
5 cicluri 96 25 Denaturare, Aliniere, Extensie

70 50
72 45

65 50
72 45

55 60
72 120
Hold 4 Timp specificat -

de utilizator
Electroforeză în gel de agaroză

electroforeză în gel de agaroză 1,5-2%. Transferul mixturii din placă în gel se face începând cu
godeul H1 (H1→ A1 apoi H2 → A2 etc.). În godeurile de pe mijlocul gelului se pune markerul
de greutate moleculară. Pentru un godeu dat putem avea următoarele situații:
Bandă de control intern Bandă de amplificare specifică Reactivitate

prezentă absentă negativă
prezentă prezentă pozitivă
absentă prezentă pozitivă
absentă absentă amplificare eșuată
godeuri cu amplificare eșuată, în afara godeului de control negativ. În caz contrar se repetă
amplificarea.
Markerul de greutate este utilizat pentru a determina mărimea fragmentelor de
amplificare obținute. Controlul intern are 1200 bp în toate godeurile și pentru toate locusurile cu
următoarea excepție: HLA-B (high) – 200 bp în godeurile 75 și 77, în rest 1200 bp.
28
la altul. Dimensiunea ampliconilor specifici și a controlului intern sunt precizate în Worksheet-ul
și în Gel Documentation Form care se găsește pe CD-ul ce însoțește fiecare kit de amplificare și
este apreciată prin comparație cu markerul de greutate moleculară.
Benzile fals pozitive se exclud pe baza greutății moleculare. De asemenea, soft-ul de
analiză poate afișa dimensiunea posibilă a ampliconului specific din fiecare godeu.
Analiza pattern-ului de reacție și generarea genotipului se face automat cu ajutorul soft-

ului UniMatch ver 6.0. Baza de date internațională IMGT/HLA cu care se face comparație
când se interpretează rezultatele trebuie să fie actualizată cel puțin anual cu ultima
versiune disponibilă.
8. GENOTIPAREA HLA SBT – METODA SANGER (SECORE

INVITROGEN) – INTERPRETAREA AMBIGUITĂȚII ALELICE
Pricipiul metodei
Kit-urile SeCore permit identificarea secvenței de nucleotide dintr-o genă HLA țintă.
Într-o primă etapă se face o amplificare locus specifică. Produsul rezultat este tratat apoi cu
ExoSAP-IT pentru a degrada primerii neîncorporați și restul de nucleotide libere rămase.
Urmează o a doua amplificare care utilizează, pe lângă nucleotidele obișnuite,
dideoxinucleotide marcate fluorescent la sfârșitul căreia are loc o purificare prin precipitare cu
etanol.
În final, produșii ADN obținuți sunt denaturați la 96°C în soluție de formamidă și supuși
electroforezei capilare în instrumentul de secvențiere Applied Biosystems ABI Prism 3500.
29
Metoda de secvențiere (SBT) care permite o genotipare HLA de rezoluție înaltă este
utilizată pentru genotipare HLA la primitori și donatori compatibili pentru transplant medular,
genotipare de verificare/confirmare la donatori din Registrul Donatorilor Voluntari de CSH,
complementar la SSP.
a) Componente pre-PCR
• Amp Mix (primeri locus specifici)
❏ HLA-A, B, C – 1 singur tub pentru cei 3 exoni (2,3,4)
❏ HLA-DRB1-1 singur tub pentru exonul 2 sau 2 tuburi (pentru exonul 2 și 3)
❏ HLA-DQB1- 2 tuburi (pentru exonul 2 și 3)
❏ HLA-DPB1- 2 tuburi (pentru exonul 2 și 3/4)
• FastStart™ Taq DNA Polymerase (5U/μl)
b) Componente post-PCR
• ExoSAP-IT™
• Seq Mix (primeri de secventiere)
❏ Locus A, B și C – Exon2-Fwd/Rev, Exon3-Fwd/Rev, Exon4-Fwd/Rev
❏ Locus DRB1 - Exon2-Fwd/Rev, codón 86 Rev ± Exon3-Fwd/Rev
❏ Locus DQB1 - Exon2-Fwd/Rev, Exon3-Fwd/Rev
❏ Locus DPB1 - Exon2-Fwd/Rev, Exon3-Fwd/Rev, Exon4-Fwd/Rev, codón 8 Fwd,
codón 85 Rev
• Sequencing PPT Buffer
Kitul se păstreză la congelator la -200C.
Primerii de secvențiere (Seq Mix) sunt sensibili la lumină și trebuie protejați în timpul
lucrului.

● plăcuţe de amplificare pentru secvențiere MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate
● microAmp 96-Well Tray/Retainer Set
● gel de agaroză
● TBE 0,5x
● apă distilată
30
● termocycler
● centrifugă pentru tuburi și pentru plăci de amplificare care să atingă o forță de 2500xg
● vortex; timer
● transluminator – lampa UV pentru electroforeză
● secvenţiator și consumabilele acestuia: polimer POP-7, capillary array, anod și catod buffer
● Hi-Di Formamida
● Etanol absolut
● program PC-uType pentru analiza datelor
Metoda de lucru
Probele de ADN
citrat. Se poate folosi extracția manuală sau extracția automată cu instrumentul iPrep Purification
Instrument. Concentrația optimă de ADN este 15-30 ng/µl, puritate 1,7-1,9. Probele cu
concentrații mai mari pot fi diluate în apă pentru uzul imediat.
Amplificarea locus specifică

1) Se scoate de la congelator să se dezghețe locus specific Amp Mix. Între timp, se
pregătește un tub de 0.5 – 1.5 ml în care se va prepara mixtura de amplificare iar pentru fiecare
probă, se pregătește câte un tub de 0.2 ml pentru amplificare pe care se va nota codul probei.
2) Amp Mix-ul dezghețat se vortexează foarte bine și se centrifughează scurt 1-2 sec.
3) În tubul de 0.5 – 1.5 ml se prepară mixtura de amplificare după cum urmează:
● Pentru locusurile de clasa I (A,B,C): se calculează pentru fiecare probă 19,8 µl
Amp Mix și 0,2 µl FastStart™ Taq DNA Polymerase (5U/μl)
31
● Pentru locusurile de clasa a II-a (DRB1, DQB1): se calculează pentru fiecare
probă 22,8 µl Amp Mix și 0,2 µl FastStart™ Taq DNA Polymerase (5U/μl)
Notă:
❏ Pentru locusul DQB1 și pentru DRB1 (kit cu exoni 2&3) se va prepara master mix separat
pentru exonul 2 și exonul 3
❏ Taq polimeraza se păstrează la congelator, se scoate numai în momentul utilizării și apoi
se reintroduce în congelator
❏ Cantitățile pentru master mix se vor calcula pentru o proăa în plus pentru a evita
pierderile de soluție datorită pipetării
❏ Se recomandă ca mixtura să fie preparată pentru minim 5 probe pentru o mai bună
acuratețe a pipetării volumelor mici
4) Master mix-ul preparat se vortexează scurt de 2-3 ori și apoi se distribuie în tubușoarele
de 0,2 ml câte 20 µl pentru clasa I și respectiv 23 µl pentru clasa a II-a.
5) Se adaugă ADN-ul câte 5 µl pentru clasa I și respectiv 2 µl pentru clasa a II-a.
6) Se închid tubușoarele, se centrifughează scurt și se pun în termocycler pentru amplificare.
Notă: programul de amplificare este identic pentru clasa I și pentru clasa a II-a
Cicluri Temperatura Timp
1 95°C 4 min
95°C 20 sec
25 63°C 20 sec
72°C 40 sec
1 72°C 5 min
1 4°C ∞
Timpul total este de cca 1,5 ore.

electroforeză în gel de agaroză 1,5-2%.
Se utilizează 5 µl ADN cu 1 µl Orange G.
Timpul de migrare se prelungește la 15 min pentru a permite o bună separare a benzilor
de la clasa I.
Ampliconii obținuți sunt de dimensiuni diferite în funcție de locus:
● Locus A: 1100 și 990 bp
● Locus B: 1400 și 950 bp
● Locus C: 1375 bp
● Locus DRB1 (single amplification kit): 300 bp
32
● Locus DRB1 (Ex 2&3 sequencing kit): Ex 2 - 500-850 bp, Ex 3 – 450 bp
● Locus DQB1: 350 și 375 bp
● Locus DPB1: 300 și 1000 bp
Notă: o bandă suplimentară > de 300 bp poate fi observată uneori alături de ampliconii obținuți
pentru locusul DRB1, dar nu afectează rezultatul secvențierii
Purificarea ampliconilor cu ExoSAP-IT

Prin tratarea cu ExoSAP-IT, sunt degradați primerii și sunt hidrolizate nucleotidele
neutilizate.
a) Se adaugă câte 4µl ExoSAP-IT în fiecare tubușor de amplificare unde s-au obținut
ampliconi specifici vizibili la electroforeză
b) Se închid tubușoarele
c) Se vortexează foarte bine (min 5 sec)
d) Scurtă centrifugare
Notă: vortexarea este foarte importantă pentru succesul purificării.
e) Se introduc tubușoarele în termocycler și se rulează următorul program:

37°C 20 min
1
80°C 20 min
1 4°C ∞
Ampliconii tratați cu ExoSAP-IT pot fi stocați la -20°C maxim 1 săptămână.
Pregătirea reacției de amplificare pentru secvențiere

Pe o foaie de lucru cu reprezentarea unei plăcuţe de amplificare cu 96 de godeuri se
stabilește poziția fiecărui primer de secvențiere și a fiecărei probe, având în vedere că pentru
fiecare probă testată pentru locusuri de clasa I avem nevoie de 6 godeuri, pentru DRB1 avem
nevoie de 3 godeuri iar pentru DQB1 de 4 godeuri. Exemplu:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A A2F B2F C2F Q2F
Proba1 Proba1 Proba1 Proba1
B A2R B2R C3R Q2R
C A3F B3F C3F Q3F
D A3R B3R C3R Q3R
E A4F B4F C4F Q2F
Proba2
F A4R B4R C4R Q2R
G R2F R2R Cod86 Q3F
33
Proba1
H R2F R2R Cod86 Q3R
Proba2
Notă: - setarea plate-ului se face în așa fel încât un strip să fie complet în întregime. Dacă
într-un strip rămân godeuri neutilizate, în momentul când se pregătește plăcuţa pentru
electroforeză capilară, în aceste godeuri se va pune formamida
- Se folosește o plăcuță specială Optical 96-Well Plate de la Applied Biosystems
a. La sfârșitul etapei de purificare, în tubușoarele cu probe amplificate pentru locusurile de
clasa a II-a se adaugă 40 µl de apă ultrapură și se mixează foarte bine. (probele pentru clasa I NU
se diluează)
b. Din fiecare probă purificată ± diluată se pun câte 2 µl în godeurile presetate anterior
c. Se adaugă câte 8 µl din mix-ul de secvențiere (Seq Mix) locus specific în godeurile
presetate anterior
Notă: Primerii de secvențiere (Seq Mix) sunt sensibili la lumină și trebuie protejați în
timpul lucrului.
d. Se acoperă plăcuţa, se vortexează și apoi se centrifughează scurt.
e. Se introduce plăcuţa în termocycler și se rulează următorul program:
f.
95°C 20 sec
25 50°C 15 sec
60°C 60 sec
1 4°C ∞
Timpul total este de cca 1,5 ore.
După amplificare, trebuie continuat cu etapa de precipitare cu etanol în maxim 24

h. În acest timp, plăcuţa poate fi stocată la frigider la 2-8°C.
Precipitarea cu etanol
Această procedură are ca rezultat îndepărtarea excesului de terminatori. Ea este identică
pentru clasa I și clasa a II-a.
a. Se adaugă 2 µl de Sequencing PPT Buffer în fiecare godeu
b. Se centrifughează scurt pentru a aduna tot conținutul mixturii pe fundul godeului
c. Se adaugă 40 µl etanol absolut în fiecare godeu
d. Se acoperă plăcuţa și se vortexează viguros minim 1 min.
Notă: vortexarea este foarte importantă pentru succesul secvenţierii
e. Se centrifughează plăcuţa 30 min la 2000xg
f. Se descoperă plăcuţa și se răstoarnă peste un prosop de hârtie
g. Așa răsturnată, se centrifughează 1 min la 500xg
h. Se adaugă 100 µl etanol 70% în fiecare godeu
i. Se acoperă plăcuţa și se centrifughează 5 min la 2000xg
34
Notă: NU se mai vortexează cu etanol
j. Se îndepărtează supernatantul repetând pașii de la pct. f și g
Pregătirea plăcuței pentru electroforeză capilară

a. După îndepărtarea supernatantului, se mai poate lăsa plăcuţa deschisă, în hotă cu flux de
aer laminar, câteva minute, pentru evaporarea completă a etanolului
b. În acest timp se scoate de la congelator Hi-Di Formamida pentru a se dezgheța
c. Se pun câte 15 µl Hi-Di Formamida în toate godeurile
Notă: nu trebuie să avem godeuri goale în nici un strip. Dacă nu avem probe, se
completează doar cu formamidă
d. Se acoperă plăcuţa
e. Se centrifughează scurt pentru a aduna tot conținutul pe fundul godeului
f. Se introduce plăcuţa în termocycler pentru denaturare: 2 min la 95°C
g. După denaturare, se verifică dacă nu sunt bule de aer în godeuri (acestea pot cauza
deteriorări ale capilarului) și dacă este cazul se mai centrifughează o dată scurt.
h. Se montează plăcuţa în Autosampler-ul secvenţiatorului,
i. Se introduce în instrument
j. Se pornește procedura de electroforeză capilară.
Analiza electroferogramelor
Analiza secvențelor de nucleotide obținută se face automat cu ajutorul soft-ului uType.
Baza de date internațională IMGT/HLA cu care se face comparație când se interpretează
rezultatele trebuie să fie actualizată cel puțin anual cu ultima versiune disponibilă.
Criteriile de acceptare a datelor primare sunt:
a. Secvențele cu mai mult de 5 diferențe în pozițiile constante nu vor fi interpretate
b. Media basecall quality value (QV)să fie ≥ 20
c. Lungimea secvențelor de baze neîntrerupte să fie ≥ 100.
d. Intensitatea peak-ului să fie între 300 și 5000 RFU
e. Bazele mixte nu sunt analizate când înălțimea peak-ului secundar este sub 33%
din cea a peak-ului principal.
f. Absența abaterilor semnificative ale liniei de baza, care să interfereze cu analiza
g. Peak-urile să aibă formă caracteristică de la calibrare și să nu se interfereze cu
peak-ul adiacent
h. Raportul noise/signal să fie sub 20%
i. Regiunile cu dificultăți de interpretare (sfârșit de secvență, regiuni comprimate)
vor fi interpretate numai în condițiile în care secvența complementară este clară. În caz contrar se
repetă secvenţierea
35
Electroforegramă reprezentând o secvență de nucleotide
Interpretarea ambiguității alelice

Ambiguitățile aleleice generate de aplicarea metodelor de genotipare de rezoluție medie
(2 digiţi) se pot rezolva prin metode de genotipare de rezoluție înaltă (4 digiţi) precum
secvențierea. Prin metoda SSP se tipizează exonii 2 și 4 iar prin secvenţiere se pot tipiza exonii
2, 3 și 4.
Accesând bazele de date internaționale în care sunt precizate secvențele de nucleotide ale
alelelor HLA se poate identifica succesiunea bazelor azotate în exoni ajutându-ne astfel în
rezolvarea ambiguităților alelice prin secvenţierea selectivă a acelor exoni.
9. GENOTIPARE HLA SSO-LUMINEX CU KIT-URI LABTYPE (ONE

LAMBDA)
Pricipiul metodei
LABType® aplică tehnologia Luminex la metoda de tipizare HLA prin reverse-SSO.

Utilizează sonde oligonucleotidice cu secvență specifică pentru alelele HLA, sonde care sunt
legate la microsfere codate fluorescent.
Într-o primă etapă se amplifică ADN-ul țintă printr-o reacție PCR folosind primeri grup-
specifici. Produsul amplificării este biotinilat ceea ce permite detecția lui folosind streptavidina
conjugată cu Phycoerythrin (SAPE). Produsul amplificării este denaturat și apoi rehibridizat cu
sondele oligonucleotidice de pe microsfere.
Microsferele sunt analizate cu ajutorul instrumentului Luminex. Folosind un sistem cu
două lasere, acesta identifică pe de o parte, fiecare microsferă, și în același timp măsoară
intensitatea fluorescenței Phycoerythrin-ei pe fiecare microsferă. Patternul de reacție este
analizat apoi automat cu ajutorul unui soft (Fusion).
36
Întrucât permite genotiparea unui număr mare de probe într-un singur run (ex:
genotiparea unui locus pentru 96 probe concomitent), metoda de genotipare Luminex este
utilizată în principal pentru genotiparea donatorilor din Registrul Donatorilor Voluntari de CSH
și pentru genotiparea primitorilor aflați pe listele de așteptare pentru un transplant de organ solid.
● Primer Set D-Mix
● Locus –Specific Primer Set
● Bead Mixture: conține un set de microsfere marcate fluorescent tapetate cu sonde

oligonucleotidice cu secvență unică specifică pentru alelele HLA.
Fiecare mixtură include microsfere de control pozitiv și negativ pentru substracţia

semnalului de background și normalizarea fluorescențelor brute. Mixtura de microsfere este pre-
optimizată pentru produși de amplificare particular obținuți prin amplificare cu anumiți primeri
HLA locus-specifici.
Pentru fiecare lot de reactivi, microsferele sunt tapetate specific cu anumite sonde
(configurația este furnizată pe Worksheet-urile și pe Bead Probe Information specifice fiecărui
lot).
● Denaturation Buffer
● Neutralization Buffer
● Hybridization Buffer
● Wash Buffer
Kitul se păstrează la congelator la -200C. Microsferele sunt sensibile la lumină și trebuie
protejate în timpul lucrului. După prima utilizare a kit-ului, odată dezghețate, flaconul cu bile va
fi stocat la 2 - 8°C și trebuie utilizat în decurs de 3 luni.
● pipete automate : 1-10 μl, 10-100 μl, 100-1000 μl
● plăcuțe sau tubuşoare de 200 µl pentru amplificare
● tuburi de 15-50 ml
● cooler sau baie de gheață
● gel de agaroză
● TBE 0,5x
● Taq polimeraza (One Lambda)
37
● R- Phycoerythrin-Conjugated Streptavidin (SAPE)
● apă distilată
● termocycler
● centrifugă pentru tuburi și pentru plăci de amplificare care să atingă o forță de 1000-
1300xg
● vortex
● timer
● transluminator – lampa UV pentru electroforeză
● Etanol 70%
● Instrument Luminex
● Sheath fluid
● program PC-uType pentru analiză datelor
Metoda de lucru
Probele de ADN
citrat. Se poate folosi extracția manuală sau extracția automată cu instrumentul iPrep.
Concentrația optimă de ADN este 20 ng/µl, puritate 1,65-1,8. Probele cu concentrații mai mari
pot fi diluate în apă sterilă pentru uzul imediat.
Amplificarea locus specifică

a) Se scoate de la congelator să se dezghețe locus specific Amplification Primers și D-
Mix și apoi se păstrează pe gheață până la utilizare
b) Între timp, se pregătește un tub de 0.5 – 1.5 ml în care se va prepara mixtura de
amplificare iar pentru fiecare probă se pregătește câte un tub de 0.2 ml pentru amplificare pe care
se va nota codul probei sau o plăcuță de amplificare.
c) Amplification Primers și D-Mix dezghețate se vortexează bine și se centrifughează
scurt 1-2 sec.
d) În tubul de 0.5 – 1.5 ml se prepară mixtură de amplificare după cum urmează (inițial
fără Taq polimeraza):
38
Număr de teste D-Mix (µl) Amplification Taq polimeraza
Primers (µl) (µl)
1 13.8 4 0.2
10 138 40 2
50 691 200 10
96 1491 432 21.6 (22)
Notă:
- Taq polimeraza se păstrează la congelator, se scoate numai în momentul utilizării și
apoi se reintroduce în congelator
- Cantitățile pentru master mix se vor calcula pentru o probă în plus pentru a evita
pierderile de soluție datorită pipetării
- Se recomandă ca mixtura să fie preparată pentru minim 10 probe pentru o mai bună
acuratețe a pipetării volumelor mici
e) Master mix-ul preparat se vortexează 15 sec și se păstrează pe gheață
f) În tubuşoarele de 0,2 ml sau în godeurile plăcuței se pun pe fund câte 2 µl din probele
de ADN
g) În acest moment se adaugă cantitatea adecvată de Taq polimeraza în mixtura preparată
anterior
h) Se vortexează câteva sec și apoi se centrifughează 3-5 sec
i) Se adaugă câte 18 µl peste probele de ADN
j) Se închid tubuşoarele, se centrifughează scurt și se pun în termocycler pentru
amplificare
Notă: programul de amplificare este identic pentru clasa I și pentru clasa a II-a
Cicluri Temperature Timp

1 96°C 3 min
96°C 20 sec
5 60°C 20 sec
72°C 20 sec
96°C 10 sec
30 60°C 15 sec
72°C 20 sec
72°C 10 min
1 4°C ∞

La sfârșitul amplificării se recomandă vizualizarea produșilor de amplificare prin
electroforeză în gel de agaroză 1,5-2%. Se utilizează 2,5 µl ADN cu 0,7 µl Orange G. În
39
continuare, se vor păstra pentru hibridizare doar acele probe care au produși de amplificare
vizibili la electroforeză.
Dacă nu este hibridizat imediat, ADN-ul amplificat poate fi păstrat chiar 1 lună la -
20°C.
Pregătirea reactivilor pentru hibridizare

a) Se scot de la congelator să se dezghețe Beads Mixture, Hybridization Bufffer, Wash
Buffer, Denaturation Buffer, Neutralization Buffer.
Notă: dacă kit-ul nu este la prima utilizare, bilele se vor scoate din frigider.
b) În timp ce se dezgheață se pornește și Luminexul și se încep procedurile de mentenanță
de la începutul lucrului
c) Se setează și se pornește termocyclerul pe 60°C pentru cel puțin 1,5 h sau ∞.
d) Reactivii dezgheţaţi se alicotează în cantități mai mici, în funcție de numărul de probe,
după cum urmează și se păstrează la temperatura camerei până la utilizare:
Nr. de Denaturation Neutralization Hybridization Wash Buffer Beads

probe Buffer (µl) Buffer (µl) Bufffer (µl) (µl) Mixture (µl)
1 2,5 5 34 480 4
10 25 50 340 4800 40
20 50 100 680 9600 80
50 125 250 1700 24000 200
96 240 480 3264 46080 384
Notă: flaconul cu bile se vortexează foarte bine înainte de alicotare iar apoi tubul cu
alicot se protejează de lumină; cantitățile de alicot se vor calcula pentru câteva probe în plus
pentru a evita pierderile de soluție datorită pipetării; reactivii rămași se reintroduc la congelator
(excepție flaconul cu bile care se păstrează la frigider).
Etapa de denaturare/neutralizare
a. Se pregătește o plăcuţă cu 96 de godeuri
b. Se pun în godeuri câte 2,5 µl Denaturation Buffer pentru fiecare probă
c. Se adaugă câte 5 µl din ADN-ul amplificat, se amestecă foarte bine prin câteva
mișcări de pipetare și se incubează la temperatura camerei (20-25°C) pentru 10 min
d. După incubare se adaugă 5 µl Neutralization Buffer, se amestecă foarte bine prin
câteva mișcări de pipetare și se pune plăcuţa într-un cooler sau pe gheață
Notă: când se pune Neutralization Buffer trebuie că amestecul să-și schimbe culoarea de
la roz deschis la galben pal sau să devină chiar incolor.
Etapa de hibridizare
Înainte de a începe ne asigurăm că termocyclerul a ajuns la 60°C
a. Bilele alicotate anterior se amestecă cu Hybridization Bufffer și se obține Mixtura
de hibridizare.
40
b. Se vortexează și apoi se pun câte 38 µl în fiecare probă.
c. Se acoperă plăcuţa și se vortexează la viteză mică.
d. Se pune plăcuţa în termocycler la 60°C pentru 15 min.
e. La sfârșitul incubării, se scoate plăcuţa din termocycler, se pune în suport și se
adaugă repede 100 µl Wash Buffer.
f. Se acoperă plăcuţa și se centrifughează 5 min la 1000-1300 g.
g. Se aruncă Wash Buffer-ul printr-o mișcare bruscă.
h. Se repetă spălările cu Wash Buffer, în total de 3 ori.
i. În timpul ultimei centrifugări se prepară diluţia de SAPE 1x, astfel:
j.
Nr. de probe SAPE concentrat (µl) SAPE Buffer (µl)
1 0,5 49,5
10 5 495
20 10 990
50 25 2475
96 48 4752
Etapa de conjugare cu streptavidină

a. Se adaugă 50 µl SAPE diluată 1x în fiecare godeu.
b. Se acoperă plăcuţa și se vortexează la viteză mică.
c. Se pune plăcuţa în termocycler la 60°C pentru 5 min.
d. La sfârșitul incubării, se scoate plăcuţa din termocycler, se pune în suport și se adaugă
repede 100 µl Wash Buffer.
e. Se acoperă plăcuţa și se centrifughează 5 min la 1000-1300 g.
f. Se aruncă Wash Buffer-ul printr-o mișcare bruscă.
g. Se pun din nou 70 µl Wash Buffer în fiecare godeu, se mixează prin vortexare ușoară și
se centrifughează scurt.
h. Plăcuţa se introduce în instrument și se pornește procedura de achiziție a datelor.
Notă: pentru rezultate optime se recomandă ca citirea să fie făcută imediat. Prelungirea
timpului peste 4 ore duce la scăderea intensității semnalului. Dacă din motive obiective nu se
poate face citirea imediat, probele pot fi stocate peste noapte la 4°C, în întuneric, acoperite cu
folie de aluminiu. Înainte de citire, plăcuţa va fi vortexată ușor
Interpretarea rezultatelor
Analiza patterrn-ului de bile pozitive se face automat cu ajutorul soft-ului Fusion.
Pentru o probă, softul calculează întâi intensitatea medie a fluorescentei (MFI) pentru fiecare bilă
(sondă), apoi Percent Positive Value (PPV) pentru fiecare bilă cu formula:
MFI (bila n) – MFI (bila control negativ)
Percent Positive Value = 100 x
41
MFI (bila control pozitiv) - MFI (bila control negativ)
● bila (sonda) se consideră pozitivă dacă valoarea PPV calculată este mai mare
decât valoarea cut-off presetată de producător pentru bila respectivă
● bila (sondă) se consideră negativă dacă valoarea PPV calculată este mai mică
decât valoarea cut-off presetată de producător pentru bila respectivă
Producătorul obține valoarea cut-off prin testarea unui panel de 100-200 de probe de
ADN. În mod obișnuit, valoarea MFI pentru bila de control negativ este 0-100. Semnalele care
ies în afara intervalului pot fi determinate de mai mulți factori: cantitatea și/sau calitatea ADN-
ului, erori de tehnică, calibrarea instrumentului, starea reactivilor (buffere, SAPE, bile). Valoarea
MFI pentru bila de control pozitiv trebuie să fie 1200 – 7000 dar poate varia de la lot la lot.
Baza de date internațională IMGT/HLA cu care se face comparație când se
interpretează rezultatele trebuie să fie actualizată cel puțin anual cu ultima versiune
disponibilă.
10. GENOTIPAREA GENELOR KIR PRIN METODA SSP
Principiul metodei
Celulele NK sunt efectori importanți ai sistemului imun înnăscut, participând la
distrugerea celulelor infectate cu viruși și a celulelor maligne. Receptorii celulelor NK ( killer
cell immunoglobulin like-receptors) reglează această activitate prin legarea la celulă țintă.
Fiecare individ are un anumit repertoriu format din 15 gene KIR. Kit-ul KIR-Ready Gene
Innotrain cuprinde toate genele KIR și variantele alelice, fiind o metodă de biologie moleculară
SSP bazată pe principiul polimerizarii în lanț (PCR). În cadrul analizei PCR SSP, în proba care
va lega primerii specifici vor rezultă niște ampliconi post-PCR. Pentru tipare sunt necesare 24
godeuri/probă. Controlul pozitiv din fiecare tub va fi prezent în 2 mărimi diferite (430pb și
800pb).
Componentele kit-ului și materiale necesare

● 4 plăcuțe cu 96 de godeuri
● tuburi cu 0.5 ml de buffer PCR (Ready PCR) ce conțin: dNTPs, buffer PCR, cresol roșu,
glicerină
● folii adezive de protecție pentru a acoperi plăcuțele
● Taq polimeraza (5 U/µl)
● proba ADN (25-100 ng/ /µl)
42
Descrierea procedurii
● Extracția ADN-ului se face din sânge recoltat pe EDTA sau citrat, iar concentrația optimă
pentru reacție este 50 ng de ADN/ mix de reacție
● Se pregătește mixul PCR conform următorului tabel:
Godeuri Apă PCR Buffer PCR Taq polimeraza Proba de ADN

(6 µl/godeu) (3 µl/godeu) (0.08 µl/godeu) (1 µl/godeu)
24 168 84 2.2 26
● Înainte de a adăuga proba ADN se pipetează 10 µl în godeul de negativ control

● Se adaugă proba ADN în tubul de mastermix, se vortexează și se dispersează 10 µl în
restul godeurilor
● Se acoperă plăcuța cu folie și se transferă în PCR la programul următor:
Ciclul 1 10x 20x Timp
96ºC - 2 minute 96ºC – 15 secunde 96 ºC – 15 sec 4 ºC

65ºC - 60 secunde 61 ºC – 50sec
72 ºC – 30sec

electroforeză în gel de agaroză 1,5-2%. Transferul mixturii din placă în gel se face începând cu
godeul H1 (H1->A1 apoi H2->A2 etc.). În godeurile de pe mijlocul gelului se pune markerul de
greutate moleculară.
11. POLIMORFISMUL GENELOR CITOKINE PRIN METODA SSP
(PEL-FREEZ Cytokine Genotyping)
Principiul metodei
Kit-ul de genotipare citokine este bazat pe o metodă PCR ce detectează polimorfismul a 13
gene citokine. Pe o plăcută cu 96 de godeuri se găsesc primerii liofilizati care sunt utilizați în
amplificarea ADN-ului.
Se pregătește un mix de reacție ce conține buffer-ul de reacție, Taq polimeraza și proba ADN
ce urmează a fi analizată, se dispersează în plăcuţa cu 96 de godeuri și se amplifică cu ajutorul
PCR-ului. La finalul ciclului de amplificare, produșii rezultați se pot vizualiza prin electroforeză
43
în gel de agaroză 2%, iar rezultatul va fi interpretat cu ajutorul unui worksheet de lucru ce
însoțește kit-ul.
● Plăcuţe PCR de polipropilenă cu 96 de godeuri care conțin primeri liofilizaţi
● Buffer PCR care conține dNTP-uri
● Capace pentru plăcuţe
● Taq Polimeraza 5 U/µl
● Worksheet
Kitul se păstrează la congelator la -200C.

● Pipete automate : 1-10 µl, 10-200 µl, 100-1000 µl
● vârfuri cu barieră 1-10 µl, 10-200 µl, 100-1000 µl
● gel de agaroză
● TBE 0,5x
● apă distilată
● marker de greutate moleculară pentru ADN (50-2000 bp)
● termocycler
● centrifugă
● vortex
● timer
● transluminator – lampă UV pentru electroforeză
Metoda de lucru
Probele de ADN
citrat. Nu se folosesc probe recoltate în tuburi cu heparină. Heparina poate inhiba amplificarea
ADN. Se poate efectua extracția manuală cu kit-uri Qiagen sau extracția automată cu
instrumentul iPrep Purification Instrument.
Concentrația optimă de ADN este 75-125 ng/µl, puritate 1,7-1,9 dar rezultate
satisfăcătoare se obțin și la concentrații mai mici (în acest caz se poate modifica protocolul de
44
preparare al master-mix-ului: se crește cantitatea de ADN și se scade cu același volum cantitatea
de apă).

1. Se scot de la congelator și se dezgheață plăcuțele cu godeuri specifice pentru
locusurile dorite și buffer-ul de amplificare.
2. Într-un tub Eppendorf se prepară master mix-ul din apă, buffer și Taq
polimeraza (5UI/μl) și ADN-ul în cantitatea adecvată conform tabelului:
Nota2: volumul de apă poate fi ajustat în funcție de concentrația ADN-ului (vezi pct.
5.4.1.)
Nr. Stripuri Apa Buffer PCR Taq polimeraza ADN

(godeuri) (μl) (μl) (μl) (μl)
6 (48 godeuri) 329 30 140 50
3. Se vortexează ușor și se centrifughează 2-3 sec.

4. Utilizând o pipetă multicanal, se pun câte 10 μl din amestecul preparat în fiecare
godeu, fără a se atinge godeurile
5. Se verifică dacă mixtura este pe fundul godeului (în caz contrar se poate lovi
plăcuţa de masă, ușor, prin mișcări scurte sau se poate centrifuga 4-5 sec).
6. Se acoperă godeurile cu capace/folia adezivă
7. Se introduce plăcuţa în termocycler pentru amplificare.
Amplificarea
Programul de amplificare este următorul:
Stage 1 10x 20x Time

94ºC - 2 min 96ºC – 15 sec 96 ºC – 15 sec 4 ºC
65ºC - 60 sec 61 ºC – 50 sec
72 ºC – 30 sec

- La sfârșitul amplificării vizualizarea produșilor de amplificare se realizează prin
electroforeză în gel de agaroză 1,5-2%.
- Se transferă în gel 5µl produs PCR în fiecare godeu, începând cu godeul H1 (H1->A1
apoi H2 ->A2 etc.).
- În godeurile de pe mijlocul gelului se pune marker-ul de greutate moleculară. Marker-
ul de greutate este utilizat pentru a determina mărimea fragmentelor de amplificare obținute.
- Se conectează electrozii și se începe electroforeza timp de 12 minute
45
- Se fotografiază gelul
Interpretarea rezultatelor
Interpretarea rezultatelor se face pe baza examinării gelului, determinând benzile
pozitive.
Kit-ul conține două tipuri de controlul intern:
● 89 bp – gena ß-globin, apare în godeurile care identifica citokinele IL2, IL4,
IL6 și IL10
● 440 bp – gena pentru proteină C reactivă umană, apare în godeurile care
identifică citokinele IL1α , IL1ß, IL1R, IL1R α, IL4R α, IL12, ү IFN, TGFß.
Primerii pentru controlul intern se găsesc într-o concentrație mică pentru a favoriza
reacția de amplificare a alelelor specifice. Absența benzilor de control și lipsa amplificării
specifice indică reacții eșuate. Primerii nefolosiți vor forma o bandă difuză de până la 50 bp.
Reacțiile fals negative pot fi determinate de o amplificare ineficientă, calitatea slabă a
ADN-ului, poziționarea incorectă a plăcuței în termocycler, variațiile de temperatură din
godeurile termocycler-ului sau calibrarea necorespunzătoare a acestuia. Rareori pot apărea reacții
fals negative când banda de control este prezentă.
la altul. Dimensiunea ampliconilor specifici este precizată în Worksheet-ul care însoțește kit-ul
de amplificare și este apreciată prin comparație cu marker-ul de greutate moleculară. Pentru
confirmarea dimensiunii corecte a ampliconilor se compară greutățile moleculare ale acestora cu
cele listate în Worksheet. Benzile fals pozitive se exclud pe baza greutății moleculare. Analiza
pattern-ului de reacție și generarea genotipului se face urmărind Worksheet-ul din kit.
12. ELECTROFOREZA ÎN GEL DE AGAROZĂ ȘI FOTOGRAFIEREA

GELULUI
SCOP
Prezenta procedură/metodă are ca scop descrierea modului în care se verifică, cu ajutorul
electroforezei în gel de agaroză, prezența ADN-ului într-o probă, fie că este vorba de ADN
rezultat în urma procedurilor de extracție, fie ampliconi specifici rezultati în urma amplificării
genice efectuate în cadrul metodelor SSOP, SSP sau SBT.
În urma utilizării metodelor de biologie moleculară, SSOP (sequence specific
oligonucleotides probes) și SSP (sequence specific primers), vor rezulta produși de amplificare
ce vor putea fi vizualizați prin electroforeză în gel de agaroză.
Prepararea gelului de agaroză

46
● tampon TBE (Triș-Borat-EDTA) 5x
● pulbere de agaroză; apă distilată
● balon Erlenmayer; agitator magnetic
● cilindru gradat; balon (recipient) cu volum de minim 1 litru
● plită electrică cu agitare magnetică
● cântar electronic care să permită cântărire la nivel de miligrame
● cuva pentru turnarea gelului
● pipetă 1-10μl și vârfurile aferente
● bromură de etidium
Mod de lucru
● Într-un recipient de minim 1 litru, se pun 900 ml apă distilată peste care se adaugă 100 ml
TBE 5x și se obține astfel TBE 0,5x. Se lasă 10 min la 4 0C și apoi se păstrează la temperatura
camerei.
● Se cântăresc 1,5-2 g pulbere de agaroză. Într-un vas Erlenmayer de 300 ml, se pune un
agitator magnetic, 80 ml soluție TBE 0,5X peste care se adaugă 1.5-2 g agaroză.
● Se acoperă vasul cu un capac de hârtie perforată și se fierbe pe plită electrică cu agitare
magnetică până când soluția devine limpede (cca 12 min).
● Se lasă să se răcească puțin (până la 500C) sau atât cât să poată fi atinsă cu mâna.
● În acest timp, în cuva de turnare se pun lamelele de plastic care delimitează forma
gelului. Înainte de a turna gelul, se adaugă 4 μl de bromură de etidium și se amestecă ușor.
● Se toarnă gelul în cuvă cu grijă astfel încât să nu se formeze bule și agitatorul magnetic să
nu cadă, iar deasupra se pune capacul cu piepteni.
● Se lasă să se gelifice cca 30-40 min. Se introduc cca 50 ml TBE 0,5x prin fantele
capacului și se scoate capacul astfel încât godeurile formate să nu se rupă.
● Dacă nu se utilizează imediat, gelul se poate păstra 4-5 zile într-un recipient, scufundat în
soluție TBE 0,5x
Verificarea ADN-ului extras sau a produșilor de amplificare pentru metodele SSOP, SBT
După amplificare verificarea prezenței produșilor de amplificare în fiecare tubuşor se face
prin electroforeză în gel de agaroză 1,5 – 2 %. Gelul se pune în cuva de migrare și peste el se
toarnă soluție TBE 0,5x astfel încât să-l acopere;
1. În primul godeu se pune markerul de greutate moleculară
2. În funcție de procedura specifică fiecăreii metode în parte se procedează în felul următor:
-pentru metoda SSOP/ADN extras: pe o folie de plastic sau aluminiu se pun câte 0.6 μl
colorant acridin orange/orange G și 2,5 μl din produsul de amplificare din tubușor. Se mixează
bine cu ajutorul pipetei și se transferă apoi în godeul din gel. Se procedează în acest fel pentru
fiecare tubușor.
- pentru SBT se aleg cantitățile în funcție de procedura specifică, se mixează bine cu
ajutorul pipetei și se transferă apoi în godeul din gel. Se procedează în acest fel pentru fiecare
tubușor.
4. Se pune capacul peste cuva de migrare, se conectează bornele și se pornește sursă de
curent, 12 min la 125V.
5. La sfârșitul migrării, se oprește sursa și se scot bornele . Se scoate capacul de pe cuva de
migrare, se scoate gelul și se așează pe suportul lămpii de UV. Se aprinde lampa și se
vizualizează migrarea.
ATENȚIE: Este interzis să se citească la lampa de UV fără a se pune capacul protector
fără a se folosi ochelarii de protecție UV.
47
5. Se urmărește prezența ampliconilor specifici, în fiecare godeu.
Probele care nu prezintă toate benzile de migrare specifice NU vor fi utilizate mai
departe pentru reacția de hibridizare.
6. Gelul este fotografiat și imaginea este salvată în calculator în folderul POZE GEL ELFO
Fotografierea gelului
Sistemul de înregistrare electroforeză este format din :
● Aparat fotografiat electronic
● Doc-Print VX 5-pentru înregistrare poze pe memory-stick
 Se pornește aparatul de înregistrare (butonul din fața aparatului). Se așteaptă aproximativ
1 minut pentru inițializarea software-ului.
 Se ridică capacul de protecție al Transluminatorului UV.
 Se așează gelul de fotografiat pe Transluminator.
 Se așează deasupra aparatul de fotografiat.
 Se aprinde Transluminatorul (ultimul buton lateral stânga). Lungimea de undă a UV să
fie setată pe 312 nm.
 La aparatul de înregistrare: se apasă pe butonul corespunzător pentru “Live” (pentru
vizualizarea gelului).
 Se încadrează gelul pentru o vizualizare bună și se alege luminozitatea dorită cu ajutorul
butonului corespunzător pentru ”+”de pe aparatul de înregistrat.
 Se apasă butonul corespunzător pentru “FREEZE”; imaginea gelului rămâne fixată pe
ecran.
 Se introduce memory- stick-ul în aparatul de înregistrat (în față). Se așteaptă până când în
colțul din dreapta-sus al ecranului apare imaginea unui stick și cuvântul “READY”.
 Se apasă butonul corespunzător pentru “SAVE”- pe ecran apare data și ora la care se
înregistrează pe stick imaginea gelului.
 Când înregistrarea este terminată, pe ecran rămâne imaginea.
 Se apasă butonul pentru “Back”.
 Se stinge lampa de UV → se înlătură aparatul de fotografiat și gelul.
 Dacă, în continuare, se dorește fotografierea unui alt gel, se apasă din nou butonul
“Live”, se pune pe transiluminator noul gel și se parcurg aceeași pași de înregistrare a imaginii.
 La sfârșit se scoate stick-ul, se apasă butonul din față pentru a opri aparatul de înregistrat.
 Imaginile salvate pe stick se vor regăsi într-un fișier creat automat, numit Images
Notă: dacă se fac mai multe poze succesiv, pe o foaie de hârtie se va nota, pentru fiecare
gel, codul probei și locusul HLA căreia îi aparține gelul, data și ora corespunzătoare cu care se
salvează pe memory-stick.
 Imaginile de pe memory-stick sun transferate apoi pe calculatorul HLA-1, în fișierul
POZE GEL ELFO, fiecare în funcție de metoda/reactivii/sursa probelor.
 Fiecare imagine este redenumită cu codul probei-locusul testat±rezoluția-dată testării
(Ex: 9962-Ahr-14.09.2015)
Verificarea produșilor de amplificare pentru metoda SSP

electroforeză în gel de agaroză 1,5-2% (preparat conform pct. 5.1.2.).
o Gelul se pune în cuva de migrare și peste el se toarnă soluție TBE 0,5x astfel încât să-l
acopere;
o Din fiecare godeu al plăcuței se pun câte 4,5 µl în godeurile gelului, în ordinea indicată în
procedura specifică. În godeurile de pe mijlocul gelului se pune marker-ul de greutate
moleculară.
48
o Se pune capacul peste cuva de migrare, se conectează bornele și se pornește sursa de
curent, 12 min la 125V.
o La sfârșitul migrării, se oprește sursa și se scot bornele.
o Se scoate capacul de pe cuva de migrare, se scoate gelul și se așează pe suportul lămpii
de UV; se aprinde lampa și se vizualizează migrarea.
ATENȚIE: Este interzis să se citească la lampa de UV fără a se pune capacul protector sau
fără a se folosi ochelarii de protecție UV.
Se urmărește prezența ampliconilor specifici în fiecare godeu.
godeuri cu amplificare eșuată, în afara godeului de control negativ. În caz contrar se repetă
amplificarea.
o Gelul este fotografiat și imaginea este salvată în calculator în folderul POZE GEL ELFO.
Asigurarea calității rezultatelor

Pentru metoda SSOP:
- marker de greutate moleculară
- generarea de produși de amplificare specifici
Pentru metoda SSP:
- marker de greutate moleculară
- control intern al amplificării
- godeu de control negativ
13. EXTRACȚIE DE ARN TOTAL DIN ȚESUT CU ACID-PHENOL:

CHLOROPHORM (INVITROGEN-mirVana miRNA Isolation Kit)
Principiul metodei
Prima etapă a procedurii kit-ului mirVana miRNA Isolation Kit constă în introducerea
probei într-o soluție de liză de denaturare care stabilizează ARN-ul și inactivează RN-aza. În
următoarea etapă probele sunt supuse extracției cu Acid-Phenol:Chloroform care îndepărtează
majoritatea componentelor celulare rămânând o probă de ARN semi-pură. Purificarea ARN-ului
se face folosind un filtru cu fibră de sticlă și soluții special create pentru reținerea ARN-ului și
pentru evitarea pierderilor speciilor mici de ARN.
● miRNA Wash Solution 1
● Wash solution 2/3
● Tuburi de colectare
● Filtre
● Lysis/Binding Buffer
49
● miRNA Homogenate Additive
● Acid-Phenol:Chloroform
● Elution solution

● Mănuși de unică folosință fără talc
● Etanol absolut
● Tuburi de microcentrifugă de 1,5 – 2 ml
● Pipete cu volum ajustabil cu vârfuri de pipetă aferente
● Microcentrifugă
● Vortex
● Termobloc care să permită încălzirea la 95oC
● Balanță
● Foarfeci
● Pense
● Gheață
Metoda de lucru
Dacă un kit este la prima utilizare soluțiile de spălare se prepară astfel:
●În soluția Wash solution 1 se adaugă 21 ml etanol 100%.
●În soluția Wash Solution 2/3 se adaugă 40 ml etanol 100% (dacă în flacon apare
un precipitat nu se îndepărtează).
După reconstituire, soluțiile de spălare se păstrează la frigider.
Înainte de a începe extracția:
●Se pornește termoblocul (950C) și se pune la încălzit soluția de eluare.
●Se verifică dacă soluțiile Wash solution 1 și Wash Solution 2/3 au fost preparate
cu etanol
●Se pregătesc gheața și instrumentele ce urmează a fi folosite.
Extracția propriu-zisă
Odată scos de la -80°C țesutul trebuie procesat imediat, fără decongelare parțială.
a. Pentru fiecare probă se pregătește câte un tub de microcentrifugă de 1,5-2 ml care
se așează pe gheață și pe care se notează numărul de identificare al probei.
b. Din proba de țesut se taie un fragment a cărui greutate se măsoară și se pune în
tubul de microcentrifugă.
c. Peste probă se adaugă 10 volume de Lysis/Binding Buffer per masă tisulară (1
mL Lysis/Binding buffer la 0.1 g țesut), se mărunțește foarte bine țesutul și se amestecă rapid
până când devine omogen.
50
d. La țesutul lizat se adaugă un volum de 1/10 de miRNA Homogenate Additive și
se omogenizează bine prin vortexare sau prin inversarea tubului de câteva ori. De exemplu, dacă
volumul lizatului este de 300 µl, se adaugă 30 µl miRNA Homogenate Additive.
e. Se lasă amestecul pe gheață timp de 10 minute.
f. Se adaugă un volum de Acid-Phenol: Chloroform egal cu volumul lizatului
înainte de adăugarea miRNA Homogenate Additive. De exemplu, dacă volumul inițial a fost 300
µl , se adaugă 300 µl Acid-Phenol: Chloroform.
g. Se vortexează amestecul timp de 30-60 de secunde.
h. Se centrifughează 5 minute la 12.500 RPM, la temperatura camerei pentru a
separa faza apoasă de cea organică. După centrifugare interfaza trebuie să fie compactă; dacă
aceasta nu este se repetă centrifugarea.
i. Se transferă cu grijă faza apoasă (de deasupra) fără a distruge faza inferioară, și se
transferă într-un tub nou. Se măsoară și se notează volumul transferat.
j. La faza apoasă recuperată se adaugă 1.25 volume etanol 100% și se vortexează
ușor. (Exemplu: se adaugă 375 µl etanol100% la 300 µl fază apoasă).
k. Amestecul lizat-etanol (din etapa anterioară) se transferă în filtru (Filter
Cartridge). Se pot pune în filtru până la 700 µl. La probele pentru care avem un volum mai mare
decât acesta se aplică succesiv amestecul în același filtru.
l. Se centrifughează 20 secunde la 10.000 RPM.
m. Conținutul tubului de colectare se aruncă și se pipetează în același filtru 700 µl
miRNA Wash Solution 1.
n. Se centrifughează 20 secunde la 10.000 RPM.
o. După centrifugare conținutul tubului de colectare se aruncă și se pipetează în
același filtru 500µl Wash Solution 2/3.
p. Se centrifughează 20 secunde la 10.000 RPM.
q. Se aruncă lichidul din tubul colector și se repetă spălarea cu încă 500 µl Wash
Solution 2/3.
r. Se aruncă lichidul rezultat din ultima spălare, se pune filtrul în același tub de
colectare și se centrifughează 1 minut la 10.000 RPM.
s. Se transferă filtrul într-un tub nou de colectare (din kit).
t. Se adaugă în centrul filtrului 100 µl Elution Solution preîncălzit la 95°C și se
închide capacul.
u. Se centrifughează aproximativ 20-30 secunde la 12.000 RPM pentru recuperarea
ARN-ului.
v. Se colectează eluatul și se stochează la -20°C sau mai puțin.
După extracție se măsoară concentrația și puritatea ARN total la fotometru. Raportul
A260/A280 trebuie să aibă valori cuprinse între 1,8 și 2,1.
51
14. REVERSTRANSCRIEREA ARN
SCOP
Prezenta procedură are ca scop documentarea modului în care se realizează
reverstranscrierea ARN-ului total cu ajutorul kit-ului TaqMan MicroRNA Reverse Transcription
de la Applied Biosystems.
Presupune sintetiza cADN monocatenar din probe totale ARN folosind kitul de
transcriere Reverse Transcription TaqMan® MicroRNA. Procesul implică următoarele
proceduri:
1. Pregătirea mixului master RT
2. Pregătiți placa de reacție RT
3. Realizarea transcrierii inverse
● 100mM dNTP
● MultiScribe Reverse Transcriptase, 50U/µl
● 10XReverse Transcription Buffer
● RNase Inhibitor, 20U/µl
● Apă nuclează free
Kitul se păstrează la congelator la -200C.
❖ pipete automate
❖ vârfuri
❖ tuburi de polipropilenă
❖ mănuși fără talc
❖ fotometru
❖ apă nuclease free
❖ termocycler; centrifugă pentru tuburi
❖ vortex
52
❖ hotă cu flux de aer laminar
Metoda de lucru
Probele de ARN
ARN-ul total de testat este obținut prin extracție manuală din țesut. Probele de ARN se
dezgheață pe gheață și se omogenizează ușor cu pipeta. Înainte de utilizare, se măsoară la
fotometru concentrația și puritatea ARN-ului total. Concentrația de ARN total utilizat pentru
reverstranscriere trebuie să fie între 1 și 10 ng/reacție iar puritatea trebuie să fie între 1.8-2.1.
Probele cu concentrații mai mari se diluează în apă (nuclease free water) pentru uzul imediat
până la concentrația stabilită și se țin pe gheață până la momentul utilizării.
Pregătirea reactivilor, a mastermix-ului și amplificarea

1. Înainte de utilizare, se dezgheață pe gheață primerii și componentele trusei TaqMan
MicroRNA Reverse Transcription Kit și se omogenizează prin vortexare ușoară fiecare flacon,
urmând apoi o scurtă centrifugare.
2. Într-un tub de microcentrifugă, pe gheață, se pregătește mastermix-ul RT, calculând
volumele listate mai jos, până la numărul dorit de reacții RT. Se adaugă 10-20% mai mult volum
pentru compensarea pierderilor care apar pe parcursul pipetării.
Component Volum master mix pe 15 µl reacţie

100 mM dNTPs (cu dTTP) 0.15 µL
MultiScribe Reverse Transcriptase, 50 U/µl 1.00 µL
10X Reverse Transcription Buffer 1.50 µL
RNase Inhibitor, 20 U/µL 0.19 µL
Nuclease- free Water 4.16 µL
Volum total 7.00 µL
Fiecare 15 µl pentru reacția RT conțin: 7 µl master mix, 3 µl primer RT 5X și 5 µl proba

ARN.
3. Se amestecă prin ușoară vortexare și se centrifughează pentru a aduce mix-ul la baza
tubului.
4. Într-un tub de polipropilenă (0.2 ml) pentru fiecare 15 µl reacție RT, se adaugă 7 µl
master mix RT, 3 µl primer RT (5X), și 5 µl probă ARN.
5. Conținutul fiecărui tub de reacție se omogenizează prin vortexare ușoară, se
centrifughează scurt și se pun în termocycler pentru amplificare la următorul program:

1 16°C 30 min
1 42°C 30 min
1 85°C 5 min
1 4°C ∞
53
Dacă după reacția de reverstranscriere nu se continuă imediat amplificarea PCR, ADN-ul
complementar se păstrează la -15 -25°C.
15. CUANTIFICAREA SPECIILOR DE MICROARN PRIN METODA

REAL-TIME PCR
SCOP
Prezenta procedură are ca scop documentarea modului în care se efectuează amplificarea
și detecția ADN-ului complementar microARN-urilor mature prin metoda qRT-PCR cu ajutorul
kit-ului TaqMan Universal Master Mix II și a primerilor specifici microARN-urilor țintite.
Principiul metodei
Tehnica q-RT-PCR determină numărul de copii a genei de interes în celulă prin
mecanismele de amplificare și detecție în timp real, înglobate într-o singură etapă. Principiul
tehnicii este bazat pe o reacție de polimerizare în lanț iar produsul final al amplificării este
detectat și cuantificat la sfârșitul fiecărei reacții.
Produsul utilizat în acest scop este ARN-ul total care este reverstranscris la ADN
complementar prin intermediul unei transcriptaze și al primerilor specifici. Pentru analiza
expresiei micoARN-urilor prin RT-PCR cantitativ se folosesc primeri și sonde TaqMan
proiectate de Applied Biosystems.
Componentele utilizate în reacție

● TaqMan Universal Master Mix II
● TaqMan MicroRNA Assay (20X)
Primerii TaqMan se păstrează la -20°C, feriți de lumină. Expunerea excesivă la
lumină poate afecta fluorescența probelor. Mixul TaqMan Universal Mater Mix II se păstrează la
2-8°C.
 pipete automate
 suport pentru plăcuțele de amplificare
 plăcuțe de amplificare cu 96 de godeuri -Well Reaction Plate
 pipete cu volum ajustabil cu vârfuri de pipetă aferente
 de amplificare pentru 96-Well Reaction Plate
 vârfuri
54
 mănuși fără talc
 apă nuclease free
 centrifugă pentru tuburi și pentru plăci de amplificare
 hotă cu flux de aer laminar
 Instrument Real Time-PCR
Manipularea și pregătirea reactivilor

Înainte de utilizare:
 Mixul TaqMan Universal Master Mix II se omogenizează foarte bine prin răsucirea
flaconului.
 Dezghețarea primerilor TaqMan și a probelor se face pe gheață. După dezghețare
se vortexează ușor, apoi se centrifughează scurt
Pentru prepararea mixului de reacție PCR:
a. Se determină numărul total de reacții PCR de executat. Fiecare plăcuță de reacție
include:
● Un test de expresie genică pentru fiecare probă de ADNc
● Control endogen
● NTC (No template controls)
b. În funcție de numărul reacțiilor, se calculează volumul necesar pentru fiecare
componentă a reacției. Se va include un volum suplimentar pentru a compensa volumul pierdut
care apare în timpul pipetării.
c. Prepararea mastermix-ului se face într-un tub de microcentrifugă adăugându-se
următoarele componente:
d.
Componenta Volum µL pentru 1 reacție
Plăcuța cu 96 godeuri
TaqMan Fast Advanced Master Mix (2X) 10.00
Nuclease-free Water 7.67
TaqMan MicroRna Assay (20X) 1.00
Volumul total µL
d. Conținutul tubului se omogenizează prin votexare ușoară, apoi se centrifughează

scurt.
e. Într-o plăcuță de reacție cu 96 de godeuri, se pipetează câte 18.67 µl mastermix
preparat anterior în fiecare godeu în funcție de numărul de probe pe care dorim să le testăm,
peste care se adaugă câte 1.33 µl probă (ADNc obținut în urmă reverstranscrierii).
Notă: Pentru optimizarea protocolului se pot face diluții ale ADN-ului complementar.
f. Se acoperă plăcuța cu o folie optică adezivă, se vortexează și centrifughează scurt
pentru întregirea componentelor și eliminarea bulelor.
g. Se încarcă plăcuța în Real-Time PCR.
55
Configurarea experimentului
La crearea programului de amplificare în sistemul Real-Time PCR Applied Biosystems
se urmăresc următorii parametrii:
● Cicluri de amplificare și temperaturi:

1 50°C 2 min
1 95°C 10 min
95°C 15 sec
40
60°C 1 min
● Run Mode: Standard

● Volumul probei: 20 µl
În softul sistemului RT-PCR se deschide documentul corespunzător plăcuței pe care am
creat-o, se introduce plăcuța în instrument și se pornește run-ul prin apăsarea butonului Start.
16. MODELUL DE CALCUL PENTRU CUANTIFICAREA RELATIVĂ A

MODIFICĂRILOR EXPRESIEI GENICE
Cuantificarea relativă a modificărilor expresiei genice este una dintre cele mai folosite
metode de analiză a datelor obținute în urma experimentelor de PCR cantitativ. Aceasta permite
estimarea unor niveluri relative de expresie pentru anumite gene studiate, raportând
performanțele de amplificare individuale la cele ale unui control endogen.
Metoda de calcul a eficienței amplificării se bazează pe valorile Ct (Cycle threshold)
determinate în faza exponențială timpurie a curbei de amplificare, în reacția PCR.
Metodă comparativă 2-ΔΔCt este un model matematic ce calculează modificările expresiei
genice ca o diferența relativă între Ct-ul probei experimentale/de referinţă și Ct-ul controlului
endogen. Compararea nivelului relativ de expresie al microARN-urilor analizate se va face prin
interpretarea valorilor obținute prin calculul 2-ΔΔCt.
Formule de calcul:
- ΔCt proba experimentală (țesut tumoral) = Ct microARN –Ct control endogen
- ΔCt proba de referință (țesut normal) = Ct microARN –Ct control endogen
-ΔΔCt = ΔCt proba experimentală–ΔCt proba de referință
56

LP-Romana-Imunologia Transplantului

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

LP-Romana-Imunologia Transplantului

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

[TITLU DOCUMENT]

În laboratorul clinic determinarea markerilor imunologici se realizează prin metode

-teste imunochimice cu detecție prin fluorescență (FIA): utilizează marcarea cu molecule

Investigaţiile imunologice în cazul reacţiei de hipersensibilitate de tip I urmăresc punerea

Dozarea imunoglobulinelor E totale

Diagnosticul reacţiei de hipersensibilitate de tip II

Reacţia de hipersensibilitate de tip III

Diagnosticul reacţiei de hipersensibilitate întârziată (de tip IV)

● Vortex (pentru o bună omogenizare a amestecului)

● Baie de apă care să permită încălzirea la 56oC

4. EXTRACŢIE DE ADN AUTOMATĂ CU BILE MAGNETICE

 Mănuși de unică folosință fără talc

(NANOFOTOMETRUL IMPLEN P300)

Modul de utilizare al nanofotometrului IMPLEN P300

● Transluminator – lampa UV pentru electroforeză

Prepararea mixturii de amplificare

Number of cycles Temperature Time

Analiza pattern-ului de reacție și generarea genotipului se face automat cu ajutorul soft-

7. GENOTIPAREA HLA SSP PRIN METODA SSP –REZOLUȚIE ÎNALTĂ

Prepararea mixturii de amplificare

Număr Buffer PCR Taq(μl) Apă(μl) Volum

Nota1: Taq polimeraza se păstrează la congelator, se scoate numai în momentul utilizării

Etape Temperatura (°C) Timp (secunde) Actiune

5 cicluri 96 25 Denaturare, Aliniere, Extensie

21 cicluri 96 25 Denaturare, Aliniere, Extensie

4 cicluri 96 25 Denaturare, Aliniere, Extensie

Hold 4 Timp specificat -

Electroforeză în gel de agaroză

Bandă de control intern Bandă de amplificare specifică Reactivitate

Analiza pattern-ului de reacție și generarea genotipului se face automat cu ajutorul soft-

8. GENOTIPAREA HLA SBT – METODA SANGER (SECORE

Echipamente și consumabile necesare

Amplificarea locus specifică

Electroforeza în gel de agaroză

Purificarea ampliconilor cu ExoSAP-IT

Cicluri Temperatura Timp

Ampliconii tratați cu ExoSAP-IT pot fi stocați la -20°C maxim 1 săptămână.

Pregătirea reacției de amplificare pentru secvențiere

După amplificare, trebuie continuat cu etapa de precipitare cu etanol în maxim 24

Pregătirea plăcuței pentru electroforeză capilară

Interpretarea ambiguității alelice

9. GENOTIPARE HLA SSO-LUMINEX CU KIT-URI LABTYPE (ONE

LABType® aplică tehnologia Luminex la metoda de tipizare HLA prin reverse-SSO.

● Locus –Specific Primer Set

● Bead Mixture: conține un set de microsfere marcate fluorescent tapetate cu sonde

Fiecare mixtură include microsfere de control pozitiv și negativ pentru substracţia

Echipamente și consumabile necesare

● pipete automate : 1-10 μl, 10-100 μl, 100-1000 μl

● suport pentru plăcuțele de amplificare

● plăcuțe sau tubuşoare de 200 µl pentru amplificare

● vârfuri cu barieră 1-10μl, 10-100μl, 100-1000μl

● cooler sau baie de gheață

● mănuși fără talc

● Taq polimeraza (One Lambda)

● marker de greutate moleculară pentru ADN

● hotă cu flux de aer laminar

● transluminator – lampa UV pentru electroforeză

● sistem de fotografiere a benzilor electroforetice

● program PC-uType pentru analiză datelor

Amplificarea locus specifică

96 1491 432 21.6 (22)

Cicluri Temperature Timp

Electroforeza în gel de agaroză