Curs 13

Caracteristicile structurale ale ARN

Transcrierea (Biosinteza ARN)

 Caracteristicile structurale ale ARN

Sunt produi de policondensare a

ribonucleozidtrisfosfailor

Structura primar:
H3PO4

-b-riboz

Baze azotate: A,G,U,C

 O

N
NH
O
5`
G 5` GCA 3`
O
-
P O N N NH 2
O
-
O
3`
NH 2
X
N
O C
N O
O P O CH 2
O
-
O
3`
NH 2
X
N
NH
O A

O P O CH 2 N N
O
-
O
3`

3` OH X
 Structura secundar
ARN este monocatenar cu poriuni bicatenare

Bucl cu baze
nemperechiate

Segment cu baze
complementare

Coninutul n A al ARN este diferit de cel n U i cel

de G diferit de cel n C
 Rolurile diferitelor tipuri de ARN
 ARNr -caracteristici structurale

conine zone dublu catenare i monocatenare

-este heterogen ca form i mrime.
-la procariote, ARNr : 23S, 16S i 5S
la eucariote, ARNr : 28S, 18S, 5,8S i 5S
ARNr

-este tipul de ARN cel mai stabil metabolic

-reprezint ~80% din ARN celular total.

 Ribozomii
ARNr = componenta catalitic a ribozomilor

Ribozomii = complexe ribonucleoproteice

ARNr + proteine

-proteinele:

au roluri catalitice sau

sunt implicate n recunoaterea i legarea ARNm

i aminoacil~ARNt la ribozomi
 Rolul ribozomilor

Ribozomii constituie sediul biosintezei

proteinelor

Ribozomii permit conlucrarea ARNm, ARNt i

ARNr, n vederea sintezei proteinelor.

 Conin trei situsuri:
-situsul aminoacid, care leag ARNt purttor al unui
aminoacid;
-situsul peptid, care leag ARNt purttor al unui lan
polipeptidic;
-situsul de eliminare de pe care este eliberat ARNt
liber.

Ribozom 70 S
 ARNt

E. Coli conine ~75 tipuri de ARNt

Reprezint ~ 15% din masa ARN celular total

 Structura ARNt (solubil sau adaptor)

conine ntre 75 i 90 ribonucleotide;

raportul A+G/U+C este apropiat de 1;

prezint o conformaie n foaie de trifoi

a) 3` b) 5`
Situs de CCA Brat TC 3`
legare aminoacid

5`

Perechi de baze
complementare Brat TC
Bratul DHU
Bratul
DHU

Bratul variabil
Bucla Bratul anticodon
anticodon

Anticodon
 ARNt are cel mai mare coninut de baze minore
baze azotate modificate structural prin:

-metilri

- tiolri

-hidrogenri

dup sinteza ARNt (POST-TRANSCRIERE)

 O O O
H3C
NH NH HN NH

N O N O O
HO H2 C HO H2 C HO H2 C
O O O

OH OH OH OH OH OH
Dihidrouridin Ribotimidin Pseudouridin
(DHU) (T)
S O
NH N
NH

N O N N
HO H2 C HO H2 C
O O

HO OH OH OH
4-Tiouridin Inozin
 Funciile ARNt

Leag aminoacizii specifici, activai, prezeni

n citosol, la restul adenilic din secvena CCA i

i transport, la ribozomi, sub forma

complexelor aminoacil~ARNt
 Adaptarea aa transportat n dreptul codonului de

pe ARNm prin

recunoaterea codon-anticodon,

pe baza complementaritii bazelor

 3` A ~ aa1 3` A ~ aa2
C C
C C
5` 5`

Anticodon 3` C C G 5` Anticodon 3` A G U 5`
GGC UCA
ARNm
5` Codon 1 Codon 2 3`
 ARNm

Structur

-este monocatenar, liniar, de lungime variabil;

-este sintetizat prin transcrierea catenei matri

sau template (necodificatoare).

-ARNm conine informaia n limbaj nucleotidic.
ADN 5` - G C A T T A T G C - 3`
3` - C G T A A T A C G - 5`

ARN 5` G C A U U A U G C 3`

-informaia depozitat n ARNm

sub forma tripletelor de nucleotide numite codoni

este decodificat la nivelul ribozomilor.
 ARNm procariot

este poligenic sau policistronic;

ntre gena transcris,

ARNm i

protein exist

o relaie de colinearitate
 ARNm eucariot
este monogenic;
nu este relaie de colinearitate:
gen-ARNm-polipeptid

gena pentru sinteza ARNm cuprinde:

exoni (expressed regions) i

introni (intervening sequences);

 ARNm matur care trec n citoplasm este
prelucrat prin excizia intronilor;

ARNm eucariot are o via de ordinul orelor

ARNm bacterian are o via foarte scurt (2-3

minute)
ARN nuclear de mici dimensiuni
(small nuclear RNA)

Este bogat n uridin

(U1, U2, U4, U5, U6).

se afl n nucleu, citosol i mitocondrie

 prin asociere cu proteine,
genereaz ribonucleoproteine

(small nuclear ribonucleoproteins)

sau snRNP ( denumite snurps)

cu rol n:

-excizia intronilor din ARNm transcript primar;

-controlul traducerii.
 TRANSCRIERE

Biosinteza ARN pe matri ADN

Transcrierea

are loc de cte ori este nevoie

n viaa unei celule

nu angajaz tot cromozomul

 Transcrierea este asimetric

catena ARN se construiete numai pe una dintre catenele

ADN dublu catenar nuclear

desemnat drept caten template

matri sau

necodificatoare
 Catena netranscris (codificatoare) a ADN
este identic cu ARN nou sintetizat, cu
excepia nlocuirii timinei cu uracilul
 Catenele ADN vor fi catene template
(necodificatoare) pentru unele gene i catene
codificatoare pentru alte gene.
Catenele template se citesc, invariabil, n
direcia 3` 5`.
Elemente necesare transcrierii:

ADN dublu helicoidal.

Substrate: ATP, GTP, CTP, UTP
 Enzime
ARN polimeraze ADN dependente
-au activitate polimerazic
-necesit caten matri
-pot iniia sinteza catenelor poliribonucleotidice
-conin Zn i necesit Mg2+
-nu au activitate de corector
-sintetizeaz ARN n direcia 5` 3`, antiparalel
catenei ADN folosit ca matri
 Direcia de sintez

Direcia de cretere a lanurilor ribonucleotidice

rmne obligatoriu 5` 3`.

Reacia global catalizat de ARN polimeraz
este:
 O

N
NH
O
5`
G 5` GCA 3`
O
-
P O N N NH 2
O
-
O
3`
NH 2
X
N
O C
N O
O P O CH 2
O
-
O
3`
NH 2
X
N
NH
O A

O P O CH 2 N N
O
-
O
3`

3` OH X
 Procariotele
Au o singur ARN polimeraz.

Holoenzima, este un pentamer bbs constituit

din:

enzima miez bb important n elongare;

subunitatea adiional s, proprie iniierii transcrierii.

In absena subunitii s, ARN polimeraza, se leag

nespecific la ADN.
 Eucariotele
ARN polimeraza mitocondrial

ARN polimerazele nucleare,

(cu sensibilitate diferit la -amanitin -octapeptid biciclic,
toxic, existent n ciupercile otrvitoare):

ARN p I, aflat n nucleoli, sintetizeaz ARNr 45S,

insensibil la -amanitin;

ARN p II, aflat n nucleoplasm, sintetizeaz ARNm, i

ARN nuclear de dimensiuni mici
foarte sensibil la -amanitin;

ARN p III, aflat n nucleoplasm, sintetizeaz, ARNt, ARNr

5S i ARN nuclear de dimensiuni mici
sensibil la concentraii mari de -amanitin
 Unde ncepe transcrierea genei ?
 Secvenele promotor (P)

secvene specifice de nucleotide, din molecula

ADN, responsabile de iniierea transcrierii

 punctul de start al transcrierii, este notat cu +1.

Secvenele nucleotidice situate n amonte

(upstream), fa de punctul de start al transcrierii,

se noteaz cu (-)

Secvenele situate n aval (downstream) fa de +1

sunt notate cu (+)

Promotorii procariotelor sunt situai n amonte fa de
+1 i sunt notai cu minus

Promotorii, pentru cele mai multe gene bacteriene,

au dou secvene consens situate pe catena
codificatoare: caseta 10 (Pribnow) i caseta 35
 La eucariote, fiecare ARN polimeraz,
utilizeaz promotori diferii

ARNp I utilizeaz promotori identici,

ARNp II utilizeaz o diversitate de
promotori, cu secvene consens:
caseta TATA, asemntoare casetei Pribnow,
este responsabil de acurateea iniierii
transcrierii;
casetele CAAT i GC sunt responsabile de
frecvena transcrierii.
 Iniierea transcrierii
Factorii de iniiere

A.La procariote
subunitatea s a holoenzimei orienteaz legarea
specific a ARNp la ADN

Bacteriile prezint mai multe tipuri de factori s

 Etapele iniierii transcrierii :

formarea complexului nchis de iniiere

prin legarea ARNp la promotorul specific,
n regiunea 35 recunoscut de factorul s;

ARN polimeraza holoenzima

Catena matrit

Promotor
 formarea complexului deschis de
iniiere
prin denaturarea ADN dublu catenar pe o poriune de
~10 perechi de baze pn la punctul de start al
transcrierii
ARN polimeraza holoenzima
Formarea primei legturi fosfat diesterice

ARNp, aflat cu situsul catalitic n dreptul

semnalului de iniiere a transcrierii,
leag nucleotidul +1, aproape invariabil unul
purinic cu nucleotidul +2;
disocierea subunitii s din complexul ARN

polimerazADN-ARN dup legarea primelor

10 nucleotide i

asocierea ei cu alt molecul de ARN polimeraz-miez.

 La eucariote

B.Acurateea iniierii transcrierii este realizat de:

-elementele de activare n cis a genelor

(secvene de ADN situate pe acelai cromozom cu gena de reglat)

promotori

enhanceri

silenceri

responsive elements care mediaz rspunsul la diferite semnale

printre care hormonii hidrofobi
-elementele de activare n trans :
factorii de iniiere a transcrierii = proteine specifice

La procariote factorul s

La eucariote fiecare polimeraz are setul su unic de factori de iniiere a

transcrierii (cel puin 6 factori de transcriere acioneaz echivelent
cu factorul s de la procariote)

Celulele eucariote au o capacitate de exprimare selectiv a genelor

Viteza de sintez a unei proteine n dou celule din acelai organism

poate diferi de 109 ori
 Elongarea lanului polinucleotidic
bucla de transcriere care cuprinde 12-17 perechi de
baze ADN-ARN
Catena ADN codificatoare
Punctul de renaturare Punctul de denaturare

Directia de avansare a enzimei

Catena matrit

Hibrid ARN-ADN
 La procariote,
rifampin se leag de ARN polimeraz i i schimb
conformaia mpiedicnd iniierea sintezei ARN

La eucariote
rifampinul nu se leag de ARN polimeraz i nu este
afectat sinteza ARN
 Terminarea transcrierii
La procariote
a.Terminarea transcrierii independent de factorul
proteic rho
Catena matri ADN conine semnale stop.
Structurile n ac de pr a ARN format, favorizeaz
terminarea transcrierii.
 Terminarea transcrierii rho dependent
Factorul rho cu activitate ATP-azic se leag la o
secven specific de ARN monocatenar. ARN este
desprins de catena matri i de enzim

ppp 5` ARN polimeraza

Proteina rho

ATP + HOH ADP + Pi

 Inhibitorii transcrierii

a.Antibioticul actinomicin D, ca i colorantul acridin, prin intercalarea

ntre perechile de baze distorsioneaz molecula ADN mpiedicnd att
transcrierea ct i replicarea.

b.-amanitina (octapeptid biciclic, toxic, existent n ciupercile

otrvitoare) este un inhibitor al ARN polimerazelor din celulele animale.

c.Antibioticele din familia rifamicin, inhib specific iniierea

transcrierii la bacterii. Odat iniiat transcrierea, rifamicina nu are rol
inhibitor asupra procesului de elongare.

Rifampin, inhib iniierea transcrierii, la procariote, prin legarea la

subunitatea b a ARN polimerazei-holoenzim. Deoarece nu inhib ARN
polimerazele eucariotelor, antibioticul rifampin este folosit n tratarea
tuberculozei i a altor infecii bacteriene.
Transcriptul primar ARNm procariot este mai
lung dect gena de transcris.
 Inhibitorii transcrierii

a.Antibioticul actinomicin D, ca i colorantul acridin, prin intercalarea

ntre perechile de baze distorsioneaz molecula ADN mpiedicnd att
transcrierea ct i replicarea.

b.-amanitina (octapeptid biciclic, toxic, existent n ciupercile

otrvitoare) este un inhibitor al ARN polimerazelor din celulele animale.

c.Antibioticele din familia rifamicin, inhib specific iniierea

transcrierii la bacterii. Odat iniiat transcrierea, rifamicina nu are rol
inhibitor asupra procesului de elongare.

Rifampin, inhib iniierea transcrierii, la procariote, prin legarea la

subunitatea b a ARN polimerazei-holoenzim. Deoarece nu inhib ARN
polimerazele eucariotelor, antibioticul rifampin este folosit n tratarea
tuberculozei i a altor infecii bacteriene.
 Modificarea transcriptelor
primare ARN

eliminarea exo- i endonucleazic a unor

fragmente polinucleotidice;

adugarea unor fragmente

polinucleotidice la capetele 3` i 5`;

modificri covalente la nivelul unor resturi

nucleotidice.
 La eucariote:
eliminarea unor fragmente polinucleotidice din
transcriptele primare ARN.

Transcriptele primare ARN conin exoni i

introni

ARN-polimerazele transcriu ntreaga gen

 Intronii au dimensiuni cu mult mai mari
dect exonii
(de peste 100 de ori)

NUMAI 5-10% din genomul eucariot

reprezint secvene codificatoare
pentru proteine i ARN.

Prezena intronilor i exonilor la eucariote este

tipic:
ARNm
ARNt
ARNr
 Dualitatea funcional a moleculei de ARN

Ribozimii = ARN cu rol catalitic i

informaional
Substratele ribozimilor sunt molecule de
ARN
Exist dou tipuri de ribozimi:
Ribozimi care realizeaz activiti autocatalitice
Ex. introni care i catalizeaz propria excludere (self-
splicing)
Ribozimi care catalizeaz transformarea unor
molecule din care acetia nu fac parte
Ex. ribonucleaza P care are ca substrat ARNt.
 Excizia intronilor
Excizia intronilor se realizeaz n nucleu, pentru toate
tipurile de ARN

Enzime specifice:

trebuie s recunoasc jonciunile intron-exon i

s catalizeze excizia intronilor i legarea exonilor.

In general, intronii au la capete secvenele:

5` GU ------------ AG 3`
 Mutaii la nivelul jonciunilor intron-exon pot
genera un ARN inactiv
care conine un intron rezidual
Un defect de excludere a intronilor, ar putea duce la o
sintez sczut a lanurilor de b-globin, fapt constatat n
unele b-thalasemii.
 Excizia intronilor din ARNr se realizeaz
autocatalitic
GTP sau guanozina desface legtura fosfat diesteric de
la unul din capetele intronului.

Captul 3` eliberat, al exonului I, efectueaz o

transesterificare la captul 5` al exonului II, realizndu-
se odat cu excluderea intronului, legarea celor doi
exoni (splicing)

Enzima numit ribozim cu activitate autocatalitic i

modific structura n timpul actului catalitic.
 Excizia intronilor din ARNm

este realizat de splicozom format din:

particule ribonucleoproteice (snurps)

(ARN de dimensiuni mici bogai n uracil
(U1, U2, U4, U5, U6) asociate cu proteine)

ARNm transcript primar, subiect al

prelucrrii.
 n splicozom aciunea catalitic este realizat

de ARN de dimensiuni mici.

 Splicozomul dimensiune mare mpiedic

ARNm precursor s prsesc nucleul nainte de

prelucrarea sa complet la ARNm-matur

 desfacerea legturii fosfat diesterice de la

unul dintre capetele intronului este realizat

de un nucleotid din cadrul intronului

 Excizia intronului din ARNt

ARNt eucariot conine introni, n regiunea

anticodon (succesiuni de nucleotide (20-40))

Excluderea acestor introni se face de un sistem

multienzimatic cu rol de endonucleaz i ligaz
 3` OH
OH 3`

Extensie 5`

5`

Prelucrri posttranscriere

Intron
ARNt matur
ARNt transcript primar
Modificri suplimentare exciziei intronilor
n transcriptele primare ARN

ARNm procariot se nate matur

 Modificri ale ARNm eucariot
la eucariote
ARNm devine funcional numai dup

excizia intronilor i

modificarea capetelor 5` i 3`:

adugarea unui rest de 7-metil guanozin la captul 5`

formarea cozii poliadenilice 3`

 Formarea captului 5`prin adugarea unui
rest de 7-metil guanozin la transcriptul
primar.

O CH3
+
N
HN
O O O
H2N N N 2` 3` CH2 O P O P O P Transcript primar
OH HO OH OH OH
O legtur 5` - 5` trifosfat
7-metil guanozin ntre 7-metil-guanozin si transcriptul primar
 Funciile captului 5`:

protejaz moleculele de aciunea 5` 3`

exonucleazelor;

favorizeaz traducerea, fiind recunoscut de

ctre ribozomi ca semnal de iniiere a sintezei
proteinelor.
 Modificarea captului 3` al ARNm prin

formarea unor cozi poliadenilice

de 200-300 nucleotide

Poliadenilarea se produce

dup formarea captului 5` dar

nainte de excizia intronului.

 Poliadenilarea ajut la stabilizarea moleculei
ARNm de aciunea exonucleazelor.

ARNm pentru histone i interferon nu sunt

poliadenilai.
 Modificri ale capetelor ARNt
transformarea transcriptul primar multimeric n
ARNt precursori monomerici
care prezint extensii scurte 3` i 5`

Ribonucleaza P
o endonucleaz format din:

ARN cu rol catalitic (ribozim) i

o protein cu caracter bazic)

elimin extensiile din captul 5`
 Formarea captului 3` matur al ARNt
La procariote
secvena CCA este relevat de o exonucleaz
La eucariote
secvena CCA este adugat ulterior de ctre o
nucleotidil-transferaz avnd ca
substrate ATP i CTP

Modificarea covalent a unor baze prin reacii catalizate

enzimatic: alchilare, tiolare, hidrogenare
 O O O
H3C
NH NH HN NH

N O N O O
HO H2 C HO H2 C HO H2 C
O O O

OH OH OH OH OH OH
Dihidrouridin Ribotimidin Pseudouridin
(DHU) (T)
S O
NH N
NH

N O N N
HO H2 C HO H2 C
O O

HO OH OH OH
4-Tiouridin Inozin
a) 3` b) 5`
Situs de CCA Brat TC 3`
legare aminoacid

5`

Perechi de baze
complementare Brat TC
Bratul DHU
Bratul
DHU

Bratul variabil
Bucla Bratul anticodon
anticodon

Anticodon
 Modificri ARNr

La eucariote
Din transcriptele primare 45 se formeaz
ARNr matur:
28 S
18 S i
5,8 S.

ARNr 5 S rezult dintr-o molecul precursoare

diferit
 Spatiatori

Transcrip
primar

Clivare

ARNr maturi

Procesarea ARNr eucariot

 La procariote, dup ndeprtarea ARNt obinut
prin transcrierea unor gene ARNt intruse, se
formeaz ARNr maturi: 23 S, 16 S, i 5 S prin
clivarea ARNr precursor 30 S.

Spatiatori

Transcript
primar

Clivare
Clivare

ARNr
maturi

Procesarea ARNr procariot