 Este un microscop special care măreşte

contrastul între diferitele structuri ale unui

preparat proaspăt sau nativ (celulele sunt vii,
nefixate şi necolorate
 Atunci când unda luminoasă traversează
structuri cu consistenţe diferite, aceasta este
supusă unui proces de defazare.
 Microscopul cu contrast de fază transformă
diferenţa de drum a razelor luminoase în
diferenţă de amplitudine, perceptibilă vederii.
Pentru examinarea în contrast de fază, unui
microscop obişnuit i se ataşează obiective
speciale cu inel de fază şi un diafragm inelar
 Acest microscop permite studiul celulelor în
stare vie, observându-se astfel viabilitatea
celulară (mişcările ciliare, flagelare, diviziunea
celulară, reacţii celulare la diferiţi stimuli fizici
şi chimici). Permite de asemenea studiul
culturilor de celule.
 Cu acest microscop se studiază fenomenul de
birefringenţă (dublă refracţie). Prezintă două
prisme speciale numite nicoli, confecţionate
dintr-un material numit spath de Islanda
 Cele două prisme poartă numele de polarizor şi
analizor.
 Birefringenţa se studiază în poziţie de nicoli
încrucişaţi, atunci când planurile celor doi
nicoli sunt perpendiculare
 Astfel, câmpul microscopului devine întunecat
iar dacă structurile studiate sunt birefringente
acestea apar intens strălucitoare.
 Acest microscop se utilizează pentru
examinarea
 structurilor cu aspect liniar (ex. fibrele de colagen,
fibrele de mielină, fibra musculară striată)
 structurilor cu simetrie radială (ex. granule proteice,
lipidice, colesterol)
 structurilor cu simetrie liniară (ex. membrane
biologice).
 Acest microscop studiază fenomenul de
fluorescenţă, fenomen luminos care ia naştere
în structuri biologice primare (naturale) sau
secundare (artificiale).
 Metoda se bazează pe proprietatea unor
substanţe care, iradiate cu un fascicol de
lumină cu o lungime de undă mică şi cu
frecvenţă înaltă, emit radiaţii cu o lungime de
undă mare şi o frecvenţă joasă – lumina
fluorescentă.
 Microscopul cu lumină fluorescentă este un
microscop special care are ca sursă de lumină o
lampă tubulară de cuarţ cu vapori de mercur
sub tensiune înaltă.
 Microscopul este dotat cu filtre speciale şi
anume
 filtrul de excitaţie situat în piciorul
microscopului, între oglindă şi condensor, cu
rolul de a opri toate radiaţiile în afara U.V.
 Filtrul de protecţie situat la nivelul ocularelor,
cu rol de a proteja retina.
 Fluorescenţa primară – naturală sau autofluorescenţa,
este produsă de substanţe care se găsesc în mod
natural în celule sau ţesuturi : dintele natural, clorofila
(roşu), anumite virusuri, bacilul Koch (verde
stralucitor), amine biogene
 fluorescenţa secundară – artificială, provocată, este
indusă prin tratarea ţesuturilor cu fluorocromi,
folosind metoda fluorocromării cu acridin-orange.
 Fluorocromii sunt substanţe chimice cu proprietatea de
a se fixa de anumite structuri din preparat şi de a emite
de la nivelul acestora lumina indusă.
 Cu ajutorul fluorocromilor se pot identifica acizii
nucleici (ARN - roşu, ADN - verde-galbui), fibre de
colagen elastice şi de reticulină (verde), nucleii
leucocitelor (verde), etc.
 Coloraţia cu acridin orange se mai utilizează în
citodiagnosticul precoce al cancerului (studiul
acizilor nucleici în condiţiile unui proces
tumoral)
 Cea mai importantă aplicaţie este
imunofluorescenţa care se bazează pe cuplarea
unui acid nucleic cu un fluorocrom; prin
fluorescenţa indusă poate fi identificată reacţia
antigen-anticorp, localizarea antigenelor în
celulă.
 Microscopul electronic permite studiul
detaliilor structurilor, datorită puterii de
rezoluţie ce depăşeşte cu mult puterea de
rezoluţie a microscoapelor fotonice
 Pentru obţinerea imaginii utilizează fasciculul
de electroni în locul fasciculului de lumină
 Microscoapele electronice moderne pot ajunge
la magnificări de aproximativ 1.000.000 x
 Din punct de vedere constructiv, microscopul
electronic are o structură mult mai complexă
decât microscopul optic. Totuşi, părţile
principale ale microscopului electronic
îndeplinesc aceleaşi funcţii ca şi lentilele
microscopului optic. Ele sunt magnetice sau
electrice, dupa cum devierea fasciculului de
electroni are loc într-un câmp magnetic sau
într-un câmp electric
 In cazul microscopului electronic, electronii pe
toată traiectoria lor, de la sursă până la
imaginea finală, se deplasează în vid
 Pentru ca imaginea electronică să fie vizibilă, este
necesar ca aceasta să fie transformată într-una
luminoasă. În acest scop, în planul imaginii finale
se afla un ecran fluorescent
 Principiul de funcţionare se bazează pe postulatul
fizicianului francez Louis Victor de Broglie (1924),
denumit şi “natura de undă a electronilor”
 De Broglie a stabilit că electronii au proprietăţi
ondulatorii, adică le este asociată o undă şi din
acest punct de vedere se aseamănă cu fotonii.
Această lungime de undă a electronului se
numeşte “lungimea de undă de Broglie” şi este
dată de formula: λ= h / mV
λ = lungimea de undă a electronului
h = constanta lui Plank (6,54 x 10-27 erg/s)
v = viteza electronului
m = masa electronului
 După 1970 microscopul electronic a atins apogeul
perfecţionării, respectiv rezoluţia limită care poate
să o furnizeze lungimea de undă a electronilor
 Cele mai perfecţionate microscoape electronice,
aflate în exploatare în diferite laboratoare, au
rezoluţii garantate de 2-3 Å (în condiţii speciale
atingând 1,2 Å) şi puterea maximă de mărime pe
placa fotografică de 800.000x
 Folosirea intensivă a microscopiei electronice în
biologie şi medicină a început abia după anul
1950, primele succese mai importante în studiul
celulelor fiind legate de numele lui George
Emil Palade (n.1912), citolog american de
origine română, unul din fondatorii biologiei
celulare, laureat al Premiului Nobel pentru
Fiziologie şi Medicină în 1974
 Clasificarea microscoapelor electronice se face în raport
de tipul de construcţie şi destinaţia lor. În biologie
celulară se folosesc de regulă următoarele două tipuri
de microscoape electronice (ME)
a) microscoape electronice de transmisie sau de tip
TEM (Transmission Electron Microscope), folosite
pentru investigarea structurilor şi ultrastructurilor
celulare. Imaginea electrono-optică se obţine în urma
traversării electronilor prin preparat, fiind o imagine
în plan
b) microscoape electronice de baleiaj (scanning) sau de
tip SEM (Scanning Electron Microscope) utilizate
pentru explorarea tridimensională a suprafeţelor
celulare sau a suprafeţelor organitelor citoplasmatice.
Imaginea electrono-optică este rezultatul reflectării
electronilor de pe suprafaţa preparatului pe ecranul
fluorescent
 Principalele elemente constructive ale
microscopului electronic de transmisie (TEM)
sunt următoarele :
A. Coloana microscopului - componentă
principală a ME
B. Dispozitivele anexe - sistemul electronic,
panoul de comandă şi sistemul de vid
 Coloana microscopului sau sistemul optic este
alcătuită din: sistemul de iluminare în care
intră tunul electronic şi lentilele condensor,
camera pentru preparat, sistemul pentru
formarea imaginii, camera de observaţie şi
camera fotografică

 Drumul fasciculului de electroni prin

microscopul electronic TEM: - fasciculul de
electroni traversează preparatul şi cu ajutorul
sistemului de formare a imaginii pe ecranul
fluorescent se obţine imaginea preparatului
supus examinării care apoi poate fi fotografiat
 Elemente constructive ale microscopului electronic de
baleiaj (SEM)
Acest tip de microscop oferă imagini tridimensionale ale
suprafeţelor probelor de studiat, dar nu poate furniza
detalii morfo-structurale din interiorul preparatului
Diferă de TEM prin faptul că fasciculul de electroni nu
străbate preparatul, ci se reflectă pe suprafaţa lui
 microscoapele electronice de baleiaj sunt alcătuite din
următoarele 3 unităţi funcţionale distincte, legate între
ele:
- Sistemul electrono-optic
- Sistemul de vid
- Sistemul de operare şi afişaj
 Aplicaţii practice ale microscopiei de baleiaj
- Având în vedere particularităţile constructive şi
funcţionale ale microscoapelor de baleiaj, se pot
obţine nu numai date privind aspectul suprafeţei
unei structuri sau formei ei tridimensionale, ci şi
analiza unor proprităţi fizice şi chimice ale
preparatului
- Practic microscopia de baleiaj oferă posibilitatea
diferenţierii proliferărilor limfocitare de tip “T” de
cele de tip “B”, diferenţierii histocitelor macrofage
precum şi a altor categorii de celule din seria
mielomonocitară. De asemenea are numeroase
aplicaţii în biologia celulară şi moleculară,
patologie celulară, oncologie, microbiologie, etc
 Fotografierea în microscopia electronică
Preparatele biologice folosite în microscopia
electronică sunt deosebit de fine şi supuse
degradării. De aceea pentru cercetarea
imaginilor preparatului şi interpretarea lor se
efectuează fotografii. Toate microscoapele
electronice sunt prevăzute cu dispozitive
speciale de fotografiere, unele complet
automatizate. De regulă, o dată cu instalarea
microscoapelor electronice se asigură şi un
laborator fotografic
 Tipuri de informaţii care se pot obţine prin microscopie
electronică:
-Ultrastructura diferitelor tipuri de celule şi a componentelor acestora
în stare normală şi patologică
-Structura şi configuraţia macromoleculelor proteice
-Procese de transcripţie şi translaţie în codul genetic
-Alcătuirea moleculară a virusurilor şi mecanismul infecţiei virale
-Structura suprafeţelor ţesuturilor, celulelor şi biomoleculelor
-Configuraţia moleculară a acizilor nucleici şi stabilizarea greutăţii lor
moleculare
-Acţiunea unor substanţe asupra structurilor (chimioterapie,
pesticide)
-Localizarea reacţiilor imunologice şi a activităţii enzimatice
-Analize de compoziţie chimică
-Transportul ionic prin celule
-Procese de filtrare prin membrane
-Biosinteza de proteine şi structuri
-Gradul de înrudire genetică dintre organisme.