Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Modele Fenotipice de Microarray in Studiul Procariotelor
Modele Fenotipice de Microarray in Studiul Procariotelor
de microarray la
studiul
procariotelor
Butură Mihail
BMC, Gr. A
Introducere
• Progresele remarcabile ale tehnologiei de secvenţiere au
făcut posibilă obţinerea informaţiilor complete despre
genomul unei procariote într-o fracţiune a timpului şi a
costului, comparativ cu un deceniu în urmă.
Complementară tehnologiei de secvenţiere a genomului cu
o viteză mare de tranziţie a fost dezvoltarea bioinformaticii
şi a avansatei tehnologii ADN microarray, tehnologii care
au împreună analize avansate ale genomului. În contrast,
abordările de mare viteză pentru analizele fenotipice ale
celulelor integrale au fost unul dintre etapele limitative
pentru progresul în profilaxia metabolică și identificarea
funcțiilor genelor necunoscute. Un caz în acest sens este
Escherichia coli K-12, unul dintre cele mai studiate
microorganisme.
Studii microarray fenotipice cu mutaţii e.coli K-12
pentru toate sistemele de componente
• Un sistem de transducție a semnalelor studiat pe scară largă în bacterii este
sistemul de transducție semnal cu două componente, care constă dintr-un
senzor de histidin-kinază (HK) și o proteină de reglare a răspunsului (RR).
Ca răspuns la stimulii de mediu, cum ar fi schimbările în nivelurile de
fosfat sau azot sau osmolaritatea, senzorul monomer HK dimerizează și
autofosforilează un reziduu conservat de histidină. Porțiunea fosfat este
apoi transferată la un reziduu de aspartat în RR, determinând astfel
activarea sa. RR activat, la rândul său, acționează, în majoritatea cazurilor,
la nivel transcripțional fie ca activator, fie ca un represor, afectând astfel
expresia unui număr de gene. Pe baza dovezilor experimentale și a analizei
secvenței genomice, 37 de sisteme cu două componente au fost identificate
până în prezent în E. coli K-12. Dezvoltarea unei metode rapide de
recombinare genetică pentru a perturba genele în E. coli K-12 a permis lui
Wanner și colegilor săi să construiască deleții în fiecare din cele 37 de
sisteme cu două componente din E. coli K-12.
• Aceste construcții le-au permis să confirme fenotipurile cunoscute
ale unor sisteme bine structurate, cum ar fi NtrB / NtrC și PhoR /
PhoB pentru achiziția de azot și fosfat, și să identifice dacă au
posibile funcții neidentificate până în prezent . În plus, un astfel de
studiu ar putea, de asemenea, să definească funcții pentru sistemele
cu două componente mai puțin studiate, cum ar fi QseC / QseB care
este implicat în detectarea cvorumului și RstB / RstA a cărui funcție
nu este încă cunoscută. Cu mutații de ștergere ale sistemelor cu două
componente în mână, Wanner și colegii au efectuat o investigație
sistematică asupra proprietăților lor fenotipice prin microarray
fenotipic. Rezultatul acestor experimente a arătat că 22 din cele 37
de mutante au prezentat fenotipuri modificate în comparație cu
tulpina izogenică parentală, iar 15 mutanți nu au prezentat nici un
fenotip modificat. Cea mai mare parte a fenotipurilor cunoscute din
fișierele sistemelor cu două componente bine studiate au fost
detectate; noi fenotipuri au fost detectate în 14 sisteme cu două
componente și unele dintre ele au fost foarte pleiotropice.
Descifrarea funcţiei operonului b1012
în e.coli K-12
• Sistemul bicomponent NtrB / NtrC este reglementatorul global
pentru utilizarea azotului în E. coli. În condiții de limitare a azotului,
NtrB fosforilează Ntr C, iar Ntr C fosforilat activează un număr de
gene implicate în absorbția surselor de azot și catabolismul. Într-un
studiu cu microarray genomic pentru investigarea genelor în E. coli
K-12 a căror expresie este controlată de Ntr C, sa constatat că
expresia a 2% din genom era sub controlul Ntr C. Foarte important,
sa observat că operonul b1012, care cuprinde șapte gene cu funcții
neidentificate, a fost foarte exprimat. Pe baza asemănărilor cu
secvențele de proteine, a fost prevăzută ca unul dintre genele
operonului b1012, b1006 să fie un transportor de nucleobază.
Folosind tulpinile de E. coli K-12 care transporta inserții mini-Tn5
în multe dintre genele operonului b1012, Kustu și colegii săi au
efectuat o microarray fenotipică la temperatura camerei numai cu
placa PM3, care conține diferite surse de azot.
• Rezultatele au arătat că tulpinile mamă au utilizat pirimidinele,
uracilul, uridina, timina și timidina, ca surse de azot unice, în timp
ce tulpinile mutante nu au făcut-o. Rezultatele microarray fenotipice
au fost, de asemenea, confruntate cu experimente de creștere.
Rezultatele au fost surprinzătoare din două motive: E-coli K-12 sa
crezut că nu este capabilă să catabolizeze pirimidinele în ciuda unui
raport precoce pe care ar putea-o face; iar utilizarea de pirimidine în
E. coli K-12 ar putea fi detectată numai la temperatura camerei și nu
la 37 ° C. Probabil din ultimul motiv, catabolismul pirimidinei în E.
coli K-12 nu a fost bine stabilit deoarece experimentele au fost
efectuate la 37 ° C și nu la temperatura camerei. Cel mai important,
un fenotip ar putea fi atribuit operonului b1012. Operonul b1012 a
fost denumit Rut pentru utlizarea pirimidinei, iar cele șapte gene au
fost denumite rutA-G, a opta gena, rutR, este represorul operonului.
Căile catabolice ale pirimidinei. Calea reductivă (partea superioară) este larg
răspândită și se găsește în archaea, bacterii și oameni. Calea oxidativă (partea
de jos) care se găsește în bacterii nu a fost studiată cu multă detaliere. Calea
Rut (mijlocul) este calea nou descoperită în E. coli K-12, discutată în text.
Investigarea schimbărilor fenotipice la Bacillus Subtilis ce
prezintă mutanţi rpoB rifampicin-rezistenţi