Universitatea de Stat Dimitrie Cantemir

Specialitatea Biologie Moleculara

Determinarea cantitativa a viremiei - incarcaturii virale

B,(VHB)cu ajutorul tehnologia real-time PCR Taqman
cu prelucrarea automata a probelor

Realizat:Solomon Victoria
Definiție:
PCR- sinteza exponentiala
in vitro a unui fragment de
ADN tinta.

 Dr. Kary Mullis a descris

tehnica pentru prima data in
1983 si a primit Premiul
Nobel in Chimie in 1993.
 Primul termen: polimerase
Denumirea de “polimerase”
este datorata enzimei
implicata in aceasta reactie:
“DNA polimerase”.

“Chain”?
“Chain”- in lant, deoarece produsii
primei reactii devin substrat pentru
urmatoarea si pasul se repeta.
 Componentele Reactiei:

ADN tinta - contine fragmentul ADN care trebuie

amplificat.
 Set de primeri- secvente de oligonucleotide, care
incadreaza fragmentul care trebuie amplificat.
Amestec de dNTP – deoxynucleotidetrifosfat
ADN polimeraza termostabila- enzima care catalizeaza
reactia.
Ioni de Mg++ - cofactor enzimatic
Solutie tampon– mentine pH si taria ionica a amestecului
de reactie astfel incat enzima sa actioneze.
Reactia PCR se desfasoara in 3 etape:
 1. Denaturarea: in urma incalzirii amestecului de reactie la 94ºC, ADN-ul tinta este
separat (denaturat) in 2 catene;

 2. Hibridizarea primerilor: ca urmare a scaderii temperaturii la 55-70ºC, primerii se vor

atasa complementar la capetele 3’ ale celor 2 catene;

 3. Elongatia: la temperatura de 72ºC, ADN polimeraza termostabila in prezenta Mn2+ si a

excesului de deoxinucleotid-trifosfati (deoxiadenozina, deoxiguanozina, deoxicitidina si
deoxiuridina) va extinde primerii atasati in lungul matritei tinta si va produce un amplicon
ADN. Analizorul va repeta automat acest proces pentru un numar stabilit de cicluri (de
obicei 30-35), la fiecare ciclu dublandu-se cantitatea de amplicon ADN.
 La randul sau, procesul global de
amplificare desfasurat de-a lungul unui
numar definit de cicluri poate fi divizat
in 3 faze:
- Exponentiala: la fiecare ciclu se dubleaza
cantitatea de amplicon ADN (se admite o
eficienta de 100% a reactiei);
- Lineara: pe masura ce componentele reactiei
sunt consumate, se produce o incetinire a
reactiei iar produsii PCR incep sa se degradeze;
- Platou (end-point): reactia este stopata, nu se
mai formeaza alti produsi de amplificare, iar
daca faza se prelungeste mult produsii PCR vor
suferi o degradare importanta
Metodele PCR traditionale (conventionale) au la baza o detectie a produsilor
PCR in faza de platou a procesului (detectie end-point). In ultimii ani,
tehnologia PCR a fost revolutionata prin dezvoltarea metodelor de detectie in
faza exponentiala (detectie in timp real: real-time PCR)
Tehnologia real-time PCR prezinta numeroase
avantaje fata de cea conventionala: - acuratete mai
mare a rezultatelor obtinute (efectuarea detectiei
se realizeaza in faza precoce a reactiei, respectiv
in faza de crestere exponentiala a amplificarii,
cand se produce o dublare exacta a cantitatii de
amplicon la fiecare ciclu; detectia in acest moment
este optima in sensul ca rezultatele se coreleaza
mai bine cu nivelul initial al tintei, comparativ cu
tehnica PCR conventional, unde detectia are loc in
faza de platou, dupa ce reactia a fost stopata iar
produsii au inceput sa se degradeze;
- domeniu de linearitate mult extins
(sunt necesare mai putine dilutii ale
probelor);
- limita inferioara de detectie mult
imbunatatita (se pot detecta cantitati mai
mici ale ADN-ului tinta, avantaj
esential, spre exemplu, in evaluarea
raspunsului virusologic sustinut la
pacientii cu hepatita cronica cu virus C.
Determinarea cantitativa a viremiei -
incarcaturii virale B,(VHB)cu ajutorul
tehnologia real-time PCR Taqman cu
prelucrarea automata a probelor
Particularitatea o constituie metoda de
detectie a produsului PCR, care este
cuantificat in cursul desfasurarii reactiei
(‘in timp real”) prin monitorizarea
fluorescentei emise la fiecare ciclu de
amplificare, spre deosebire de detectia
colorimetrica care avea loc la sfarsitul
reactiei, in tehnologia conventionala.
 Testele de determinare a viremiei VHB se
bazeaza pe 2 procese majore:
- pregatirea probei pentru a izola ADN-VHB;
- amplificarea PCR a ADN-ului tinta cu
detectia simultana a sondei
oligonucleotidice dublu marcate clivate
specifice tintei.
 QS contine secvente VHB cu
Cuantificarea viremiei se
zone identice de legare a
realizeaza cu ajutorul unei
primerilor ca si ADN-ul tinta,
secvente ADN neinfectioase
dar cu o zona unica de legare
denumita Quantitation
a sondei de detectie care
Standard (QS). ADN QS cu
permite diferentierea
un numar cunoscut de copii
ampliconului QS de
este adaugat in fiecare proba
ampliconul tintei. Analizorul
si parcurge aceleasi etape de
calculeaza concentratia ADN-
preparare a probei,
VHB prin comparararea
amplificare PCR si detectie,
semnalului tintei cu semnalul
ca si secventa tinta.
QS din fiecare proba si
controale.
 Extractia acizilor nucleici se face automat printr-o tehnica de captura la
suprafata unor bilute magnetice de sticla. Particulele virale sunt lizate
prin incubarea la temperatura ridicata cu o proteaza si un tampon care
elibereaza acizii nucleici si ii protejeaza de actiunea DNA-zelor din
plasma.
In fiecare proba este introdus ADN QS intr-o concentratie cunoscuta,
impreuna cu proteaza, agentul lizant si bilutele de sticla. Dupa ce are
loc incubarea amestecului, ADN VHB si ADN VHB QS vor fi captati
la suprafata bilutelor de sticla, in timp ce substantele nelegate vor fi
indepartate printr-un proces de spalare.
Dupa incheierea etapei de spalare, acizii nucleici adsorbiti vor fi eluati
cu o solutie apoasa la temperatura inalta.
Proba procesata, ce include bilutele de sticla impreuna cu ADN VHB si ADN
VHB QS, va fi adaugata amestecului de amplificare si transferata in analizorul
in care vor avea loc amplificarea si detectia
In cazul tehnologiei real-time PCR, amplificarea se
face in prezenta unui sistem raportor care emite
fluorescenta.
Detectia se realizeaza cu ajutorul sondelor de tip 5’
nucleaza-sonde TaqMan, dublu marcate: la un capat
cu o substanta fluorofora (“reporter dye” R) si la
celalat capat cu o molecula blocanta (“quencher dye”
Q).
 Cat timp sonda este intacta, fluorescenta sistemului R
va fi inhibata de molecula Q. In cazul in care
amplificarea este eficienta, moleculele de ADN nou
formate vor fixa prin hibridizare sonda TaqMan; in
cursul etapei de elongatie, ADN polimeraza Taq va
degrada sonda prin activitatea sa enzimatica de 5’
endonucleaza si va elibera astfel fluoroforul.
  Energia emisa de fluorofor in urma excitarii in UV va fi inregistrata la sfarsitul fiecarui
ciclu de amplificare, fiind proportionala cu cantitatea de ADN tinta prezenta in tub pana in
momentul respectiv. Sondele HBV si HBV QS sunt marcate cu fluorofori R diferiti,
permitand inregistrarea independenta a emisiilor lor.
 Inregistrarile sunt folosite pentru generarea unei curbe de amplificare cu 3
regiuni:
 o regiune de latenta in care acumularea de ADN nu atinge inca punctul limita
de detectie a semnalului;
 o regiune de amplificare exponentiala si
 o regiune de platou, in care amplificarea secventei tinta inceteaza in special
datorita epuizarii enzimei si inhibitiei prin cantitatea mare de ADN.
Cu cat este mai mare titrul de ADN VHB din proba, cu atat mai devreme
fluorescenta emisa se va ridica deasupra nivelului bazal de fluorescenta.
Deoarece cantitatea de ADN VHB QS este
constanta in toate probele, fluorescenta emisa de
sonda de detectie ar trebui sa fie detectata in cursul
aceluiasi ciclu, in cazul tuturor probelor.
In treimea inferioara a regiunii de amplificare
exponentiala se stabileste o valoare prag (“assigned
fluorescence level”); traversarea acestei valori
marcheaza declansarea amplificarii.
Pentru fiecare proba se poate determina cu
exactitate ciclul de amplificare in care se
inregistreaza depasirea valorii prag (Ct= critical
threshold value).
Cu cat valoarea Ct este mai mare, cu atat titrul
ADN VHB este mai mic.
Constantele de calibrare specifice lotului de reactivi vor fi folosite
impreuna cu Ct corespunzatoare ADN VHB si ADN VHB QS pentru
calcularea titrului ADN VHB din probe si controale.
In cazul determinarii ARN viral hepatita
C, procesul se desfasoara intr-un mod
similar, dar se adauga si etapa de
transcriere inversa a ARN-ului tinta
pentru a genera ADN-ul complementar
(ADNc). Aceasta etapa este realizata tot de
ADN polimeraza, ceea ce permite ca atat
transcrierea inversa cat si amplificarea
PCR sa se produca impreuna cu detectia in
timp real a ampliconului.
 Bibliografie
https://www.khanacademy.org/science/biology/biotec
h-dna-technology/dna-sequencing-pcr-
electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techpcr/
https://www.sciencedirect.com/topics/neuroscience/po
lymerase-chain-reaction
https://www.genome.gov/10000207/polymerase-
chain-reaction-pcr-fact-sheet/