BAZA GENETICA

MOLECULARA A
SINDROAMELOR
TALASEMICE

Asist. Univ. Dr. Rodica Talmaci

SINDROAMELE TALASEMICE

CANTITATIVE

HEMOGLOBINOPATII

CALITATIVE

HEMOGLOBINE “ANORMALE”
CE SUNT SINDROAMELE TALASEMICE ?
Talasemiile reprezinta un grup de boli genetice, caracterizate prin scaderea
cantitatii de hemoglobina.
Sediul hemoglobinei se afla in eritrocite. Daca hemoglobina este scazuta
eritrocitele sunt mai mici si mai goale. Este ceea ce se numeste anemie hipocroma
si microcitara.
 http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/chr11.html

BAZA GENETICA MOLECULARA A

TALASEMIEI
Molecula integrala de hemoglobina este un tetramer 22.

Lanturile polipeptidice -globinice sunt sintetizate de

gena -globinica (11p15).

Lanturile polipeptidice -globinice sunt

Clusterul de gene -globinice sintetizate de genele -globinice (16p13).

Clusterul de gene -globinice

Reprezentarea schematică a genelor globinice

Mutatii produse in aceste gene determina aparitia talasemiilor. In prezent, in gena -globinei, se
cunosc aproape 300 de mutaţii ce determina transformarea in gene talasemice.
 CLASIFICAREA GENETICA A
TALASEMIILOR
• IN FUNCTIE DE GENA AFECTATA:
1. .α-TALASEMIE
2. .β-TALASEMIE
3. .δβ-TALASEMIE
4. .γδβ-TALASEMIE
CONTROL GENEI β-GLOBIN
 CE ESTE β-TALASEMIA ?
DEFECTE GENETICE IN GENELE β-GLOBINICE PRODUC β-TALASEMIA

Cromozomii
11
MUTATII CE DETERMINA
- TALASEMIA








MUTATII IN PROMOTORUL GENEI β-GLOBINA

CCACACCC ATAAAA
-108
CCTCACCC
-93 -76
CCAAT
-31
β-globina

T T G G G C
G
EROARE DE SPLICING IN GENA β–GLOBINEI:
IVS1 -110 – situs acceptor nou

ADN

ARNm

IVS1 +110 G>A

ADN

ARNm
MANIFESTARILE FENOTIPICE (CLINICE)
IN -TALASEMIE
FORMELE HETEROZIGOTE
DE β–TALASEMIE:
•Talasemia minima/silentioasa
– β++/ N
•Talasemia minora – +/N sau
0/N

FORMELE HOMOZIGOTE DE
β–TALASEMIE:
•Talasemia intermediara –
+/+ sau 0/+
Cariotip normal, 46, XY
•Talasemia majoră – 0/0
 Heterozigot

Heterozigot compus =
Dublu heterozigot

Homozigot
 Daca ambii parinti sunt purtatori
de gena β-globinica defecta exista
riscul de 25% ca la fiecare sarcina
sa se nasca un copil cu β-
talasemie majora sau anemie
Cooley.

Exista o variabilitate foarte mare in ceea ce inseamna severitatea acestor boli talasemice, astfel
delimitarea intre TALASEMIA MAJORA si TALASEMIA INTERMEDIA poate creea confuzie. De aceea, in
acest caz este absolut necesara investigarea prin metode de genetica moleculara.
 Fenotip
β-talasemie
majora
 CE ESTE α-TALASEMIA ?
DEFECTE GENETICE IN GENELE α-GLOBINICE PRODUC
α-TALASEMIA

Cromozomii
16

Daca o persoana are o singura gena α-globinica defecta (din cele patru), aceasta nu va avea nici un fel de manifestare
clinica. Aceasta situatie se numeste conditie de purtator silentios de α-talasemie. Diagnosticul este pus numai prin teste
genetice si este mai curand un diagnostic “deductiv” la o persoana aparent sanatoasa care are un copil cu α-talasemie.
Daca persoana are doua gene α-globinice defecte, atunci diagnosticul va fi de α-talasemie minora. De regula, nu exista
manifestari clinice, iar in hemograma aceasta va avea o anemie usoara hipocroma microcitara. De obicei, pacientul este
gresit diagnosticat cu anemie prin lipsa de fier. Diagnosticul corect implica mai multa experienta din partea hematologului,
deoarece inclusiv electroforeza de hemoglobina este normala. Genele alfa defecte pot fi situate pe acelasi cromozom
(pozitie cis) sau pe fiecare cromozom din pereche (pozitie trans). Daca un parinte are α-talasemie minora cu genele defecte
in pozitie cis (situate pe acelasi cromozom), iar celalat parinte are conditia de purtator silentios (o singura gena este
defecta), exista riscul de 25% ca la fiecare sarcina sa se nasca un copil cu trei gene α-talasemice defecte, adica boala Hb
H. Daca ambii parinti au α-talasemie minora cu genele defecte in pozitie cis (pe acelasi cromozom) exista riscul de 25% ca
la fiecare sarcina sa apara α-talasemia majora, in care toate genele α-globinice sunt defecte, adica Hemoglobina Bart -
Hidrops Fetalis si produsul de conceptie nu este viabil si va muri in uter.
Daca ambii parinti au α-talasemie
minora cu genele defecte in
pozitie trans (pe cromozomi
diferiti) copiii lor vor mosteni α-
talasemie minora.
Daca un parinte are α-talasemie
minora cu genele defecte in pozitie
cis (situate pe acelasi cromozom),
iar celalat parinte are conditia de
purtator silentios (o singura gena
este defecta), exista riscul de 25%
ca la fiecare sarcina sa se nasca
un copil cu trei gene α-talasemice
defecte, adica boala Hb H.
Daca ambii parinti au α-talasemie
minora cu genele defecte in pozitie cis
(pe acelasi cromozom) exista riscul de
25% ca la fiecare sarcina sa apara α-
talasemia majora, in care toate genele
α-globinice sunt defecte, adica
Hemoglobina Bart - Hidrops Fetalis
si produsul de conceptie nu este viabil
si va muri in uter.
 VARIANTE TALASEMICE
-TALASEMIA
Conditia de -talasemie rezulta prin reducerea sintezei lanturilor - si -globinice si se caracterizeaza
printr-o cantitate crescuta de Hb F, un nivel de Hb A2 normal sau scazut si un indice MCV scazut.
Gena -globina, ce controleaza productia de lanturi - este localizata foarte aproape de gena - pe
cromozomul 11. Daca o gena este indepartata din cromozom in urma unei deletii, atunci si cealalta gena
poate fi afectata. In functie de deletia produsa in cromozomi, se pot distinge:
 Macedonia
 Sicilia
 Lepore
-talasemia homozigota este similara
cu -talasemia, dar simptomele sunt mai
usoare. Majoritatea pacientilor supravietuiesc
pana la viata adulta cu necesitati minime de
transfuzie.
-talasemia heterozigota este similara cu
-talasemia minora, dar simptomele tind sa
fie mai putin severe.

Hemoglobina LEPORE este un amestec in productia de lanturi non-. Capatul N-terminal al proteinei contine
secventa aminoacidica a lantului -globinic, iar capatul C-terminal contine secventa aminoacidica a lantului -
globinic. Exista mai multe variante de Hb Lepore, in functie de lungimea segmentelor fuzionate: Washington,
Hollandia, Baltimore.
In Hb Lepore homozigota nu exista productie normala de lanturi -globinice sau -globinice. Aspectele clinice si
hemograma sunt identice cu cele de -talasemie majora
In Hb Lepore heterozigota aspectele clinice si de laborator sunt identice cu cele de -talasemie minora
DIAGNOSTICUL MOLECULAR
IN TALASEMII
SINDROAMELE TALASEMICE

•α-talasemie α-globina

•β-talasemie β-globina

•-talasemie -globina

•-talasemie -,-globina

•γ-talasemie γ-,-,-globina
GENA β-GLOBINA
 TESTELE DE GENETICA MOLECULARA
IN TALASEMIE
STRATEGIA DE INVESTIGARE A MUTATIILOR TALASEMICE se refera la “cautarea” modificarilor
produse in genele globinice normale ce au dus la transformarea lor in gene talasemice.
α-talasemiile si -talasemiile sunt consecinta unor deletii ale genelor globinice, in timp ce β-talasemiile
sunt produse ca rezultat al mutatiilor punctiforme aparute in ADN la nivelul acestor gene β-globinice.
In scopul identificarii mutatiilor -talasemice se procedeaza la urmatoarea etape:

Recoltarea de sange periferic – extractie ADN din sange – amplificare prin PCR a genelor de investigat

Prin metode de biologie moleculara se realizeaza identificarea mutatiilor produse la nivelul genelor de interes.
Aceste metode ne indica exact mutatia produsa in gena studiata, fiind si metode de verificare, absolut necesare
intr-un diagnostic molecular.
 METODE DE IDENTIFICARE A
MUTATIILOR -TALASEMICE
ANALIZA SITUSULUI DE
ELECTROFOREZA IN GEL RESTRICTIE IN FRAGMENTE
CU GRADIENT DE DE AMPLIFICARE PCR
DENATURARE (DGGE) (PCR-RFLP)
AMPLIFICARE SPECIFICA
A ALELELOR MUTANTE
(ARMS-PCR) Amplificarea fragmentelor
Amplificare seriata a
fragmentelor -globinice: genice -globinice urmata
Fr.F, Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr.IV de restrictie enzimatica

Electroforeza Electroforeza in gel de Electroforeza in gel de

fragmentelor F, I, II, III, IV agaroza agaroza
in gel de poliacrilamida
 ELECTROFOREZA IN GEL
CU GRADIENT DE DENATURARE
(DGGE-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
Se realizeaza: scanarea unei gene pentru identificarea mutatiilor.
Electroforeza fragmentelor amplificate in gel de poliacrilamida cu concentratii
crescatoare de agenti denaturanti
La o persoana heterozigota pentru o
mutatie, in DGGE vor aparea 4 benzi.
Doua benzi ce migreaza mai repede
sunt homoduplexurile (alela normala-N
şi alela mutanta-M). Celelalte 2 benzi
aditionale sunt heteroduplexuri. Astfel
apar pattern-uri electroforetice
particulare date de mutaţii genice.
 AMPLIFICAREA SELECTIVA A
ALELELOR SPECIFICE
Metoda se aplica pentru identificarea mutaţiilor punctiforme cunoscute. In amplificarea PCR se
utilizeaza un primer care prezinta aceeasi secventa de nucleotide cu ADN matrita, cu exceptia
nucleotidului terminal 3‘. Acesta este complementar cu nucleotidul modificat prin mutatie.
Taq-polimeraza necesita o complementaritate perfecta a primerului la capatul 3' pentru a putea realiza
polimerizarea.
Astfel, alela dorita este intens amplificata. In cazul neamplificarii rezultatul este nepotrivirea dintre
ADN matrita si oligonucleotidul primer.
Pentru a confirma aceasta conditie, in amestecul de reactie se introduc 2 primeri control care
amplifica un fragment de alta dimensiune.

Mutatia IVS I-110 (G-A)

Banda control de
861 pb

Banda specifică
mutaţiei IVS I-
110 de 390 pb
 ANALIZA SITUSULUI DE RESTRICŢIE
PRIN METODA PCR - RFLP
Unele mutaţii punctiforme pot
crea sau desfiinţa un situs de
restricţie în secvenţa ADN.
Aceste mutatii pot fi
identificate prin analiza
situsului de restricţie.

Prin stabilirea polimorfismului lungimii fragmentelor de restrictie ne dam

seama daca s-a produs mutatia cautata.
 SECVENTIEREA ADN
Metoda prin care se poate afla secventa in baze azotate a unui
fragment ADN de interes
 IDENTIFICAREA DELEŢIILOR - Si -
TALASEMICE GENICE GLOBINICE PRIN
METODA GAP-PCR
Metoda GAP-PCR se aplica in
identificarea deletiilor genice mari.
Metoda se bazeaza pe tehnica de
amplificare PCR cu 3 primeri specifici
pentru fiecare deletie. Acestia sunt
utilizati in aceeasi reactie de
amplificare, conducand la amplificarea
unui singur produs specific deletiei si
o banda control, de marime diferita,
corespunzatoare alelei normale.

deleţia  Macedonia (11,5 kb)

-talasemia

MED-I/ MED-I/ 20,5/ MED-I/ 20,5/

    

0 MED-I (17,5 kb) / +(3.7

kb) = Boala Hb H
-talasemia
 STUDIUL TALASEMIEI IN ROMANIA
SPECTRUL MUTATIILOR -TALASEMICE IDENTIFICATE
1. IVS I-110 (G-A) – β+ IN ROMANIA
2. Cd 39 (C-T) - βo 6%
3. IVS II-745 (C-G) – β+ 1%1% 3%
1%
4. IVS I-6 (T-C) – β+ 36%
5. IVS I-1 (G-A) – βo 13%
6. Mutatia –87 (C-G) –β++
7. Cd 5 (-CT) - βo
8. Cd 6 (-A) – βo
9. Cd 8 (-AA) - βo
10. Cd 51 (-C) - βo
11. +22 (G-A) – β+ 3%
3%
12. Poly A (AATAAA-AATGAA) – β+
7%
-talasemia
0 MED-I (17,5 kb) / +(3.7 kb) = 13% 13%
Boala Hb H IVS I-110 (G-A) CD 39 (C-T)
IVS II-745 (C-G) IVS I-1
-talasemia -87 (C-G) CD 6 (-A)
IVS I-6 (T-C) Poli A (A-G)
deleţia  Macedonia (11,5 kb) CD 51 (-C) +22 (G-A)
deleţia  Lepore CD 5 (-CT) CD 8 (-AA)