Disciplina de Microbiologie UMF Tg.

Mure LP3

Cultivarea bacteriilor
Cultivarea bacteriilor: creterea bacteriilor pe medii de cultur n condiii in vitro. Medii de cultur: complexe de substane care permit creterea i multiplicarea bacteriilor (conin substane nutritive, au pH corespunztor, umiditate corespunztoare, sunt sterile, trebuie asigurat aero/anaerobioza) nsmnare: punerea n contact a unei culturi bacteriene sau a unui produs patologic cu mediile de cultur. Colonie bacterian: aglomerare de bacterii vizibil cu ochiul liber, format din multiplicarea unei singure bacterii de pe mediul de cultur Izolare: repicarea unei singure colonii pe alte medii de cultur cu scopul de a obine cultur pur

Clasificarea mediilor de cultur

Dup consisten: lichide (repartizate n eprubete) solide (geloza dreapt, nclinat, n plac) semisolide (n eprubete)

Dup coninutul de substane nutritive: A. Medii naturale: conin substane nutritive n forma lor natural, fr a fi prelucrate n prealabil: B. mediul cu bil, mediul cu lapte, mediul cu ou (Dorset), ser coagulat de bou (Lffler)

Medii artificiale: a. Medii de baz pentru germeni nepretenioi bulion simplu macerat de carne, pepton, NaCl 0,5% apa peptonat pepton i NaCl 0,5% geloza simpl bulion + agar-agar (un extract de alge care asigur consistena solid, nu are proprieti nutritive)

b. Medii compuse 1) Medii complexe: mediu de baz + substane organice (snge, ser, glucoz), sunt folosite pentru cultivarea germenilor pretenioi geloza snge, geloza ser -1-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP3

bulion snge, bulion ser, bulion glucozat

2) Medii de mbogire: conin ageni selectivi, care inhib dezvoltarea unor bacterii dar permit creterea altora mediul Pike pentru mbogirea streptococilor: bulion glucozat cu cristal violet (inhib dezvoltarea stafilococilor), azid de Na (inhib Gram negativii), +/- snge mediul hiperclorurat pentru mbogirea stafilococilor: bulion + NaCl 7,5% mediul OCST pentru bacilul difteric: ou, cistin, ser, telurit de potasiu

3) Medii speciale: au compoziie special, permit cultivarea unor bacterii pretenioase mediul Lwenstein-Jensen pt. cultivarea micobacteriilor ou, cartofi, verde malachit, asparagin, glicerin mediul Sabouraud pt. cultivarea levurilor: geloz + maltoz/glucoz + antibiotice mediul Schaedler pt. anaerobi geloz snge + glucoz mediul chocolat neisserii, hemofili: geloz snge, sngele se adaug la geloza topit i rcit la 60-70C 4) Medii selective i difereniale: substane selective (inhib creterea unor bacterii) + zaharuri/polialcooli + indicator; sunt folosite pentru izolare i identificare mediul Leifson (ADCL agar dezoxicholat citrat, lactoz) - pt. enterobacterii: sruri biliare + lactoz + rou neutru; mediul Levine (EMB eosine methyl blau) - pt. enterobacterii, E. coli: eozin + albastru de metilen + lactoz; mediul SS Salmonella-Shigella: sruri biliare + verde briliant + lactoz + rou neutru + sruri de fier mediul MacConkey pt. enterobacterii: sruri biliare +rou neutru + cristal violet + lactoz mediul Chapman - pt. stafilococi: NaCl 7,5% + manitol + rou fenol mediul ABE pentru enterococi Agar + Bil + Esculin 5) Medii difereniale: permit identificarea bacteriilor pe baza unor procese biochimice geloza lactozat: lactoz + albastru de bromtimol se studiaz fermentarea lactozei mediul lichid cu indicator Andrade: un zahr + indicator Andrade se studiaz fermentarea zaharurilor mediul SIM (hidrogen sulfurat, indol, mobilitate): conine agar semisolid pentru studiul mobilitii, bogat n triptofan pentru studiul producerii de indol i coninut de sruri de fier pentru detectarea producerii de H2S mediul TSI (triple sugar iron) conine glucoz, lactoz, zaharoz pentru studiul fermentrii acestora, sulfat de Fe pentru detectarea producerii de H2S mediul Simmons mediu cu citrat pentru studiul folosirii citratului ca unica surs de carbon mediul cu uree uree + rou fenol pentru detectarea ureazei

-2-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP3

Metode de nsmnare
Pe medii solide o nsmnare prin epuizare (se obin colonii izolate) o nsmnare n sector (se obin colonii confluente) o nsmnare prin nepare Pe medii lichide o omogenizarea unei colonii n mediu lichid

1. nsmnarea prin epuizare

Obinerea culturii primare
Se ncarc ansa de platin sterilizat cu produs patologic Se descarc ansa pe mediu de cultur: - se nsmneaz un prim sector [1] - din primul sector nsmnat se traseaz cteva striuri paralele n sensul acelor de ceasornic [2] - se continu nsmnarea prin striuri paralele [3], terminndu-se printr-un striu n zig-zag [3] - dup fiecare etap se sterilizeaz ansa, fr a se ncrca n produs patologic! n ultimul sector bacteriile sunt dispersate, astfel nct dup incubare se vor forma colonii izolate

Obinerea culturii pure

Se replic o singur colonie din cultura primar pe un mediu de cultur proaspt, fie prin epuizare, fie prin nsmnare n sector

4 3 -3-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP3

2. nsmnarea n sector
Pe o plac pot fi nsmnate mai multe specii bacteriene Prin nsmnare n sector nu se obin colonii izolate ! Se ncarc ansa de platin sterilizat cu produs patologic Se descarc ansa pe mediu de cultur sub forma unui sector de cerc

3. nsmnarea pe medii n coloan nclinat

Se ncarc ansa de platin sterilizat cu produs Se descarc ansa pe partea nclinat a mediului de cultur sub forma unui striu

NU se obin colonii izolate, bacteriile cresc sub diferite modele

4. nsmnarea prin nepare

Se practic pentru nsmnarea mediilor solide turnate n coloan dreapt Se ncarc acul de inoculare cu produs Se neap mediul n direcie vertical pe o distan de din nlimea coloanei

5. nsmnarea n mediu lichid

Se ncarc ansa de platin sterilizat cu produs Se omogenizeaz produsul recoltat n mediul de cultur lichid

-4-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP3

Cultivarea fungilor
Fungii se cultiv pe medii de cultur speciale care pot conine substane ce inhib creterea bacteriilor (antibiotice) i suplimente nutritive (zaharuri) n funcie de specie.

Medii folosite pentru fungi:

Sabouraud o Mediu selectiv pentru levuri o nsmnarea levurilor se face prin metode descrise la nsmnarea bacteriilor Candiselect sau CHROMagar Candida o Medii selective pentru Candida spp. PDA (Potato-dextrose-agar) o Mediu neselectiv, folosit pentru cultivarea majoritii fungilor filamentoi i a levurilor YGC (yeast glucose chloramphenicol agar) o Mediu selectiv pentru fungi filamentoi i levuri Czapek o Mediu selectiv pentru Aspergillus i Penicillium. o ntrzie sporularea i permite vizualizarea optim a miceliului (hifele fungice) Lactimel (Mediu cu lapte i miere) o Favorizeaz sporularea i pigmentogeneza la dermatofii

Tehnici de nsmnare pentru fungi filamentoi

Epuizare pe medii solide n plci Petri sau n tuburi (n pant) asigur separarea fungilor cu semnificaie clinic de cei contaminani i inhib prin diluare eventualele substane antimicrobiene cu rol antifungic;

nsmnare n puncte izolate la unele prelevate paucibacilare sub form de lichide organice LCR, pasaje din hemoculturi, fragmente de esut

Prin nepare la fire de pr, scuame, diverse raclate

nglobare n medii solide pretopite i rcite la 45C la fire de pr, fragmente unghiale, scuame -5-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP3

Replicarea coloniilor fungice

cu ajutorul unui ac de inoculare sau a unei pensete sterile se preia prob din colonia de identificat trebuie evitat atingerea coloniilor anexe proba prelevat se nsmneaz pe mediu de cultur proaspt o direct, n 1 sau 3 puncte o indirect, dup nglobare n 1 ml de agar topit la 45C, din care cu o pipet steril se depun 1-3 picturi pe mediu de cultur; metoda previne diseminarea sporilor i apariia unor colonii nedorite.

-6-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP3

Caractere de cultur
1. n medii lichide
tulburarea uniform a mediului: Staphylococcus, Salmonella etc. depozit grunjos sau nisipos la fundul tubului, mediul rmne clar: Streptococcus spp. depozit floconos, mediul rmne clar: B. anthracis mediul prezint vl subire la suprafa: Corynebacterium diphtheriae membran groas rugoas, Mycobacterium tuberculosis plisat la suprafa, restul lichidului limpede:

inel aderent pe pereii tubului: Escherichia coli pelicul la suprafa, sub aceasta mediul este colorat verde-albastru: Pseudomonas spp.

2. Pe medii solide
n cazul germenilor cu cretere rapid (timp de generaie 20-30 minute) dup 18 ore de incubare la 35-37C, dintr-o singur bacterie ia natere colonia. La colonii notm: mrimea forma: rotunde, stelate etc. aspectul marginilor: regulate, neregulate, cu prelungiri n cap de meduz. suprafaa coloniei: bombat, granulat, plat, cu depresiune central, cu ridictur central, sau marginal etc. aspectul: lucios, mat, mucoid, aspect curgtor uleios, vitros etc. consistena: vscoas, filant dac se emulsioneaz uor sau nu n ser fiziologic transparena sau opacitatea coloniei pigmentarea coloniei apariia unei zone colorate sau incolore n jurul coloniei eventual lichefierea mediului

-7-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP3

a. Colonii tip S (smooth)

colonii rotunde margini regulate, bombate suprafaa neted, translucid reprezint forma normal pentru majoritatea bacteriilor patogene, fiind dotat cu caliti optime de structur antigenic i de patogenitate.

b. Colonii tip R (rough)

colonii neregulate plate, uscate suprafaa zbrcit forma R reprezint o form de degradare, nsoit de modificri structurale profunde, de modificri antigenice i de scderea virulenei este caracteristic, n general, bacteriilor nepatogene exist i 3 excepii la care forma R caracterizeaz specii patogene: Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphtheriae

c. Forme intermediare: S-R , R-S d. Colonii tip M

aspect mucos foarte mari foarte bombate foarte lucioase cu tendin de curgere i de confluare caracteristice bacteriilor care posed capsul (de ex. Klebsiella)

e. Colonii untoase
colonii mari rotunde suprafa mat aspect untos

f. Colonii pufoase
caracteristice mucegaiurilor aspect floconos, pufos sau pulverulent -8-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP3

se urmresc aspecte privind: mrimea, forma, ritmul de cretere, temperatura la care creterea este optim, aspectul aversului i reversului coloniei, pigmentogeneza, apariia picturilor de exsudat, mirosul, sporogeneza.

g. Fenomen de crare
Speciile Proteus: pe medii simple (fr substane inhibitoare) crete sub forma unui vl care acoper toat suprafaa mediului dac tulpinile nsmnate pe acelai mediu de cultur sunt diferite atunci peliculele formate nu se intersecteaz, apare un spaiu de demarcare, fenomen numit DIENE. dac tulpinile de Proteus sunt la fel atunci cele dou pelicule se vor contopi

-9-