Laboratorul nr.

1
Tehnici de izolare a microorganismelor Exist tehnici speciale bazate pe proprietile morfologice i fiziologice difereniate ale microorganismelor i care au la baz urmtoarele principii: 1. termorezistena diferit a endosporilor comparative cu celulele vegetative; 2. sensibilitatea diferit fa de oxigen a microorganismelor aerobe, microaerofile i anaerobe; 3. rezistena diferit la aciunea anumitor substane care pot crea medii selective (actidiona prezint activitate fungistatic; unele antibiotice au efect antibacterian sau antifungic); 4. particularitile de cretere ale culturilor (n cazul mucegaiurilor care formeaz colonii extinse se aplic tehnici speciale de izolare care pevd diluarea probelor pn la o concentraie redus de spori (1 spor/ 1 pictur suspensie) i apoi rspndirea pe suprafaa mediului de cultur zolarea de culture pure de bacterii prin tehnici biologice Scop - izolarea tulpinilor de Bacillus sp.- ageni productori de enzime (amilaze, proteaze) - izolarea tulpinilor de Streptomyces sp.- ageni productori de ezime, de antibiotice Recoltarea probelor sol de grdin Tehnici de izolare Bacillus sp.- se bazeaz pe termorezistena endosporilor
3

1g sol n 50cm ser fiziologic steril omogenizare (cu bile de sticle sterile) meninere la 80C/ 10 min. inoculare n BCA Streptomyces sp.- se bazeaz pe cultivarea pe mediu selective 5-10g prob sol se amestec cu 1% CaCO termostatare la 25- 28 C, 7-9 zile

Mediile caracteristice folosite: - BCA pentru bacteriile din genul Bacillus - Gauze- agar pentru streptomycete, bacterii filamentoase care fac parte din categoria Actinomycetae, cresc filamentos, avnd celule alungite, ramificate, la capetele crora se formeaz lanuri de spori exogeni, denumii arthrospori

Laboratorul nr.2
Tehnici de selecie calitativ a microorganismelor cu importan n bioindustrii SELECTIA (SCREENING-UL) urmrete identificarea tulpinilor active dintre culturile pure izolate i clasificarea acestora n funcie de potenialul fermentativ. Etapele de selecie sunt necesare n toate studiile care vizeaz utilizarea de noi tulpini. In general prin selecie se urmrete identificarea tulpinilor nalt active, dar se poate viza i comportamentul culturii n sensul realizrii unui proces avantajos din punct de vedere economic. Astfel se urmresc: - capacitatea de cretere pe mediu de cultur ieftin - capacitatea de biosintez ntr-un timp scurt - potenialul de producere a metaboliilor care s fie uor de recuperat din mediul fermentativ.

Selecia se realizeaz n dou etape: 1. selecia calitativ (preselecia) se urmrete identificarea tulpinilor active prin aplicarea unor procedee simple, cu rezultat uor de evideniat. Pentru produsele de biosintez intracelulare criteriul de evaluare l reprezint a) dezvoltarea colonial (diametrul coloniilor) b) viteza de dezvoltare colonial (diametrul coloniilor/h). Pentru produsele de biosintez extracelulare a) se evideniaz dac este posibil eliberarea produsului de biosintez n mediul din imediata apropiere a coloniilor b) se apreciaz cantitatea de produs format. 2. selecia cantitativ- cnd tulpinile preselecionate n prima etap sunt studiate i triate dup parametrii urmtori: a) randamentul de biosintez, prin studiul comparativ al potenialului enzimatic al tulpinilor preselecionate; n funcie de localizarea enzimei, randamentul de biosintez se exprim a ) pentru enzime exogene- activitatea enzimatic determinat n condiii standard i exprimat n uniti internaionale, n raport cu unitatea de volum de mediu de biosintez ; a ) pentru enzime intracelulare- activitatea enzimatic n raport cu biomasa substan uscat rezultat prin cultivare i raportat la volumul de mediu de cultur. b) comportamentul n timpul procesului fermentativ- condiii de cultivare care cuprind : i. compoziia substratului ii. temperatura iii. pH-ul iv. separarea produselor de biosintez. c) comportamentul n bioreactoare. Selecia calitativ se realizeaz prin cultivare pe medii lichide n vase de laborator sau bioreactoare de laborator. Evidenierea productorilor de amilaze Metoda difuziei radiale n gel se aplic productorilor de enzime hidrolitice produse extracelular care difuzeaz n imediata vecintate a coloniilor active producnd hidroliza substratului. CULTIVAREA se realizeaz n plci Petri aplicnd tehnica: - mediul se repartizeaz n plci Petri i dup solidificare pe suprafaa mediului n 5 puncte diferite se inoculeaz celule ale culturii supuse seleciei; - probele se termostateaz corespunztor. SELECIA productorilor de amilaze se va realiza innd cont de urmtoarele criterii: 1. dezvoltarea colonial: se determin diametrul coloniilor i viteza de cretere a coloniei, [mm/s] egal cu raportul din diametrul coloniei [mm] i timpul de cultivare [s]; 2. aprecierea gradului de hidroliz a amidonului, evideniat uor prin inundarea suprafeei plcii cu soluie 1N Lugol. Mediul care conine amidon nehidrolizat va avea culoare albastr, iar n jurul coloniilor active (care produc amilaze) se vor dezvolta zone de hidroliz incolore sau de culoare roubrun n cazul hidrolizei pariale. Cu ct zonele sunt mai mari, cu att coloniile sunt mai active. Evidenierea productorilor de proteaze Se analizeaz pe baza potenialului microorganismelor de a produce proteaze pe substraturi de natur proteic: cazeina i gelatina. Microorganismele cu activitate cazeinolitic se determin folosind o tehnic similar cu determinarea productorilor de amilaze; mediile specifice conin 1% cazein (5mL lapte steril). Tulpinile active, productoare de proteaze vor prezenta n jurul coloniilor o zon clar comparativ cu restul mediului care este opac. Aprecierea se face prin determinarea raportului de cazeoliz: R - raport de cazeoliz
c 2 1

R = Dz /D
c c

Dz - diametrul zonei de cazeoliz, mm

c

D - diametrul coloniei, mm Microorganismele cu activitate gelatinolitic sunt selecionate prin inocularea celulelor prin nepare central ntr-un tub de gel ce conine 12% gelatin. Probele se termostateaz la temperatu ra camerei timp de 3 zile, iar aprecierea culturilor active se va face funcie de gradul de hidroliz al gelatinei:
c

Laborator 3- Obinerea inoculului sporifer i vegetative

Cantitatea de inocul variaz n funcie de natura microorganismelor i se exprim n procente raportate la volumul mediului de cultur :
5 -3

- pentru bacterii 1-2% (~10 celule cm )

5 6 5 6

- pentru drojdii 4-5 % (10 10 celule cm )

-3

- pentru mucegaiuri 5-10% (10 10 celule cm ) De obicei se prefer utilizarea unei cantiti mai mari de inocul pentru a declana mai rapid dezvoltarea culturii concomitent cu reducerea riscului de contaminare. Tehnici de obinere, control i dimensionare a inoculului sporifer Metodele de obinere, control i dimensionare a inoculului sporifer sunt specifice microorganismelor- ageni productori de enzime. Pentru obinerea enzimelor fungice, n laborator se aplic metoda cultivrii n plci Petri, n care mediul nutritiv solidificat este acoperit cu o folie de celofan. Se fierb discuri de celofan (cu diametrul de 60mm) de dou ori, cte 5 minute, n ap distilat. Pentru a le menine imersate n timpul fierberii se folosesc bile de sticl. Discurile se sterilizeaz apoi la 120C, 15min. Dup rcire se acoper mediul de cultur din plcile Petri cu cte o rondel de celofan, folosind o penset sterilizat prin flambare pentru a manipula rondela i a elimina bulele de aer care se formeaz la aezarea acesteia pe mediu. Aceast operaie se realizeaz n condiii aseptice pentru evitarea contaminrii. Se inoculeaz plcile astfel pregtite cu inoculul fungic. Se utilizeaz firul metalic pentru recoltarea fragmentelor hifale de pe marginea unei culturi care crete activ, care se plaseaz apoi n partea central a plcii i se etaleaz pe toat suprafaa foliei, avnd grij ca firul s nu strpung membrana de celofan. Se poate utiliza i o suspensie de spori i fragmente de hife n ser fiziologic steril, care se depune central pe folie i apoi se etaleaz pe toat suprafaa cu ajutorul unei baghete de sticl. Plcile Petri se termostateaz optim, corespunztor tipului de microorganism. Prin termostatare sporii germineaz, hifele penetreaz porii foliei spre mediul de cultur, astfel nct are loc o cretere normal a biomasei. Sporii rezultai prin sporularea miceliului nou format rmn rmn la suprafaa foliei. La sfritul cultivrii, pentru obinerea unei suspensii uniforme de spori se desprinde folia de celofan i se trece aseptic ntr-un vas Erlenmayer cu un volum cunoscut de ap steril, obinndu-se astfel un inocul sporifer concentrat. Prin examen microscopic direct se verific puritatea inoculului obinut, iar pentru a stabili concentraia de spori/ cm suspensie se aplic metoda direct de numrare a sporilor de mucegai folosind citometrul Thoma. In cazul bacteriilor sporogene din genul Bacillus, pentru inducerea sporulrii se folosesc medii speciale. Gradul de sporulare la Bacillus subtilis trebuie s fie de 90- 95%. Suspensia de spori se realizeaz prin antrenarea celulelor de pe suprafaa mediului de cultur cu ser fiziologic steril. Aceast suspensie este utilizabil 1- 3 luni dac se pstreaz la 0,5- 6C sau un timp mai ndelungat dac se pstreaz la -20C. Dimensionarea inoculului sporifer bacterian se realizeaz prin numrare direct aplicnd metoda Breed.
3

-3