CURS 4

INTRODUCERE

Lezarea genelor int la oareci reprezint a nou tehnologie care revoluioneaz cercetarea biomedical Chiar dac proiectul genomului uman a ajutat la stabilirea celor aproximativ 35000 de gene candidate, doar o mic parte din aceste gene au fost caracterizate precis pentru funcia lor in vivo Beneficiul major al acestei tehnologii este acela de a permite analiza funciei proteinei produs de o anumit gen in vivo. Este astfel posibil determinarea produsului genei n condiii de repaus al corpului, dar i n diferite situaii patologice i fiziologice. Multe modele de gene knockout la oareci simuleaz fenotipul bolilor umane. Modelele de oareci modificate genetic reprezint oportuniti unice pentru dezvoltarea i testarea diferitelor strategii terapeutice nainte ca acestea s fie introduse n clinic.

GENE KNOCKOUT LA SOARECI

Modelele animale sunt deosebit importante pentru cercetarea biomedical deoarece ajut la ntelegerea patogenezei bolilor i permit dezvoltarea de strategii terapeutice care s permit studiul eficacitii noilor tratamente cu consecine asupra costului i timpului alocat trialurilor clinice oarecii de laborator au devenit rapid cele mai utilizate mamifere n biomedicin datorit dimensiunilor reduse, ciclului de reproducere scurt, informaiei lor genetice cunoscute i mai ales datorit posibilitii de a induce modificri genetice precise n celulele stem embrionare i de a le transfera la linii de oareci. Multe alte specii ca Drosophila [Gloor GB., 2001], viermele nematod Caenorhabditis elegans [Jorgensen EM, Mango SE., 2002] i petele zebr [Udvadia AJ, Linney E., 2003] au fost utilizai n experimente de mutagenez pentru studiul proceselor de dezvoltare i transducie a semnalelor. Dintre mamifere oarecii s-au dovedit a fi cele mai bune modele animale, deoarece ei sunt capabili s mimeze fenotipic bolile i afeciunile umane.

CELULELE STEM EMBRIONARE

n anii 60 dup ce primele experimente de deleie genic au fost efectuate n celulele stem embrionare (ES) ale murinelor [Thomas KR i colab., 1987], s-a obinut un numr remarcabil de oareci knockout. Celulele ES sunt linii de culturi celulare, colectate iniial din masa celular intern a blastocitilor la 3-5 zile postcoitus la stadiul de blastul de dezvoltare Deoarece aceste celule provin din stadii timpurii ale dezvoltrii ele sunt celule pluripotente. Toate genele lor pot fi activate i toi produi lor genici pot fi sintetizai. De asemenea ES pot fi subcultivate, permind ca un numr crescut de celule s fie folosite n procese ca transfecia i recombinarea secvenelor omoloage. n plus, celulele ES ale oarecilor pot fi meninute ntr-un stadiu nedifereniat, n monostraturi de tip fibroblastic, cand mediul de cultur este mbogit cu factor inhibitor leucemic. n ciuda acestui tratament, celulele ES pstreaz capacitatea lor de a contribui la toate tipurile de esuturi i toate liniile celulare cnd sunt reintroduse ntr-un blastocist gazd [Nagy A, i colab., 1993].

Diagrama izolrii i multiplicrii celulelor stem embrionare

VECTORI TINTA

Pentru a stabili modelul de oarece knockout, este realizat o construcie de ADN, numit vector int ce conine forma mutant a genei de interes. Vectorul int cuprinde trei elemente principale ordonate specific: i) o regiune 5' omoloag genei int, ii) o gen marker de rezisten la medicamente pentru selecia pozitiv a celulelor care integreaz vectorul int, iii) o regiune 3' omoloag genei int. Cnd construcia este complet, vectorul este liniarizat la sfritul regiunilor omoloage 5' sau 3', astfel nct capetele ADN-ului s poat servi ca substrat pentru iniierea recombinrii omoloage cu locusul int. Dup transfecia vectorului int liniarizat n celule ES, se face o selecie a medicamentelor, pentru a mbogi aceste celule ES, care s-au integrat n vectorul int i se exprim ca gene sensibile la medicament. Cei mai frecvent utilizai markeri de selecie au fost gena neomicin fosfotransferaza (Neo), care confer rezisten la analogul de neomicin G418. Metoda utilizat pe scar larg pentru a mbogi clonele de celule ES pentru recombinare omoloag este o strategie a genelor int care implic un vector conceput pentru a fi utilizat ntr-o dubl selecie de droguri, protocol cunoscut ca selecie pozitiv-negativ.

Secvena de nlocuire a vectorului pentru selecia pozitiv-negativ n celulele ES

Vectorul conine caseta de expresie a genei de rezisten Neo i gena HSV Tk. Dup recombinare caseta de selecie pozitiv la medicament este ncorporat n locusul int i caseta de selecie negativ este nlturat. Alela (-) indic alela mutant dup recombinarea omoloag. R indic situsurile enzimei de restricie utilizate pentru excizia ADN nainte de detecia recombinrii omoloage prin tehnica Southern blot cu ajutorul unei sonde specifice derivat din afara regiunii int

VECTORI TINTA

n afar de selecia pozitiv a markerului Neo poziionat ntre regiunile 5 i 3 omoloage ale genei int, este inclus o gen caset suplimentar de selecie negativ amplasat la captul regiunilor omoloage. Gena de selecie negativ cel mai frecvent folosit este gena caseta de expresie a virusului herpes simplex timidin kinaza (Tk), care confer sensibilitate la guanozin analog al ganciclovirului. Produsul genei Tk fosforileaz ganciclovirul, i i permite acestuia s fie ncorporat n ADN-ul replicat acionnd ca un inhibitor de sintez al ADN-ului ntr-un experiment tipic de gene-int, vectorul de selecie pozitiv/negativ va fi aleatoriu integrat de ctre capetele liniare n genomul multor celule, care pstreaz ambele casete de selecie Neo i Tk i confer rezisten la neomicin i sensibilitate pentru ganciclovir. Prin folosirea schemei de selecie pozitiv/negativ, numrul absolut al coloniilor de celule ES care supravieuiesc seleciei duble de medicamente este de aproximativ 10 ori mai mic dect numrul de colonii care supravieuiesc doar seleciei pozitive. Nu toate clonele de ES care supravieuiesc seleciei pozitiv/negativ sunt recunoscute ca prezentnd recombinri omoloage, motiv pentru care acestea, ar putea conine gena marker de selecie negativ care dobndete mutaii de inactivare, nainte de integrarea aleatorie a vectorului int n genomul celulei ES.

Mecanismul toxicitii celulare a ganciclovirului, utilizat pentru selecia negativ n screening-ul celulelor stem embrionare cu recombinare omoloag

Selectarea celulelor stem embrionare recombinate

Vectorul int liniar este introdus n celulele stem embrionare prin amestecarea prealabil cu aceste celule ntr-o cuvet de electropermeabilizare. Cmpul electric deschide porii membranei celulelor ES, permind intrarea vectorului int. Cnd curentul electric este ntrerupt, membrana celulelor ES revine la situaia normal. Secvena ADN construit difuzeaz prin citoplasm i intr n nucleu. Toate celulele ES care au suferit electropermeabilizare sunt crescute n culturi celulare care conin soluie de antibiotic. Coloniile de celule ES crescute vizibil i dezvoltate n prezena unor compui de selecie sunt recoltate ca i candidate probabile ce pot s conin gene mutante n genomul lor. Celulele ES care au suferit recombinari omoloage vor fi genetic heterozigote, la nivelul locilor cromozomiali vizai. La selectarea regiunilor omoloage din gena int pentru clonare n vectorul int, este important de a se utiliza analiza Southern blot (sau analiza PCR). Succesul acestor analize este dependent de selecia sondelor ADN din afara regiunilor de recombinare i de alegerea situsurilor de restricie care vor conduce la identificarea fragmentelor de restricie care sunt unice pentru alelele mutante i respectiv alelele de tip slbatic (wild type).

Injectarea celulelor ES recombinate n blastociti i transferul blastocistului la purtatori

Coloniile de celule ES ce prezint recombinrile omoloage presupuse sunt individualizate prin tripsinizare i colectate cu un ac fin, subire care este conectat la un micromanipulator. Blastocitii destinai microinjectrii cu celule ES sunt prelevai de la femele donatoare. Un ac ascuit este introdus in blastocist i se elibereaz 15-25 celule ES, prin presiune pozitiv. Embrionii injectai trebuie implantai la femele. Succesul de transfer al embrionilor depinde de calitatea mediului gazdei materne. mperecherea cu oareci masculi este necesar pentru modificrile hormonale necesare stabilirii sarcinii. Femelele nu pot purta embrionii lor adevrai i sunt puse s se mperecheze cu oareci vasectomizai. Femele de oareci au ovulaie spontan i pot fi fals nsrcinate prin mperecherea cu masculi vasectomizai i vor afia profilul hormonal al unei femele gravide normal.

Injectarea celulelor ES recombinate n blastociti i transferul blastocistului la purtatori

Figura 1. Clone celulare multiple de celule stem embrionare ce cresc formnd monostraturi de fibroblati. Fibroblatii provin de la embrioni de oareci transgenici purttori ai casetei de selecie Neo. Fibroblatii sunt iradiai pentru a preveni proliferarea lor ulterioar, dup pregtirea acestora din embrioni, Figura 2. Injectarea celulelor ES n blastocist. Celule ES individualizate sunt ncrcate ntr-o pipet de injectare. (1) vrful ascuit al pipetei ptrunde n cavitatea blastocistului, (2) cu grij i ncet se mpinge vrful de injecie al pipetei n embrion fr ruperea sau neparea peretelui opus, (3) celulele ES sunt expulzate prin presiune pozitiv, (4) acul este retras din embrion, (5) i blastocitii injectai sunt colectai pentru transferul la femele purtator (surogat) (6)

Himera i puii F1 i F2

Succesul microinjectrii celulelor stem embrionare n blastocist duce la formarea unui embrion care conine celule din blastocistul iniial i n plus celulele embrionare implantate n blastocist. Celulele de origini diferite cresc mpreun pentru a forma un nou embrion. oarecele hibrid rezultat are esuturile i organele formate dintr-un amestec de celule derivate din celulele de origine (de obicei cu provenien din oareci C57/BL6 cu blana neagr) i celule ES (de obicei cu provenien din oareci SV129 cu blana galben/maronie). Hibridul este denumit himer pentru c acesta conine celule din dou surse independente. Blana hibrizilor himerici este un amestec de galben-maroniu i negru. Dac nici o celul ES nu este ncorporat n stadiul de blastocist, puii vor avea blana neagr. Aspectul blnii este un marker precoce util pentru succesul unei mutaii. Cnd ncorporarea celulelor mutante este numai la nivelul celulelor somatice, care se dezvolt n esuturi nonreproductive, himerele vor exprima mutaia, dar puii lor nu. Cnd ncorporarea are loc n celule care se dezvolt din celulele germinale, mutaia int este transmis la generaia urmtoarea de pui de himer Pentru a detecta trasmiterea pe linie germinal se realizeaz ncruciarea ntre himer i oareci de tip slbatic. Himera este ncruciat cu rase de oareci normali, ca C57/BL6. Puii F1, rezultat al ncrucirii, sunt analizai pentru exprimarea mutaiei. Un pui de oarece F1 care primete gena mutant de la progenitorul himeric este heterozigot pentru gena mutant. Tehnica Southern blot i tehnica PCR cu sonde specifice se efectueaz pe ADN-ul genomic dintr-un mic eantion de esut de la coada puiului de oarece, n scopul identificarii heterozigoilor pozitivi. Fiecare heterozigot pozitiv este un potenial fondator pentru o linie de oareci mutani. Puii heterozigoi F1 identificai sunt mperecheai unul cu cellalt pentru a produce o generaie F2. Teoretic, populaia F2 va urma principiile de segregare mendelian, rezultatul fiind 25% homozigoi mutani, 25% homozigoi control tipul slbatic i 50% heterozigoi mutani. n cazul n care deleia genei este letal, homozigoii mutani nu vor supravieui. n cele din urm, lipsa produsului genei la homozigoii mutani este evideniat prin anticorpi specifici prin tehnica Western blot folosind esut unde proteina este, de obicei, exprimat.

mperecherea oarecilor himer, cu oareci de tip slbatic( wild type) pentru obinerea de heterozigoi mutani
Clonele de celule stem embrionare puttoare a unei alele de tip slbatic i unei alele mutante (+/-) sunt injectate n blastociti. Blastocitii injectai sunt transferai la femele purtator care vor da natere la himere. De obicei celulele ES purttoare de mutaii dominante care determin culoarea maroniu-glbuie a blnii (rasa SV129), sunt injectate la blastociti de la oareci de ras neagr (rasa C57B16). Himerele sunt apoi, mperecheate cu oareci C57B16 de culoare neagr. n cazul transmiterii mutaiei pe linie germinal, oarecii heterozigoi F1 (+/-) vor fi cu blana maroniu-glbuie. Ca urmare a mperecherii oarecilor heterozigoi ntre ei, 25% din oareci vor fi homozigoi F2, dac viabilitatea nu este compromis de mutaii

Diagrama fluxului pentru genele knockout Se genereaz apoi o linie de oareci

cu gena mutant. oarecii homozigoi cu mutaie nul au deficiente ambele alele, iar heterozigoii au deficient doar una din cele dou alele ale genei. Genotipul este -/- pentru mutaie nul, +/-pentru heterozigoi i +/+ pentru alela de tip slbatic obinuit, de control (wild-type). Fenotipul reprezint setul de caracteristici determinate de mutaie i se refer la caracteristici biochimice, anatomice, fiziologice i comportamentale.

Caracteristicile oarecilor mutani sunt identificate, n comparaie cu oarecii de control normali, iar cele relevante pentru bolile umane sunt cuantificate. Aceste caracteristici specifice bolii sunt apoi folosite ca variabile de test pentru evaluarea eficienei tratamentelor. Tratamente general acceptate sunt administrate la oarecii mutani. Un tratament care previne sau nltur caracteristicele bolii la oarecii mutani este folosit pentru mai multe teste suplimentare ca un tratament potenial pentru boli genetice umane.

Expresia genelor esut specifice

Tehnologia convenional de gene knockout este limitat de moartea embrionar sau postnatal imediat. n plus, rolul unei anumite gene n esuturile adulte poate fi mascat la orice oareci knockout, generai prin anomalii sau compensri de dezvoltare, sub forma intensificrii sau atenurii expresiei altor gene. Implementarea de situsuri specifice de recombinare, cum ar fi sistemul bacteriofag P1 LoxP / CRE, permit dezvoltarea unui knockout condiionat de absena unei anumite gene numai ntr-un esut specific sau dup un stadiu de dezvoltare specific [Gu H. i colab., 1993]. Enzima CRE este izolat de la bacteriofagul P1 i acioneaz ca un situs specific de recombinare. Secvena recombinat de ctre CRE, denumit LoxP, const din dou scurte repetiii de ADN (situsul de recunoatere CRE ) i o secven intermediar, ntre cele dou. Dou secvene LoxP cu aceeai orientare vor conduce la excizia ADN-ului cuprins ntre cele 2 secvene de ctre CRE lsnd intact un situs LoxP. n contrast, n cazul n care dou situsuri LoxP sunt orientate opus, CRE va inversa acest segment intermediar de ADN.

Knockout condiional utiliznd LoxP/ Locusul de tip slbatic i construcia int CRE condiional prezint trei situsuri LoxP ce

flancheaz caseta marker de selecie a tandemului Neo/Tk i exonul care va fi deletat. O prima int este recombinarea dintre aceast construcie i locusul ales. O clon recombinat pozitiv este aleas pentru a doua faz, ce cuprinde trasfecia cu vectorul ADNc - recombinaza CRE Dup expunerea la CRE sunt posibile 3 evenimente recombinatorii. Populaia celular A prezint excizia complet i poate fi utilizat pentru injectarea blastocitilor pentru a genera knockout total la oareci. Populaia de celule B este forma n care caseta de selecie a fost eliminat, dar gena nu este nc deletat. Aceste celule ES sunt preluate pentru a stabili knockoutul condiional, unde exonul flancat este deletat mai trziu, adic dup ncruciarea animalelor rezultate cu oareci transgenici ce exprim recombinaza CRE sub un promotor esut specific. Secvena palindromic parial de nucleotide a situsurilor LoxP este prezentat n partea inferioar.

Expresia genelor esut specifice

Construciile int pentru inseria situsurilor LoxP n ADN-ul genomic sunt similare cu cele utilizate pentru realizarea de gene knockout convenional n celule ES. n plus fa de aceste aspecte, design-ul construciei de gene knockout condiionat necesit un numr important de considerente suplimentare: knockout-ul convenional este, de obicei, conceput astfel nct caseta Neo lezeaz transcrierea genei endogene. n knockout-ul condiional, gena endogen trebuie s funcioneze n mod normal, pn la recombinarea de ctre CRE recombinaza i, astfel, orice modificri trebuie s fie n afara regiunilor de codificare, adic introni, i nu trebuie s interfereze cu regiunile de reglare. Situsul LoxP trebuie s fie introdus ntr-un mod n care splicing-ul, va avea ca rezultat excizia unei cantiti suficiente de ADN pentru ca gena s fie inactivat. Acest lucru poate fi deosebit de dificil pentru genele cu introni de dimensiuni mari, n cazul n care numai cantiti mici de secvene codificatoare pot fi nlturate.

Expresia genelor esut specifice

Genele de rezisten incluse pentru selecia clonelor int conin de obicei mai multe kilobaze de ADN strin, care are potenialul de a influena expresia genei int nainte de recombinare. Pentru a minimaliza aceast potenial influen asupra expresiei genei, este posibil s se nlture gena de rezisten din clonele celulelor ES int in vitro, nainte de microinjectarea blastocitilor. Pentru a elimina genele de rezisten, un situs suplimentar LoxP trebuie s fie inclus pentru a flanca gena de rezisten. Pentru a limita numrul evenimentelor de recombinare i pentru a facilita selecia dorit de clone, o selecie negativ poate fi realizat prin adugarea ganciclovirului n celule ES. Aceast strategie necesit utilizarea unei casete marker de selecie care conine att gena Tk ct i gena Neo de rezisten pentru selecie. Adaosul de ganciclovir n culturile celulare de ES va permite creterea clonelor cu : i) exonul de interes flancat de dou situsuri LoxP, i anume exonul delimitat pentru knockout -ul condiionat i ii) clonele de celule ES cu un singur situs LoxP, gata de utilizare pentru stabilirea knockout-ului general. Folosind trei site-uri LoxP i caseta marker de selecie Neo/Tk introduse n genomul celulei ES se produc ambele tipuri de clone clasice pentru: knockout-ul general i knockout-ul condiionat. Cnd injectarea blastocitilor i transmiterea pe linie germinal a celulelor ES cu knockout condiionat este realizat i oareci cu exonul flancat au fost obinui, recombinaza CRE este exprimat n esutul sau tipul celular de interes. Sistemul de recombinare LoxP/CRE este un instrument puternic pentru deleia condiionat i specific celular a genelor. Introducerea acestui sistem la oarecii transgenici faciliteaz studiile cu privire la pierderea funciei genelor ntr -un anumit tip de celule. Prin inseria situsurilor Lox pe calea recombinarii omoloage n gena de interes i expresia recombinazei CRE int pentru un anumit tip de celule folosind un promotor esut specific, va fi posibil introducerea deleiilor predeterminate n genomul mamiferelor.

Recombinaza CRE ligand activatoare

O alta metod pentru genele int condiionate este bazat pe supraexpimarea recombinazei CRE care ar putea permite inactivarea genei int flancat, esutspecific, n orice moment din timpul dezvoltrii i la oarecele adult. Fuziunea domeniului de legare la ligand (LBD) al receptorilor de estrogen cu recombinaza CRE genereaz o recombinaz himeric a crei activitate este dependent de prezena receptorilor de estrogen sau de tamoxifen modulator al receptorilor de estrogen. Pentru a obine gene int condiionate la oareci, n cazul n care estradiolul endogen este prezent, s-a indus fuziunea recombinazei CRE cu LBD mutant al receptorilor de estrogen uman. LBD mutant al receptorilor de estrogen nu este legat de estradiol, ntruct acesta se leag de ligandul sintetic pentru tamoxifen. Un astfel de oarece transgenic poate fi mperecheat cu un oarece ce prezint un exon flancat n interiorul genei care ar trebui deletat. Puii lor exprim ambele modificri, exonul flancat i recombinaza CRE ligand dependent, i li se administreaz tamoxifen. Exonul flancat este ulterior eliminat din genomul acestor esuturi, n cazul n care proteina recombinazei CRE de fuziune este exprimat. Exprimarea celular specific a recombinazei CRE fuzionat la un receptor de estrogen LBD mutant, la oarecii transgenici, poate fi astfel utilizat pentru eficientizarea recombinrii CRE mediat de tamoxifen (tamoxifen dependent), la nivelul locilor ce conin situsuri LoxP pentru a genera mutaii somatice situs specifice ntr-o manier spaio-temporal controlat.

Recombinaza CRE ligand activatoare Figura 1. Strategie de reproducere pentru

obinerea unor oareci cu knockout celular specific. oarecii care prezint alele nule, i n plus sunt purttori ai alelei unde gena sau exonul care vor fi deletai sunt flancai de dou situsuri LoxP (exoni flancai) sunt fenotipic oareci heterozigoi. Cnd sunt mperecheai cu oareci transgenici care exprim recombinaza CRE (C) aceti oareci devin homozigoi mutani nuli Figura 2. Strategie de reproducere pentru obinerea de oareci cu knockout celular specific sub control temporal. Transgenarecombinaza CRE fuzionez cu ADNc domeniului de legare al ligandului receptorului de estrogen. Activarea recombinazei CRE este dependent de prezena tamoxifenului. Adaosul de tamoxifen permite knockoutul genei sau exonului de interes.

Expresia sistemului tetraciclin/doxiciclin inductibil Sistemul ce rspunde la tetraciclin este compus dintr-o protein tetraciclin
represoare (TetR), fuzionat la un domeniu activator de transcriere pentru virusul herpes, precum i o secven tetraciclin operator (tetO) legate de un promotor pentru controlul transcripiei unei gene ce intervine dup legarea TetR de tetO. Sistemul tetraciclin-responsiv poate fi folosit mpreun cu tehnologia CRE/LoxP pentru a permite controlul temporal al genei int la oareci, prin plasarea expresiei genei CRE sub controlul unui promotor minimal tetO. Pentru mai mult specificitate, un promotor esut specific poate fi folosit pentru a regla expresia genei TetR. Mai mult dect att, exist variaii Tet-off i Tet-on pentru controlul expresiei genei tet responsive, care depind de legarea de tetraciclin a TetR. n versiunea Tet-off a acestui sistem, proteina transactivatoare TetR, tTA, se va lega la promotorul tetO minimal n prezena tetraciclinei pentru a represa expresia genei. Cnd administrarea de tetraciclin este oprit, tTA nu se mai leag de de promotorul tetO minimal i transcrierea este indus de mai multe mii de ori n esuturile oarecilor transgenici. n versiunea Tet-On a acestui sistem, expresia genei CRE controlat de promotorul tetO minimal este mai degrab indus, dect represat, de administrarea doxiciclinelor. Astfel, rezult o form mutant a TetR, rtTA, care n mod normal represeaz promotorul minimal tetO. Dup adugarea de doxiciclin, rtTA este eliberat din tetO permind exprimarea genei CRE.

intele genei Tet-off inductibile

Linie de oareci heterozigoi pentru un locus int mutant condiional cu situsurile LoxP flancnd gena de interes i linie de oareci homozigoi pentru transgena care exprim proteina tetraciclin represoare. Linia de oareci este ncruciat cu alta care este heterozigot pentru transgena CRE responsiv la tetraciclin. ncruciarea acestor linii produce progenitori care sunt heterozigoi pentru ambele transgene, pentru a menine represia genei CRE i care vor transmite locusul mutant condiional i locusul de tip slbatic. Eliminarea doxiciclinei are ca rezultat exprimarea genei CRE i crearea unui locus int mutant.

oareci transgenici

Avnd n vedere c oarecii knockout au o gen cu deleie, oarecii transgenici pot avea o nou gen adugat sau o extracopie a unei gene existente, n scopul de a investiga supraexpresia genei. Tehnicile transgenice ncep cu dezvoltarea construciei genei de fuziune n care ADNul transgenic este dirijat de un promotor specific. ADN-ul transgenic construit este apoi microinjectat n pronucleii ovocitelor fecundate de oarece, care au fost recoltate dup tratamente hormonale, de la femele de oareci la care a fost stimulat ovulaia Prin procese de recombinare aleatorii, gena de fuziune construit se integreaz n genom. n cazul n care transgena este integrat n genomul celulei nainte de prima diviziune, embrionii se dezvolt cu gene strine coninute n fiecare celul somatic i germinal. Oule microinjectate sunt transferate n oviductele femelei oarece fals nsrcinate, genetic normal. oarecele care se dezvolt din fiecare ou microinjectat este fondator de linie mutant.

Lezarea genelor int la Drosophila

Completarea cartografierii secvenializrii genomului [Adams MD, i colab., 2000] ofer acces nelimitat la toate genele de Drosophila melanogaster. Cu toate acestea i aproape dup un secol de genetic pe Drosophila, exist mai multe gene pentru care mutaiile corespondente nu sunt nc disponibile. Genele int n Drosophila sunt realizate prin recombinarea omoloag endogen germinal. Tehnica se aseamn cu cea de knockout int n celulele ES la oareci i poate viza o mutaie n orice locus din genomul Drosophilei.

Aceast metod implic trei componente: i) o transgen, care exprim o recombinaz de oc termic situs specific inductibil, (recombinaza FLP din drojdia de bere), ii) o a doua transgen, care exprim o endonucleaz de oc termic inductibil situs specific (ISceI), iii) un vector transgenic donator care poart situsurile de recunoatere pentru ambele enzime (dou situsuri FRT de 18 de perechi de baze i respectiv un situs I-SceI).

Inactivarea genelor int la petele zebr Recent genomul petelui zebra cu dimensiuni de 2 pn la 4 cm a fost complet

secvenializat. Genomul haploid are 1,7x109 bp, comparativ cu genomul uman care are 3 x109 bp. Date directe despre funcia majoritii celor 30 000 de gene din genomul petelui zebr sunt facilitate de dezvoltarea rapid a tehnologiei pe baz de morfoline, care poate fi aplicat la acest model de organism. Morfolinele sunt oligonucleotide antisens modificate, care sunt eficiente i specifice inhibitorilor translaionali cnd sunt injectate n oule fecundate ale petelui zebr.
Acestea se leag i inactiveaz secvene de ARNm selectate. Oligonucleotidele sunt asamblate n patru subuniti, fiecare dintre ele coninnd una dintre cele patru baze azotate: adenina, citozina, guanina i timina legate n poziia 6 la inelul morfolinelor, ceea ce confer o nalt rezisten nucleazic. Modelul animal este potrivit pentru gene importante implicate n procese privind dezvoltarea vertebratelor, cum ar fi somitogeneza i organogeneza.

Deleia tulpinilor int de Caenorhabditis elegans Genomul acestui nematod a fost, de asemenea
secvenializat i const din ase cromozomi ce au n total 97 Mb de perechi de baze (mrime haploid) i cuprinde 19 099 de gene. Nematodul adult, este format din exact 959 de celule somatice, ce includ 302 neuroni i 95 de celule musculare. Generaiile C. elegans au nevoie de un timp foarte scurt pentru a se dezvolta de la stadiul de ou fecundat pn la stadiul de adult matur. Trei zile de la fecundarea oului, viermele poate produce singur descendeni. Strategia de gene knock-out presupune deseori utilizarea sporadic de trimetilpsoralen, care este mutagen pentru un numr foarte mare de viermi. Expunerea la mutageni are ca rezultat mutaii aleatoare n celulele embrionare. De exemplu, un spermatozoid ar putea fi un mutant pentru o gen specific. Fertilizarea ovului de acest spermatoizoid va avea ca rezultat indivizi heterozigoi. Pentru c este un vierme hermafrodit care realizeaz singur fertilizarea, se vor produce ovule i spermatozoizi, care poart aceast gen mutant; un sfert din urmtorii si descendeni vor fi homozigoi pentru alela mutant, rezultatul fiind un fenotip specific. Un astfel de animal poate fi investigat n termen de trei zile, dac fenotipul mutant este complet.

Deleia tulpinilor int de Caenorhabditis elegans Screeningul viermilor expui la un mutagen se face dup cum urmeaz: viermii sunt
mprii n mai multe subculturi mici, permindu-le s aib descendeni. Cu o foarte mic frecven (aproximativ 1 din 200 000 genomuri mutagene) mutageneza va produce o deleie mic (100-1000 bp) la nivelul oricrei gene. Dac primerii PCR ce flancheaz zona genei de interes sunt folosii pentru a amplifica probe de ADN genomic, deleiile dintre primeri pot fi detectate, generndu-se ampliconi PCR de dimensiuni mai mici dect cei din ADN-ul genomic de tip slbatic amplificat. Astfel, ADN-ul, reprezentnd mai multe mii de genomuri cu mutaii poate fi supus screening-ului i ampliconii generai ce prezint deleii din aceste genomuri vor fi detectai. Dup ce un fragment de ADN care conine o anumit deleie este astfel evideniat, se pot identifica subculturile de viermi n care a avut loc deleia; viermii congelai din aceast subcultur pot fi decongelai, i animalele vii purttoare ale mutaiei, pot fi identificate. Indivizii mutanii care au fost detectai, pot fi recuperai i crescui n continuare pentru a studia funcia genei. La sritul anului 2002 aproximativ 10% din genele lui C. elegans au fost identificate prin mutaii. O treime din aceste gene au corespondent la mamifere, i nelegerea funciilor la C.elegans ne poate ajuta s stabilim dac acestea funcioneaz la animale mai evoluate.