UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERINAR A BANATULUI TIMIOARA

FACULTATEA TEHNOLOGIA PRODUSELOR AGROALIMENTARE

PROIECT LA: Microbiologia alimentelor: microorganism patogene n alimente Metode rapide de determinare a parametrilor microbiologici n apa (Streptococi fecali,Pseudomonas aeruginosa, Clostridium)

Coordonator: l.univ.dr. Corina Dana Mic

Masterand: Buzatu Loredana Anul I, SBPA

Timioara, 2013

Cuprins
1.Studiu privind activitatea microbiologica a apelor minerale din judetele Harghita, Mures si Timis....................................................................................................pag.3 1.1.Material si metoda........................................................................................pag.4 1.2.Concluzii.......................................................................................................pag.7 2.Evaluarea parametrilor indicatori igienico-sanitari ai apei lacurilor sarate de la Ocna Sibiului......................................................................................................pag.8 2.1.Concluzii.......................................................................................................pag.9 3.Bibliografie....................................................................................................pag.11

1.Studiu privind activitatea microbiologic a apelor minerale din judeele Harghita, Mure i Timi.
Apa mineral natural este o ap care are originea ntr-un acvifer sau zcmnt subteran, protejat de orice risc de poluare, provine dintr-o surs exploatat prin una sau mai multe emergene naturale sau foraje i este mbuteliat n apropierea sursei, cu precauii de igien deosebite. Productorul trebuie s vin n ntmpinarea creterii constante a cerinelor consumatorilor cu privire la calitatea i sigurana pe termen mai lung a alimentelor i buturilor. El nu poate limita ncrederea calitii controlului produsului finit, cum ar fi buturile mbuteliate sau produsele alimentare preparate. n schimb, n mod constant, trebuie s controleze materiile prime i efectueze controale de calitate dea lungul fluxului de producie dac dorete s evite pierderile ulterioare i eventualele plngeri ale consumatorilor. Testele microbiologice i n condiii aseptice joac un rol important n ctigarea ncrederii asupra calitii. n industria buturilor nealcoolice, calitatea microbiologic i igienic, incluznd stabilitatea biologic a produselor sunt un criteriu important pentru valoarea, preul produsului. Motivul: doar civa microbi sunt deseori de ajuns pentru a distruge cantiti mari de buturi. Cu toate c dezvoltarea exploziv a tehnologiei a redus riscul contaminrii

cu microorganisme de alterare, problema duratei proprii de valabilitate a luat noi dimensiuni ca rezultat a capacitii mari de producie posibil acum. Controlul de calitatea asupra mbutelierii i umplerii n termeni chimici i, mai ales, ai stabilitii biologice, trebuie adaptat la aceast dezvoltare prin metodele de ultim or. Cerinele pentru metoda practic a testului microbiologic sunt cele care permit determinri cantitative i reproductibile a urmelor de contaminare i care poate fi efectuat eficient i economic n condiii obinuite. Aceste cerine sunt ndeplinite optim prin metoda filtrrii cu membran. Principiul acestei metode este bazat pe concentraia microorganismelor de la probe relativ mari de pe suprafaa membranei filtrului i culturi ale acestor microorganisme pe un mediu nutrient sau un mediu de cultur agar.

1.1.MATERIAL I METOD
- ap mineral (surse diferite); - mediu de cultur folosit TERGITOL, TTC, AGAR, LACTOZ, TTC cu TERGITOL 7; - cartonae impregnate cu mediu nutritiv (conform normelor ISO 9308) Cartonaele impregnate cu mediu nutritiv (CMN)sunt utilizate mpreun cu metoda filtrului membran de peste 20 de ani cu succes, ele uurnd datorit manevrrii foarte practice numeroase procese de analiz microbiologic. CMN sunt medii de cultur sterile n form uscat, preambalate n cutii Petry sterile. Dup umezire cu 3,0-3,5 mL ap steril i distilat ele sunt gata de utilizare. Umezirea cartonaelor nutritive este optim cnd n zona de margine este clar vizibil un surplus de lichid.

- pomp de vid; - plnie de vid - 500 ml. Mod de lucru Pentru a obine rezultate relevante n controlul microbiologic, este necesar respectarea unor condiii de lucru care s asigure eliminarea de microorganisme strine, care influeneaz negativ rezultatele. Se va lucra ntr-un spaiu lipsit de cureni de aer. nainte de nceperea lucrului locul de munc va fi stropit sau ters cu soluie dezinfectant (alcool 70%). Aparatele de filtrare, pensete i foarfecele vor fi sterilizate nainte de utilizare printr-o metod uzual (flambare). Metoda filtrrii prin membran O membran de filtru cu mrimea porilor potrivit este plasat pe suportul unui filtru, iar proba de analizat este filtrat. n timpul procesului, microorganismele din proba de analizat sunt reinute pe suprafaa filtrului prin aciunea de selecie a membranei filtrante. Inhibitorii de cretere pot fi ndeprtai prin splarea suportului cu ap steril dup filtrare. Dup aceasta, membrana filtrant este pus pe un mediu de cultur i incubat. Nutrienii i metaboliii sunt schimbai printrun sistem de pori ai membranei filtrante. Avantaje: Comparativ cu metoda direct, pot fi analizate volume considerabil mai mari de prob. Acest efect de concentrare crete precizia determinrii microbiologice. Membrana filtrant cu coloniile dezvoltate poate fi pstrat ca o dovad permanent a testului. Coloniile vizibile pot fi raportate direct la volumul probei. Se pot da rezultate cantitative.

REZULTATE I DISCUII n lucrarea de fa am efectuat analize microbiologice la 3 probe de ap mineral provenite din trei areale geografice (Harghita, Mure i Timi).

Identificarea Escherichiei Coli i a numrului de Bacterii Coliforme Mod de incubare 24 de ore la 36C 2C. Mediul de cultur folosit Tergitol TTC. S-au folosit cartonae impregnate cu mediu nutritiv (conform normelor ISO 9308). Filtrul are culoarea verde cu caroiaj verde. Volumul probei filtrate este de 250 mL. Rezultatele obinute sunt comparate cu seturile de medii nutritive Sortarius. Pentru E. Coli avem i bacteriile coliforme: E.Coli si E. Coli si bacterii coliforme. Interpretarea rezultatelor obinute: Bacteriile coliforme genereaz colonii roii: Harghita - nu s-a identificat nimic; Mure - s-a identificat o cretere de opt colonii de Enterobacter aerogenes; Timi - nu s-a identificat nimic. E. Coli genereaz colonii galbene: Harghita - nu s-a identificat nimic; Mure - nu s-a identificat nimic; Timi - nu s-a identificat nimic. Determinarea streptococilor fecali (Streptococus Fecalis) Mod de incubare la 48 de ore la 36 C 2C, identificare i numr de enterococi intestinali (Streptococus Fecalis). Mediul de cultur folosit este dup Stonetz i Bartley (Azide). S-a lucrat cu cartonae impregnate cu mediu nutritiv conform normelor ISO 7899. Metoda folosit filtrare pe membran, filtru - steril de culoare verde cu caroiaj verde i porozitate de 0.45 m.
6

Enterococii servesc ca germeni indicatori pentru infestri fecale. Sunt mai puin sensibile la efecte chimice dect E. Coli i de aceea sunt detectabile o perioad mai lung de timp, de exemplu n apa rezidual i n apa clorinat. Interpretarea rezultatelor obinute: Enterococii formeaz colonii mici cu diametru de circa 1 mm colorat cu rou pn la maro cu margini netede. Harghita nu s-a identificat nimic (nici o colonie pe 250 mL prob filtrat); Mure nu s-a identificat nimic (nici o colonie pe 250 mL prob filtrat); Timi - nu s-a identificat nimic (nici o colonie pe 250 mL prob filtrat). Detectarea i numrul de Pseudomonas Aeroginosa: Mod de incubare la 48 de ore la 36 C 2C, mediul de cultur folosit Pseudomonas Agar baz/ CN-Agar, conform LOWBURY [1951]. Acest mediu de cultur este n conformitate cu recomandrile USP i APHA. S-a lucrat cu cartonae impregnate cu mediu nutritiv conform normelor ISO 12780 (Cetrimide). Metoda folosit - filtrare pe membran filtru steril de culoare alb cu caroiaj verde i porozitate de 0.45 m. Interpretarea rezultatelor obinute: Pseudomonas Aeroginosa formeaz colonii albastre cu diametrul 1-2 mm cu aur albastr i miros de flori de tei. n unele cazuri coloniile devin albastre-verzui, galben-verzui sau incolore. Alte pseudomonas dezvolt colonii albicioase. Harghita - nu s-a identificat nimic; Mure - nu s-a identificat nimic; Timi - nu s-a identificat nimic.
7

1.2.CONCLUZII
Analiznd rezultatele testelor privind activitatea microbiologic a apelor minerale din judeele Harghita, Mure i Timi se pot concluziona urmtoarele: - la identificarea Escherichiei coli s-a constatat c n toate cele trei judee studiate rezultatele testelor sunt negative; - la identificarea numrului de bacterii coliforme s-a constatat c n judeele Harghita i Timi rezultatele testelor sunt negative, iar la cele din judeul Mure sau identificat un numr de opt colonii de Enterobacter aerogenes; - la identificarea streptococilor fecali (Streptococus fecalis) nu s-a identificat nici o colonie pe 250 mL de prob filtrat; - la identificarea numrului de Pseudomonas aeroginosa s-a constatat c n toate cele trei judee studiate rezultatele testelor sunt negative.

2.EVALUAREA PARAMETRILOR INDICATORI IGIENICOSANITARI AI APEI LACURILOR SRATE DE LA OCNA SIBIULUI

Cunoaterea ncrcturii bacteriologice a apei, reprezint punctul de pornire pentru a putea aplica o tratare i protectie corespunztoare a apei n vederea prevenirii unor boli hidrice i asigurrii snttii tuturor acelora care le utilizeaz. Exist un risc epidemiologic de aparitie a unor boli la om, nu numai prin ingerarea n sistemul digestiv a unei ape necorespunztoare din punct de vedere calitativ dar i prin contactul tegumentului cu apa, datorit capabilittii unor germeni de penetrare a tegumentului. Pentru a estima prezenta agentilor patogeni n ap, am recurs la determinarea unor indicatori indirecti, ce denot contaminarea fecal i care indic anse crescute ca s existe i patogeni. Indicatorii de poluare fecal (numrul de colonii la 22 de grade si la 37 de grade , coliformi totali,coliformi fecali, streptococi fecali, bacterii sulfit - reductoare) sunt adecvati estimrii riscurilor de boli transmise prin ingestie sau contact cu apa. Determinarea parametrilor bacteriologici s-a realizat conform metodelor standardizate.

Variatia cantitativ a enterococilor fecali n apa lacurilor srate de la Ocna Sibiului Enterococii (streptococii fecali) sunt coci sferici sau ovalari, Gram pozitivi, imobili, aezati n perechi sau care dezvolt lanturi scurte care se dezvolt la temperatura de 44 de grade, n prezenta a 40% sruri biliare i a azidei de sodiu. Streptococii fecali au fost acceptati ca indicatori deosebiti de utili, ai polurii fecale n cazul ecosistemelor acvatice naturale. Aceste microorganisme arat a relatie strns cu riscul pentru sntate asociat mbierii n ap srat i ap dulce (WHO, 2000). Rata de mortalitate este sczut fat de cea a coliformilor, n ap srat, deci persistenta lor n probe este similar cu cea a agentilor patogeni, fiind indicatori ai unei poluri mai vechi. Enterococii se ncadreaz n limitele prevzute de legislatia privind apa de mbire (valoare de referint 100 streptococi fecali / 100 ml) pentru probele prelevate din lacurile srate, cu exceptia probelor din lacurile Mtelor i Pnzelor.In probele de ap analizate din Lacul Pnzelor, valoarea medie anual a enterococilor a fost de 281,33 / 100 ml, iar frecventa de identificare a fost la 100% din probe. Izvorul Lacului Horea a fost lipsit de enteroci, pe tot parcursul campaniilor de recoltare. Lacul Brncoveanu, Lacul Negru, izvorul Crian, Lacul Gura Minei i Lacul Ocnita au prezentat enterococi n numr mic, valoarea medie fiind sub 5/ 100 ml. Variatia cantitativ a bacteriilor sulfit reductoare Clostridium perfringens n apa lacurilor srate de la Ocna Sibiului Bacteria Clostridium perfringens are n mare msur origine fecal i este prezent ntotdeauna n ape uzate, dar nu se reproduce n sedimentele acvatice. Clostridium perfringens i n special sporii prezint o rezistent foarte mare n timp ndelungat i n conditii nefavorabile, ceea ce denot c prezenta lor n ap indic o poluare veche cu fecale. Lacurile care au prezentat numrul maxim de bacterii sulfitreductoare anaerobe, n luna august au fost Lacul cu Insul (284 clostridii / 100 ml) i Lacul cu Nmol (268 clostridii / 100 ml), Lacul Negru (176 clostridii/ 100 ml), Lacul Ocnita (148 clostridii/ 100 ml), Lacul Mtelor (128 clostridii / 100 ml), Lacul Gura Minei (84 clostridii/ 100 ml), Lacul Rndunica i Lacul Pnzelor (72 clostridii / 100 ml). Izvoarele lacurilor Horea i Crian ct i Lacul Brncoveanu au fost lipsite de aceste microorganisme att n luna mai ct i n luna august. Bacterii Clostidium perfringens au fost identificate n peste 75% din probele de ap prelevate din lacurile srate de la Ocna Sibiului n luna august i n 50% din probe n luna mai.

2.1.CONCLUZII
Lund n considerare valorile indicatorilor igienco-sanitari (bacterii coliforme, bacterii coliforme termotolerante, Escherichia coli i enterococi) ai apei srate din lacurile de la Ocna Sibiului n perioada 2006- 2008, am grupat lacurile n urmtoarele categorii: Lacuri care prezint valori foarte reduse ale parametrilor bacteriologici, indiferent de sezon, ceea ce indic c aceste lacuri nu sunt afectate de contaminarea fecaloid menajer - Lacul Brncoveanu, Lacul Negru i Lacul Fr Fund. Lacuri care prezint ncrcare bacterian redus, dar pentru care ar trebui aplicat un program de monitorizare complex pentru a se identifica sursele unor contaminri sezoniere, ce determin numrul mai ridicat de bacterii coliforme, n cazul izvoarelor Crian i Horea i al enterococilor n cazul Lacului cu Insul; Lacuri care prezint ncrctur bacterian moderat, crora prin aplicarea unui management corespunztor, identificarea surselor de contaminare i stoparea impactului asupra apei lacurilor, li s-ar mbuntti calitatea esential - Lacul cu Nmol, Lacul Rndunica, Lacul Gura Minei i Lacul Pnzelor; Lacul Mtelor, izvorul Cloca i Lacul Ocnita lacuri care prezint ncrcare bacterian maxim, n toate campaniile de recoltare, care sunt afectate de o contaminare continu, deoarece aici au fost identificai att indicatori ai polurii recente ct i cei care denot o poluare mai veche a apei. Identificarea n premier n Romnia, n ceea ce privete analiza bacteriologic a apei srate, a speciilor de bacterii apartinnd familiei Enteronbacteriaceae ( genul Serratia, Providencia, Enterobacter, Citrobacter, Escherichia, Proteus, Klebsiella, Salmonella, Vibrio.) este deosebit de important pentru c unele specii identificate sunt implicate n etiologia uman.

10

Bibliografie

1. http://www.revagrois.ro/PDF/2007s_47.pdf 2. http://www.usamvcluj.ro/files/teze/poplacean.pdf 3. http://www.uaiasi.ro/ro/files/doctorat/2009_dec_Nastase_Liliana_ro.pdf

11