78

Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 2, Nr. 1, Martie 2006

Tehnici microscopice paralele utilizate n analiza sedimentului urinar

The use of parallel microscopic techniques in the analisysis of the urinary sediment Sorin Gju*
Spitalul Clinic Judeean de Urgen Timioara, Laboratorul Central de Analize

Rezumat
Scopul lucrrii este de a prezenta diferitele tipuri de tehnici microscopice utilizate n laborator pentru examinarea sedimentului urinar. Microscopia n cmp luminos se mai folosete i astzi, dar elementele sedimentului urinar nu se difereniaz prea bine de fondul lamei, mai ales cele cu un indice de refracie mult mai sczut, cum ar fi cilindrii hialini i eritrocitele cu coninut redus de hemoglobin. Microscopia n contrast de faz se bazeaz pe folosirea unui condensator special i a unui obiectiv special. Condensatorul conine o diafragm special inelar care transform raza de lumin ntr-un con de lumin de intensitate mai redus iar obiectivul conine n planul su focal posterior un inel circular - inelul de faz care este acoperit de un strat subire i translucid de argint. Microscopia n lumin polarizat necesit un microscop echipat cu dou filtre de polarizare a luminii: unul numit polarizor i cellalt numit analizor. Bazndu-ne pe experiena noastr precum i pe datele existente n literatur putem s concluzionm c pentru identificarea cu precizie a tipurilor de elemente de sediment este necesar paralelismul tehnicilor microscopice.

Abstract
The aim of the work is to show the different types of microscopic techniques used in our laboratory for the examination of the urinary sediment. Bright field microscopy is still used today for the analysis of the urinary sediment, but with this type of microscopy the elements of the sediment are poorly differentiated from the background of the slide, especially the elements with a low refractive index (hyaline casts, red blood cells with low hemoglobin content). Phase contrast microscopy is based on the use of a special condenser and a special objective. The condenser has an annular diaphragm which transforms the incident light into a hollow cone of light. The objective contains in its posterior focal plane a circular ring, the so-called phase ring which is covered with a translucent
*

Adresa pentru coresponden: Sorin Gju, Str. Timi nr. 16-18, sc. B, apt. 37, Timioara, cod 300650, Jud. Timi, Romania Tel.: 0256/447039, Mobil.: 0744/771368, E-mail: soringiju@yahoo.com

Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 2, Nr. 1, Martie 2006

79

layer of silver. Polarized light microscopy requires a microscope equipped with two polarization filters: the polarizer and the analyzer. Based on our experience as well as on the references data we can say that for a certain identification of the urinary sediment elements it is necessary to us the parallelism of the microscopic techniques.

feritele tipuri de tehnici microscopice utilizate n laborator pentru examinarea sedimentului urinar. Microscopul optic este format, n esen, din dou sisteme de lentile cuplate 1,10 (Fig 1): obiectivul este un sistem de lentile cu distana focal de ordinul milimetrilor (mm), situat ctre obiectul examinat; obiectivul formeaz imaginea primar, real i mrit a obiectului examinat; ocularul este un sistem de lentile cu distana focal de ordinul centimetrilor, situat ctre ochiul examinatorului;el funcioneaz ca o lup care preia imaginea primar format n

Scopul lucrrii este de a prezenta di-

interiorul distanei sale focale i o transform n imagine virtual, mult mrit. Obiectivul microscopului este format din mai multe lentile convergente fixate la captul unui tub cilindric filetat ce se nurubeaz n revolver. Fiecare revolver prezint 4-5 orificii n care pot fi nurubate tot attea obiective cu putere de mrire i apertur numeric foarte diferit care pot fi schimbate prin rotirea revolverului. n complexul optic al obiectivului prima lentil sau primele grupe de lentile asigur puterea de mrire a lentilelor iar restul grupelor de lentile asigur coreciile aberaiilor sferice i cromatice. Obiectivele uscate sunt obiective mici, cu putere de mrire de 10 X, 20 X, 40 X,60 X: sunt numite astfel deoarece mediul care se interpune ntre lentila frontal a obiectivului i preparat este aerul. Obiectivele umede (cu imersie) sunt obiective mari, cu o putere de mrire de 90 X, 100 X, 120 X; sunt numite astfel deoarece mediul care se interpune ntre lentila frontal a obiectivului i preparat este un lichid de imersie1.(Fig. 2 - Fig. 3, Fig. 4)

Fig.1.Principiul de funcionare a microscopului optic: AB-obiectul, F1-focarul obiectivului AB-imaginea real, mrit i rsturnat a obiectului plasat la o distan mai mic dect distana focal a ocularului,mai aproape de focar. F2-focarul ocularului AB-imaginea virtual mult mrit i rsturnat, n raport cu obiectul.

80

Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 2, Nr. 1, Martie 2006

Microscopia n cmp luminos se mai folosete i astzi, dar elementele sedimentului urinar nu se difereniaz prea bine de fondul lamei, mai ales cele cu un indice de refracie mult mai sczut, cum ar fi cilindrii hialini i eritrocitele cu coninut redus de hemoglobin8. Din aceast cauz riscul omiterii unor elemente ale sedimentului urinar este destul de crescut 4,5. (Fig. 5, Fig. 6, Fig. 7a, Fig. 7b, Fig. 8). Microscopia n contrast de faz se

bazeaz pe folosirea unui condensator special i a unui obiectiv special. Condensatorul conine o diafragm special inelar care transform raza de lumin ntr-un con de lumin de intensitate mai redus. Obiectivul conine n planul su focal posterior un inel circular - inelul de faz care este acoperit de un strat subire i translucid de argint (Fig. 9). Principiul de funcionare Dup ce penetreaz obiectul de studiat, raza de lumin este compus din lumin direct

Fig2-Fig3.Principiul de funcionare al obiectivului cu imersie Uleiul de cedru dintre preparat i lentila frontal a obiectivului previne pierderea prin refracie a razelor cu valoare n formarea imaginii(razele 1-5),imaginea apare cu detalii pe cmp microscopic bine luminat. n lipsa uleiului de cedru, o parte din razele cu valoare n formarea imaginii sunt pierdute prin refracie n aer (razele 79), imaginea apare srac pe cmp microscopic insuficient iluminat.

Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 2, Nr. 1, Martie 2006

81

Figura 4. Obiectiv cu imersie (umed) Fig.5. Cristal de leucin i hematii. - parametrii gravai pe montura unui MO x 400. (colecie personal) obiectiv

Fig.6. Hematii dismorfe (acantocite)(1). MO x 640

Fig. 7a

Fig. 7b

Figura 7. Macrocilindru de tip ciros (1) cu capetele ptrate i cu cteva incluzii eritrocitare. Se observ omogenitatea i intensitatea culorii roii. Spre deosebire de cilindrul hialin (2) mai mic de asemenea colorat dar avnd o cloare roie mai pal a matricei hialine. Coloraie Sternheimer-Malbin. MO x 100 (fig.7a). MCF x 100 (fig.7b). (colecie personal)

Fig.8. Cilindru ciros convolut (1) alturi de cilindrii granuloi (2) i izolat un cilindru ciros simplu (3). MCF x 200 (colecie personal)

82

Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 2, Nr. 1, Martie 2006

Fig.9.Schema optic a microscopului cu contrast de faz (M.C.F) A-condensor B-diafragma anular a condensorului C-haloul conului de lumin D-obiectiv E-inel de faz cu un gel translucid de argint (punctat de aria gri)

Fig. 10a

Fig. 10b

Fig.10a, Fig.10b-Cilindri granulosi de tip II prezentnd o textur omogen alturi de cristale romboidale de acid uric. MO x 640 (Fig.10a), MCF x 640 (fig.10b), (colecie personal)

i din lumina difractat ai cror fotoni au interacionat cu obiectul de studiat. n timp ce lumina direct trece prin inelul de faz, lumina difractat trece doar prin zonele mai subiri din jurul inelului de faz. Aceast diferen ntre drumul parcurs de fiecare raz de lumin determin o diferen de faz ntre cele dou raze de aproximativ un sfert de lungime de und. n acest mod se obine un clar contrast ntre fondul lamei, care apare mai ntunecat i elementele care trebuie observate i care au o luminozitate mai accentuat. Aceast diferen de luminozitate este caracteristic pentru contrastul de faz. Principala caracteristic a

Fig. 11a

Fig. 11b

Figura 11. Macrocristal de fosfat bimagnezian avnd ncastrat un cristal de fosfat de calciu (de form neregulat). MO x 640 (Fig.11a), MCF x 640 (Fig.11b). (colecie personal)

Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 2, Nr. 1, Martie 2006

83

A-cele dou filtre de polarizare sunt aezate n paralel;lumina trece prin ambele iar cmpul microscopic este vizibil B-filtrul 2 este rotit cu 90o,lumina este absorbit de filtrul 2 iar cmpul microscopic se ntunec. C-un obiect (mediu) anizotrop este plasat ntre cele dou filtre,planul de vibraie a luminii care a trecut de filtrul 1 este schimbat i doar o parte din lumin ajunge la ochi artnd un obiect strlucitor birefringent pe un fundal negru. microscopiei n contrast de faz este prezena unui halou, o zon mai luminoas n jurul obiectelor mai ntunecate i o zon mai ntunecat n jurul obiectelor mai clare. Microscopul cu contrast de faz este mult mai util i mai bun dect microscopul cu cmp luminos. Majoritatea elementelor sedimentului urinar pot fi observate cu uurin folosind microscopul cu contrast de faz, inclusiv lipidele, cilindrii hialini i eritrocitele cu un coninut redus de hemoglobin. Microscopul cu contrast de faz este prevzut cu o lentil care centreaz inelul condensatorului pe inelul de faz al obiectivului (aa numitul telescop de faz sau microscop auxiliar) (Fig. 10a, Fig. 10b, Fig. 11a, Fig. 11b). Atunci cnd se trece la folosirea unui

Figura 12. Principiul microscopului cu lumin polarizat (M.L.P)

obiectiv mai mare, condensatorul inelar trebuie schimbat n acelai timp deoarece inelul diafragmei anulare i inelul obiectivului trebuie s se potriveasc. Din cauza acestui lucru microscoapele moderne sunt prevzute cu mai multe diafragme inelare i cu obiective corespunztoare. Cu ajutorul microscopului cu contrast de faz, examinarea n lumin polarizat este, de asemenea, posibil, dar rezultatele nu sunt att de bune ca i atunci cnd se folosete polarizerea luminii obinut folosind un microscop cu cmp luminos. Totui, avnd n vedere faptul c obiectivele de contrast de faz pot fi folosite i utiliznd condensatoarele obinuite, este suficient schimbarea condensatorului din contrast de faz n poziia pentru cmp luminos n vederea obinerii unei polarizri perfecte9. necesit un microscop echipat cu dou filtre de polarizare a luminii: unul numit polarizor i cellalt numit analizor (Fig. 12). Principiul de funcionare Razele luminoase nepolarizate ptrund n prisma Nicol printr-una din feele sale: ele sunt descompuse n dou raze care vibreaz n unghi drept una fa de cealalt: raz ordinal care se supune legilor refraciei i sufer o reflexie total; raz extraordinal care este transmis cu alt vitez i ale crei vibraii se stabilesc n planul figurii. Lumina transmis prin prisma Nicol este deci polarizat ntr-un singur plan. Dac un al doilea Nicol este plasat n serie cu primul i ntr-o poziie identic cu acesta, lumina polarizat este transmis. Prin rotirea analizorului cu 90, prismele Nicol devin ncruciate, cmpul vizual devenind ntunecat. n aceast situaie dac ntre cei doi Nicoli se interpune un corp birefringent, el devine strlucitor ceea ce indic faptul c a fost polarizat de lumina care l traverseaz. Dac se rotete nc o dat analizorul cu 90, cmpul devine obscur.

Microscopia n lumin polarizat

84

Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 2, Nr. 1, Martie 2006

Unghiul de rotaie al celei de-a doua prisme necesar pentru a stabili obscuritatea, msoar de-

viaia planului de polarizare al luminii prin obiectul interpus.

Fig. 13a

Fig. 13b

Fig. 13c

Figura 13. Macrocristal alturi de dou microcristale ovoidale de acid uric. MO x 640 (filtru verde) (Fig.13a), MCF x 640 (filtru verde) ( Fig.13b), MLP x 640 (Fig.13c). (colecie personal)

Fig. 14a

Fig. 14b

Fig. 14c

Figura 14. Agregat cristalin de oxalat de calciu monohidrat(cu aspect de trunchi de copac (1) i de halter sau papion (2).Unii autori consider c forma halter reprezint o variant mai aparte de oxalat de calciu dihidrat. MO x 640 (fig.14a), MCF x 640 (fig.14b), MLP x 640 (fig.14c). (colecie personal)

Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 2, Nr. 1, Martie 2006

85

Unul din filtre este plasat dedesubtul condensatorului i cellalt se plaseaz deasupra obiectivului. Rotind filtrul inferior cu 90o se obine ntunecarea cmpului microscopic. Cnd un obiect anizotrop este plasat ntre cele dou filtre, planul de oscilaie al razei de lumin este modificat n urma interaciunii cu particulele anizotrope ale obiectului aflat n studiu i numai o parte din raza de lumin ajunge la ochiul privitorului. Elementele care polarizeaz lumina sunt observate ca particule strlucitoare pe fond ntunecat. Acest fenomen este cunoscut sub numele de birefringen6,7. n sedimentul urinar exist cteva tipuri de cristale care polarizeaz lumina (sunt birefringente): acidul uric, oxalatul de calciu monohidrat, fosfatul amoniaco-magnezian (fosfatul triplu), fosfatul de calciu, cistina, leucina2,3 (Fig. 13a, Fig. 13b, Fig. 13c, Fig. 14a, Fig. 14b, Fig. 14c, Fig. 15a, Fig. 15b, Fig. 15c, Fig. 16).

unor varieti de cilindri i a eritrocitelor dismorfe7. Microscopia electronic cu transmisie (transmission electron microscopy) a fost utilizat pentru identificarea fibrilelor de amiloid n urina pacienilor cu amiloidoz renal. Totui, utilizarea ei n acest scop a fost contestat de alii. Aceast tehnic poate evidenia celulele tubulare necrotice din sedimentul urinar al pacienilor cu insuficien renal acut. De asemenea, se pot observa corpusculii de mielin n interiorul celulelor epiteliului tubular renal la pacienii cu nefrotoxicitate aminoglicozidic i cu boala Fabry7. Confocal scanning laser microscopy este o tehnic microscopic recent pus la punct, care este folosit i pentru studiul eritrocitelor urinare7.

Rezultate i discuii
1. Cristalele de acid uric sunt birefringente n proporie de 100%, furniznd imagini deosebite prin spectaculozitatea lor i prin aspectul policromatic, caracteristic pentru acest tip de cristale. Uratul amorf este, de asemenea, intens birefringent2 2. Fosfatul amoniaco-magnezian rotete planul luminii polarizate tot n proporie de 100% din cazuri.Formele tipice de fosfat triplu capac de sicriu apar de culoare galben-portocalie pe fondul ntunecat al lamei. Cristalele de fosfat de calciu sunt puternic birefringente6. 3. n cele mai multe cazuri, oxalatul de calciu bihidrat- plic de scrisoare nu este birefringent; aceasta apare n condiiile n care cristalele au dimensiuni mari sau se afl n numr foarte mare i formeaz agregate. Cristalele de oxalat de calciu monohidrat, cu form tipic de trunchi de copac sunt ntotdeauna birefringente, acesta fiind chiar un criteriu de difereniere a lor de hematii care nu rotesc planul luminii polarizate. Fosfatul amorf nu polarizeaz lumina3. 4. Cristalele de cistin prezente n urina

Alte tehnici microscopice

Microscopia cu imunofluorescen permite identificarea naturii matricei cilindrilor i a granulaiilor acestora. Mai recent a fost folosit pentru diferenierea cilindrilor nepatogeni de cei cauzai de glomerulonefrite i pentru identificarea pacienilor cu gamapatii monoclonale. Imunofluorescena folosind seruri mpotriva proteinelor Tamm-Horstfall a fost propus pentru folosirea n vederea diferenierii hematuriei glomerulare de cea neglomerular6,7 (Fig. 17). Microscopia n contrast de faz cu interferen (interference contrast microscopy) furnizeaz imagini tridimensionale ale obiectelor de studiat. Aceasta ofer imagini foarte frumoase, dar valoarea sa diagnostic nu este cu nimic superioar microscopiei n contrast de faz. Mai mult ns, are i o rezoluie limitat din punct de vedere al profunzimii penetrrii6,7 (Fig. 18). Microscopia electronic (scanning electron microscopy) folosete la identificarea

86

Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 2, Nr. 1, Martie 2006

Fig. 15a

Fig. 15b

Fig. 15c

Figura 15. Cilindru de urat izolat n sedimentul urinar al unui pacient cu nefropatie gutoas. MO x 640 (Fig.15a), MCF x 640 (Fig.15b), MLP x 640 (Fig.15c). (colecie personal)

Figura 16. Macrocristale de acid uric situate perpendicular unul pe cellalt. MLP x 640. (colecie personal)

Figura 17. Cilindru cu depozite de IgG. Imunofluorescen cu ser anti-IgG (x 400). (colecie personal)

Figura 18. Acantocite imagine tridimensional. MCI x 400. (colecie personal) (MCI - microscopie cu contrast de interferen) Axio Imager Microscopy from Carl Zeiss

Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 2, Nr. 1, Martie 2006

87

pacienilor cu cistinurie sunt intens birefringente iar cristalele de leucin, prezente n urina pacienilor cu insuficien hepatic, formeaz pseudo-cruci de Malta n lumin polarizat.

Bibliografie
1. 2. BUIUC, D.; NEGU , M. - Tratat de microbiologie clinic, Editura Medical, Bucureti, 1999. CAMERON J. S., MORO F. SIMMONDS H. A -Uric acid and the kidney.

Concluzii
Bazndu-ne pe experiena noastr precum i pe datele existente n literatur putem s concluzionm c, pentru identificarea cu precizie a tipulurilor de cilindri urinari, este necesar paralelismul tehnicilor microscopice. Microscopia cu contrast de faz se dovedete a fi util n identificarea cilindrilor hialini datorit indicelui de refracie foarte redus. Utilizarea luminii polarizate pentru studiul cristalelor prezente n sedimentul urinar prezint cteva avantaje: 1. Permite recunoaterea facil a elementelor birefringente prezente n sediment i completeaz tehnicile analitice de determinare a structurii cristalelor existente n urin. 2. Cu ajutorul ei poate fi confirmat pezena cristalelor care rotesc planul luminii polarizate (acidul uric, uratul amorf, oxalatul de calciu monohidrat, fosfatul triplu, fosfatul de calciu, cistina, leucina) 3. Contribuie la creterea preciziei n examinarea i recunoaterea cristalelor prezente n sedimentul urinar. 4. Fotografiile executate n microscopia n lumin polarizat reprezint un excelent material didactic.

Abrevieri
MO - microscopie optic obinuit MCF - microscopie cu contrast de faz MLP - microscopie n lumina polarizat.

GRUNFELD J-P., KERR N.S., RITZ E., WINERS Cr.G., (ed.) - Oxford Text Book of Clinical Nephrology, Oxford University Press, 1997. 3. COE,F-L.,PARKS,J-H.-Nephrolithiasis, Pathogenesis and treatment, Second EditionYear Book Medical Publishers, Inc. Chicago, London, Boca Raton, 1988. 4. FISCHBACH F. T. - Microscopic examination of sediment n FISCHBACH F. T. (ed.) - A Manual of Laboratory Diagnostic Tests.Second Edition. J.B.Lippincott Company Philadelphia.1984;2:141-148. 5. FOGAZZI G.B., FENILI - Urinalysis and microscopy A.M.,CAMERON J.S.,GRUNFELD J-P., KERR N.S., RITZ E.,WINERS Cr.G.,(ed.) Oxford Text Book of Clinical Nephrology, Oxford University Press ,1997. 6. FOGAZZI G.B.-Crystaluria;a neglected aspect of urinary sediment analysis-Nephrol Dial Transplant 1996; 11: 379-387. 7. FOGAZZI, G.B., PONTICELLI, C., RITZ, E. The urinary sediment, Second Edition, Oxford University Press, New York, 1999. 8. FOGAZZI G.B.,GRIGNANI S.-Urine microscopic analysis-an art abandoned by nephrologist?, Nephrol Dial Transplant 1998; 13:2485-2487; 9. FOGAZZI G.B.,PASSERINI P.,BAZZI M. et al.-Use of high power field in the evaluation of formed elements of urine.J Nephrol 1989;2:107112. 10. MOHAN G.- Fotografia la microscop, Editura tehnic, Bucureti, 1981.