Curs 1 28 02 2012

Enzime
La nivelul tuturor organismelor vii se desfasoara reactii chimice (biochimice) care trebuie sa asigure specificul viului, aceste reactii trebuie sa se desfasoare in timp si in sptiu coordonat in asa fel incat sa se obtina intermediarii metabolici, intr-o prima faza, si respectiv produsii finali de reactie strict necesari la nivelul celular. Termodinamic reactiile care se desfasoara in biosisteme poseda un minim de energie necesara desfasurarii , iar reactiile dependent de valoarea acestei energii pot fi reversibile sau ireversibile. Unele reactii biochimice sunt termodinamic defaorizate si din aceasta cauza ele se cupleaza constituind linii metabolice sau cicluri metabolice in care pe ansamblul acestora, sistemele sunt favorabile termodinamic; Toate sistemele vii poseda dinamism si sunt in raport cu mediul, deschise (schimba energie si materie in ambele sensuri-biosistemele spre mediu si invers) Intre reactanti si produsul de reactie exista intoteadeauna o bariera energetica care previne desfasurarea spontana si necontrolata a proceselor, simultan la nivelul tuturor organismelor vii materia se transforma echivalent in energie metabolica, strict necesara desfasurarii tuturor proceselor metabolice. Pentru desfasurarea reactiilor chimice din org vii este necesara prezenta catalizatorilor care se numesc biocatalizatori si care in limbaj curent se numesc enzime. Catalizatorul este aceea substanta care se adauga unui sistem reactant in cantitati mici si care are capacitatea de a marii viteza reactiilor termodinamic

posibile prin diminuarea energiei de activare a sistemului, la sfarsitul reactiei substanta regasindu-se calitativ si cantitativ (nu se transforma). Daca in chimia clasica o substanta catalizator poate intervenii intr-un proces chimic in conditii de pH variate si in conditii de temperaturi si presiuni diferite in raport cu conditiile normale, biocatalizatorii actioneaza in limite bine determinate de pH (dependent de natura tesutului unde actioneaza sau lichidului biologic) si in majoritatea cazurilor la valori ale temperaturii si presiunilor apropiate de valorile normale. Rolul enzimelor in procesele de biotransformare poate fi anabolic (biosintetic), catabolic( degradativ), anfibolic(biosintetic si degradativ). Dependent de etapele prin care un proces biochimic se desfasoara (coordonata de reactie) in procesul catalitic trecerea de la reactanti la produsul de reatie necesita depasirea unei valori minime de energie numita energie de activare (Ea) @@@Daca in sistemele necatalizate transf reactantilor in produsi necesita valori mari ale Ea ceea ce deter,mina ca putine molecule sa posede acest minim energetic si deci viit de reactie este mica , in conditii catalitice parametrul Ea este diminuat puternic Ea* si astfel un nr mult mai mare de molecule reactanti poseda minimul de energie in asa fel incat sa se transforme in produsi de reactie . Din aceste motive viit reactiilor in prezenta catalizatoriilor creste substantial in raport cu viteza aceluiasi sitem in conditii necatalizate. Enzimele sunt specii macromoleculare care in maj cazurilor sunt de natura glicoproteica si se cunosc cateva mii in natura dintre care cateva sute sunt studiate. Pt inceput enzimele cunoscute au priit denumiri triviale (nesugestive-pepsina tripsina) care nu indica nici o rel intre reactant produsul de reactie sau procesul catalizat. S a incercat ulterior de numirea enzimelor pornind de la denumirea reactantului sau a procesului catalizat carora li s au adaugat sufixul aza. In ultima perioada s a acceptat si s a propus denumirea sistematica conform comisiei de enzime in care se intalnesc 4 numere despartite fiecare printr un punct : x- clasa de enzime, m-subclasa, p-sub sub clasa, q-pozitia ocupata de enzima in sub subclasa. Toate enzimele cunoscute sunt reunite si clasificate in 6 mari clase 1 oxidoreductaze
2

2 transferaze 3 hidrolaze 4 liaze 5 izomeraza 6 ligaze

1.

2. 3. 4. 5. 6.

Oxidoreductazele sunt enzime capabile sa catalizeze transferul de electroni sau atomi de hidrogen (echivalenti de reducere) de la niv reactantilor (substraturilor) catre alti reactanti in vederea obtinerii produsului final Transfeazele catalizeaza transferul unor grupari funcionale (metil , hidroxil , carboxil, amino) de pe un substrat pe altul Hidrolazele sunt capabile sa catalizezel ruperea leg covalente dintr un substrat in prezenta apei! Liazele catalizeaza ruperea leg covalente din moleculele substraturilor in absenta apei Izomerazele catalizeaza transformarea unui izomer in altul Ligazele catalizeaza procesele de biosinteza (anabolice); = constituie legaturi covalente.

Substrat Este reactantul asupra caruia actioneaza enzima in procesul de transformare in vederea obtinerii produsului de reactie (S).Intre substrat si enzima se constituie interactii cu inalt grad de specificitate prin complementaritate intermediul interactiilor de natura slaba,( necovalente); la nivelul enzimei nu intreaga macromolec interact c substatul (molec de dimens mici) ci o zona special structurata din zona centrala a ghemului statistic din proteinenzima numit centru catalitic(situs); centrul catalitic este constituit din cateva resturi de aminoacizi care nu se asaza in poz adiacente in structura primara dar se asaza spatial in apropiere unul in raport cu celalalt.- nu sunt vecine! Orice modificare conformationala la nivelul ghemului statistic al proteinenzimei poate conduce la modificarea pozitiei resturilor de aminoacizi ce constituie centrul
3

activ si in aceste conditii interactia cu substratul se diminueaza sau nu se mai realizeaza, viteza de reactie (activitate enzimatica) scade sau dispare. Actiunea enzimei asupra substratului poate fi absoluta sau relativa de grup; cea absoluta se produce atunci cand enzima actioneaza numai asupra unuia si numai unua dintre compusii posibili sa actioneze ca substrat, actiunea relativa de grup presupune actiunea enzimei asupra mai multor moecule de substrat care poseda structuri apropiate (glucochiaza-actiune absoluta, hexochinaza-grup mare care se aseamana structural). Actiunea absoluta poate fi geometrica sau stereospecifica cataliza in cond geometrice presupune obtinerea unui singur izomer geometric sau actiunea directa asupra unuia dintre izomeri geometrici dintre izomerii geometrici posibili.(alfa beta gama) Stereospecificitatea presupune ca enzima actioneaza doar asupra unui izomer optic dintre multi posibili sau din procesul de cataliza rezulta unul si numai unul din izomerii optici posibili.(D sau L) Asupra unui substrat pot actiona mai multe tipuri de enzime iar produsii de reactie obtinuti sunt total diferiti conform fiecarei enzime............(schema slide r ch cooh)

Enzimele alosterice

In enzimologie se considera ca enzima actioneaza asupra substratului cu formarea in conditii de reversibilitate a complexului E S acesta datorita bogatiei energetice (instabilitatii termodinamice) se poate transforma ireversibil in enzima si produs de reactie, enzima eliberata putand sa reia ciclul catalitic practic la infinit E+S ES E+P Majoritatea enzimelor nu sunt constituite dintr un singur lant polipeptidic ci sunt constituite dintr un nr par de lanturi polipeptidice care adopta structura quaternara functionala, oricare dintre protomerii care constituie oligomerul nu constituie functie catalitica ; in cazul acestor enzime(alosterice)alaturi de centrul catalitic
4

exista cel putin un alt centru numit alosteric, la niv caruia nu interactioneaza cu substratul,alos-altul teric-spatiu; Daca la nivelul centrului activ intotdeauna actioneaza substratul la nivelul centrelor alosterice actioneaza efectorii alosterici care pot fi de natura exogena sau endrogena de natura organica sau anorganica. Efectorii alosterici de natura exogena si organica se numesc coenzime, aceste specii molec de dim mici au rolul de a interactiona cu proteinenzima careia ii modifica fie conformata fie configuratia si astfel faciliteaza deschiderea centrului activ in vederea interactiei cu substratul. Coenzima faciliteaza: schimb de proteine, de electroni, transfer de grupari functionale, torsionarea unor legaturi. Ansamblul constituit din efectorul alosteric si proteinenzima (apoenzima) constituie holoenzima; Doar holoenzima este activa din punct de vedere catalitic si niciodata coenzima nu poate exercita efect catalitic.

Polimorfism. Izoenzime

Complexele enzimatice de timp oligomer (struct coaternara) sunt constituite din protomeri (lanturi polipept individuale) si dupa nr acestora si dupa modul de interactie pot sa apara structuri oligomere apropiate structural care sunt biosintetizate si eliminate eliberate la nivelul aceluiasi tesut care catalizeaza aceeasi reactie chimica dar la niveluri diferite in organism.

In componenta oligomerului LDH se cunosc doua tipuri de protomeri de tip H si de timp M; Oligomerul este constituit din 4 protomeri dependent de modul in care acestia interact in vederea constituirii structurii active. -Izoenzime biosintetizeaza la acelasi nivel dar in zone diferite din organism
5

Acea specie cu rol catalitic care se aseamana prin sinteza si actiune cu o alta , se deosebeste de locul unde actioneaza; Diferentele de structura inregistrate la nivelul oligomerului datorita compozitiei in protomeri determina dezv unor proprietati fizice , fizico chimice si imunologice diferite. -

Specificul izoenzimelor: ele sunt codate gene distincte care se pare ca deriva de la o gena ancenstrala datorita faptului ca izoenzimele sunt de nat glicoproteica posttranslational, trebuie sa suporte glicozilarea si incarcarea cu acid sialic de a carei existenta depinde timpul de viata al enzimei. Comparativ cu albuminele care au timp de viata t1/p2 de 30 de zile, enzimele de viata au timp de viata cateva secunde; Enzimele multisubstrat sau cataliza multienzimatica presupune existenta unor procese chimice in care enzimele se asociaza de regula la nivel intracelular si actioneaza in cascada asupra substraturilor, produsul de reactie al unei enzime putand fi substrat pt urmatoarea enzima; prin intermediul acestui concept de cataliz enzimatica se micsoreaza substantial timpul de actiune iar sistemele enzimatice angrenate constituie linii sau cicluri metabolice.

Cinetica enzimatica Enzimele actioneaza asupra substraturilor in conditiile in care variatie intalchiei libere este negatica delta G<0; (sunt termodinamic posibie); in urma interact dintre enzima si substrat intotdeauna se coonstituie un complex care este bogat energetic
6

si instabil, care tinde sa se stabilizeze prin transform ireversibila in produs de reactie; in procesul de cataliza in urma interventiei enzimei asupra substatului acestua i se modifica structura transformandu se in prod de reactie si in acest od poseda caract fizico chimice diferite de ale substratului In procesul de cataliza exista un ansamblu de reactii simple in urma carora substratul se transf in prod de reactie; daca din acest ansamblu de reactii exista o reactie care poseda cea mai mica viteza de reactie (defavorabila energetic)aceasta reactie se numeste etapa determinanta de viteza; aceasta etapa este fundamentala in procesul catalitic deoarece stabileste vit de desf a intregului proces catalitic. Mereu in procesele catalitice enzima are concentratii deoseb de mici in rap cu substratul (se reface mereu) concentratii mici si constante in timp; in genere se def vit de reactie a unui proces catalitic fie variatia concentratiei produsului de reactie in timp fie variatia cu semn schimbat a concentr substratului in timp V=-dS/dt v=dP/dt

ES*-stare de tranzitie Ea-ererg de activare E-enzime ES-complex S-substrat Pprodus

2SCHEMe

Pt cataliza in care intervin enzime nealosterice (Michaelian) se considera ca viteza de desf a procesului catalitic V este direct proportionala cu vit maxima (VM) de desf a procesului catalitic, si concentratia substratului invers proportionala cu suma dintre concentr substatului si constanta Michaelisn-Menten (km-constanta)

V=Vmax[S]/Km+[S]

Transpunerea fizica a ecuatiei M-M prin reprezentarea vit e reactie in rap cu oncentratia substratului este sub forma unei curbe de timp hiperboloechilatera; La concentratii mici ale substratului exista o proportionalitate directa intre concentratia acestuia si vit de reactie, reactie de ordinul I ; IIn timp ce la concentratii foarte mari ale substratului procesul de cataliza atinge maximul de activitate (V max)cand orice cant de substrat adaugata nu va mai determina cresterea vit de reactie a procesului; in acest caz ordinul de reactie in rap cu substratul este 0; Intre cele doua ipostaze determinate de concentr substratului la concentratie foarte mica si constanta de enzima exista o zona intermediara unde ordinul de reactie este fractionar; La concentratii foarte mari de substrat se ajunge la saturarea enzimei cu substrat ceea ce inseamna ca intreaga cantitate de enzima este prezenta sub forma de complex ES si orice cant de substrat adaugat peste aceasta limita nu o sa conduca la modificarea vit de reactie. Curba de tip saturare. Pt fiecare enzima in parte in cond bine determ de mediu parametrul V max prezinta o valoare cinetica fundamentala. [S]>>> Km>>> V=Vmax [S]/[S] V=Vmax[S]/Km >> V=Vmax >> V+Vmax//km-constanta x [S]

Daca V = Vmax/2 Vmax/2=Vmax[S]/[S]+KM >> 2[S]=[S]+Km> [S]=km

Atunci cand vit instantanee este jumatate din vit maxima de desf a procesului catalitic concentr substratului este egala cu constanta M-M km. constanta M-M se numeste afinitatea enzimei in rap cu substratul si este cu atat mai mare (afinitatea)cu cat val este mai mica si invers, deeoarece cu cresterea Km este
8

necesara o cant mai mare de substrat pt ca vit procesului catalitic sa fie jumatate din vit maxima de desfasurare a catalizei

Schema VITEZA mol s-1

!Deoarece km este egal cu concentratia substratului , km are ca unit de masura unitatea de concentratie mol/litru.; Spre deosebire de enzimele Michaeliene enziele neMichaeliene (alosterice) prezinta variatia vit (activitatii enzimatice)in rap cu concentratia substratului sub forma unei curbe sigmoidale si nu hiperbola echilatera. In cazul enizimelor ne Mich la concentr relativ mici de substrat cresterea vit de reactie este slaba datorita acceului dificil al substratului la nivelul centrului activ. Odata patrunsa o molec de substrat la niv centrului activ se produce o modificare prin deschidere a ghemului statistic ce faciliteazapatrunderea celorlalte molec de substrat si in acest mod se inregistreaza o crestere accentuata a vit de reactie iar in final cand intreaga enzima este afgrenata sub forma de complxe ES se obtine vit max de desfasurare a procesului

In reprezentarea de tip M-M se obtin 2 parametrii fundamentali cinetici Vmax si Km din aceasta cauza s a trecut la obtinerea unei ecuatii cu reprezentare liniara prin inversarea ecuatiei M-M 1/V=km+[s]/Vmax[s] 1/v=km/Vmax.1/[S]+1/Vmax

Ecuatia obtinuta este ecuatia Lineweaver Burk, in care inversul vitezei variaza in rap cu inversul concentratiei substratului dupa o linie care nu trece prin origine

SCHEMA 2 pe pag
9

Prin liniarizarea ecuatiei M-M se poate determina foarte usor parametrul Vmax prin interceptia cu ordonata OY si respectiv constanta M-M (Km) prin interceptia cu abcisa OX (laborator)

Aceasta reprezentare este acceptata ca o simplificare in caracterizarea proceselor catalitice deoarece parametrii cinetici fundamentali pot fi determ fie direct fie indirect rapid . Vmax de desfasurare a unui proces catalitic este dependenta de concentratia enzimei cu care este direct prop prin factorul k2; constanta k2 se def ca fiind constanta catalitica si reprez vit react catalizate la concentratie unitara a enzimei. Din aceste considerente k2 constanta de vit are unit de vit 1/s iar inversul constantei catalitice 1/k2 are unit de masura secuna si se numeste ciclu catalitictimpul necesar enzimei pt a cataliza transformarea unui mol de substrat in prod de reactie dupa care aceasta este capabila sa ia ciclul catalitic . Din aceste considerente pt un sistem catalitic dat parametrul obtinut prin raportul dintre constanta de vit k2 si M-M este fundamental si trebuie sa aiba valori cat mai mari. K2 >>> 1/k2 mic Km <<< afinitate mare

10