Examenul microbiologic in infectiile gastrointestinale

Infectiile gastrointestinale au :
etiologie foarte variata mecanisme patogenetice variate diareea ca semn comun Cu unele variatii de la o zona geografica la alta, primele trei locuri intre agentii etiologici ai diareei acute sint ocupate in tarile dezvoltate de rotavirus, Shigella sau Salmonella si Campylobacter, iar in tarile in dezvoltare (exceptind ariile cu holera endemica) de E.Coli, Shigella si rotavirus . In Romania boala diareica acuta ocupa unul din primele locuri intre bolile infectioase care impun spitalizarea.

Genul Salmonella
Face parte din fam. Enterobacteriaceaelor. Sint bacili mobili, Gram-negativi. Habitat: in intestinul omului, animalelor, pasarilor. Caractere morfologice: Sint germeni mobili, cu cili peritrichi( dispusi de jur imprejur). Unle specii prezinta o pseudocapsula, antigenul Vi ( S. typhi, S.paratyphi A,B,C si S. typhi murium.

Caractere de cultura :
Se cultiva pe medii imbogatite, diferentiale, selective. Creste sub forma de colonii S. Este lactozo-negativa Rezistenta: Rezista 2-6 luni in apele poluate, fiind mai rezistenta decit Shigella. Isi poate cistige rezistenta la antibiotice.

Prelevarea si transportul probelor

Uzual se examineaza probe din scaunul eliminat spontan. Cind acesta este dificil de obtinut ( sugari, investigatii epidemiologice ) se folosesc prelevari pe tampon rectal sau prelevari cu sonda Nlaton din continutul colonului sigmoid. De la cadavru se examineaza continut intestinal. Probe din scaunul emis spontan: imediat dupa defecare se preleva cu lingurita sterile fragmente mucosangvinolente, flocoane riziforme, cind acesta exista, sau portiuni din diferite puncte ale unui scaun omogen. Proba in cantitate de cca 1 g se suspensioneaza in mediul de transport (ex. mediul Cary-Blair) dintr-un recoltor tipizat din masa plastica prevazut cu capac etans .

 Probe de scaun provocat prin purgatie sint indicate pentru depistarea portajului de enterobacteriipatogene sau la pacienti cu diaree cronica. Pentru aceasta un adult ingera 15 g sulfat de magneziu dizolvat in 250 ml apa. Doza la copii se adapteaza in raport cu virsta. Examenul microscopic trebuie efectuat in prima ora dupa prelevarea probelor de scaun. Mediul de transport Cary-Blair asigura supravietuirea principalelor enterobacterii patogene pina la 2448 ore, mai bine in conditii de refrigerare.

 Examenul microscopic al materiilor fecale ( MF ) Practicat pe probe de scaun emis spontan, asigura prin depistarea leucocitelor , diagnosticul precoce al diareii determinate de agenti enteroinvazivi: Shigella, E.Coli enteroinvaziv, Campylobacter etc.

 Examenul microscopic se realizeaza pe :

1) preparat intre lama si lamela : un flocon

selectat cu ansa din proba se suspensioneaza intr-o picatura de solutie 1 % albastru metilen pe o lama de microscop, se acopera cu lamela si se examineaza cu obiectivul de 10X, apoi cu obiectivul de 40X pentru diferentierea PMN de macrofage, identificarea elementelor parazitare; 2) frotiul Gram: la pacienti febrili, prezenta in scaun , alaturi de numeroase leucocite a unor bacilli gram-negativi fini, incurbati sau spiralati si a unei flore normale reduse are predilectie pozitiva satisfacatoare pentru enterocolita cu Campylobacter.

 La pacientii cu colita pseudomembranoasa postantibioticoterapie, frotiul Gram poate fi util cind deceleaza cu predominanta semnificativa stafilococi, una din cauzele acestui sindrom diareic .

 Depistari antigenice rapide : Teste accesibile laboratorului clinic, in masura in care dispune de reactivii necesari, sint: ELISA pentru depistarea enterotoxinelor citotoxice, a rotavirusurilor si virusurilor diareigene inrudite latexaglutinarea si coaglutinarea pentru depistarea enterotoxinelor citotoxice coloratia imunoflorescenta pentru depistarea tulpinilor enteropatogene de E.Coli .

 Coprocultura In diareile infamatorii coprocultura vizeaza enterobacterii patogene (Shigella, salmonella, Campylobacter, Yersinia) si conditionat patogene (tulpini enteroinvazive de E.Coli). In diareile neinflamatorii se urmareste prezenta salmonelelor, yersiniilor sau a unor bacterii conditionat patogene cu capacitati enterotoxigene (E.Coli, Klebsiella pneumoniae etc.) iar in conjunctura epidemica sau in zone portuare si prezenta Vibrio cholerae . Izolarea bacteriilor intestinale patogene se face pe medii selective adecvate pentru fiecare grup de specii .

Hektoen

- mediu de izolare pentru Salmonella si Shigella

Salmonella, Shigella, Yersinia

Prima zi se insaminteaza o placa cu mediu selectiv-in practica se foloseste mediul Hektoen: mediu selectivdiferential pentru izolarea patogenilor enterici direct din materiile fecale sau indirect din bulion de imbogatire. Isi datoreaza selectivitatea sarurilor biliare care inhiba cresterea bacteriilor gram-pozitive si intirzie dezvoltarea multor tulpini de enterobacterii comensale . Ex.: pe agar Hektoen :Shigella formeaza colonii verzi, Salmonella si Proteus verzi-albastre cu centrul negru, Escherichia, Enterobacter, Klebsiella formeaza colonii: galbene, portocalii sau roz ) si se se mai insaminteaza un tub cu mediu de imbogatire. Se incubeaza peste noapte la 37 C.

Shigella - colonii verzi

Salmonella colonii cu pigment negru

Salmonella pe mediu SS

E.Coli pe mediu Hectoen

Shigella pe mediu Hectoen

 Mediile slab selective prin saruri biliare si diferentiale prin lactoza, mediul Mac Conkey, Leiffson s.a. inhiba majoritatea bacteriilor gram-pozitive si izoleaza bacilii gram-negativi intestinali pe care ii diferentiaza in lactozo-pozitivi si lactozonegativi . Sint convenabile pentru izolarea shigelelor, organisme care pe medii mai selective pot fi inhibate.

 Mediile de imbogatire : bulionul cu selenit inhiba dezvoltarea bacteriilor grampozitive si limiteaza pentru 12-18 ore multiplicarea coliformilor si a speciilor de Proteus favorizind multiplicarea salmonelelor si, in masura mai mica a shigelelor

H2S UTILIZAREA ZAHARURILOR ( SALICINA, ZAHAROZA, LACTOZA)

SALMONELLA SALMONELLA - PUNCT NEGRU

ENTEROBACTER

E.COLI

 A doua zi se repaseaza din mediul de imbogatire pe mediul selectiv ales cu incubare peste noapte la 37C. Placa cu subcultura din mediu de imbogatire va fi urmarita pentru colonii lactozo-negative a treia si a patra zi , in eventualitatea ca pe placa cu primocultura nu s-a izolat Salmonella sau Shigella. Colonii lactozo-negative de pe placa cu primocultura pe mediul selectiv se repaseaza pe mediile TSI (triple sugar-iron), MIU (mobilitate indolureaza) , pentru triaj biochimic. Pentru izolarea yersiniilor incubarea placilor se prelungeste la temperatura camerei inca 24-48 ore.

 Mediul TSI este o geloza nutritiva ce contine trei zaharuri: glucoza, lactoza si zaharoza, rosu fenol ca indicator de ph si sulfat feros ca indicator pentru producerea H2S. Mediul se repartizeaza in coloana sau in panta; neinsamintat are culoarea rosie. Insamintarea se face cu ansa prin intepare in coloana si etalare pe panta. Dupa 18-24 ore la 37C se face citirea tuburilor.

TSI- Tri- Sugar- Iron H2S FERMENTAREA ZAHARURILOR

TSI NEDEGRADAT

TSI ZAHARURI DEGRADATE

TSI PRODUCEREA DE H2S

Coloana ( acida ) Panta rosie( alcalina)

Fermentata numai glucoza

Citirea reactiilor pe mediul TSI

Bule de gaz in coloana Glucoza fermentata cu producere de gaz Fermentate glucoza si lactoza/zaharoza

Coloana (acida)

 Citirea reactiilor pe mediul TSI

Coloana rosie ( alcalina ) Panta roise ( alcalina )

Tulpina nefermentativa

Innegrirea in coloana

Producere de H2S

 Salmonella : fermenteaza glucoza cu producere de gaz; nu fermenteaza lactoza/zaharoza, H2S: pozitiv Shigella: fermenteaza glucoza fara producere de gaz, nu fermenteaza lactoza/zaharoza; H2S: negativ Mediul MIU este o geloza nutritiva moale care contine uree si rosu fenol. Dupa insamintare prin intepare cu ansa in profunzimea coloanei de mediu, se ataseaza la dopul tubului o banda de hirtie indicator plasind la 1cm de suprafata mediului capatul impregnat cu reactive Ehrlich. Citirea se face la 24-48 ore de la incubare la 37C.

 Citirea reactiilor pe mediul MIU Interpretare : opacifiere limitata la traiectul de insamintare, coloana clara= Bacterie imobila Coloana opacifiata = Bacterie mobila Hirtia cu reactiv Ehrlich rosie=Indol present Hirtia cu reactiv Ehrlich galbena=Indol absent Coloana galbena ( acida )= Ureaza absenta Coloana rosie ( alcalina )=Ureaza prezenta

 Salmonella : mobila, indol : negativ, ureaza : negativ Shigella : imobila , indol : +/- , ureaza : negativ A treia zi se identifica tulpinile pentru care testele de triaj sugereaza o Salmonella sau o Shigella .

Vibrio cholerae
Izolarea si identificarea vibrionului este o urgenta epidemiologica. Flocoane riziforme din scaunul diareic sint insamintate in paralel pe o placa cu mediu selectiv ( agar cu saruri biliare si ph 9,0 ) .

 Coloniile suspecte aparute dupa 10-12 ore pe suprafata mediului selectiv sint identificate antigenic prin aglutinare pe lama cu ser antiholeric . In caz de aglutinare pozitiva, un diagnostic preliminar de holera(suficient in conjunctura epidemica ) poate fi stabilit pina in 24 ore.

 Identificarea biochimica o confirma pe cea antigenica. In final este identificat biotipul. Izolarea si identificarea vibrionilor holerici poate necesita un interval mai lung la pacientii cu forme atipice si la purtatori .

 Izolarea Campylobacter jejuni/coli se face pe medii special imbogatite si selective printr-o asociatie de antibiotice (Cefalotina, Vancomicina, Trimetoprim, Colistina) .

Campylobacter jejuni

Scanning electron micrograph of C. jejuni demonstrating the chracteristic curved rod shape of the organism.

 Placile se incubeaza la 42 C in conditii microaerofile (incinta cu 5 % oxigen, 10 % CO2 si 85 % azot). Identificarea izolatelor se face pe baza caracterelor de cultura, microscopice si biochimice.

 Izolarea fenotipurilor diareigene ale unor enterobacterii conditionat patogene . Proba trebuie insamintata pe un mediu cu selectivitate scazuta sau medii diferentiale . Identificarea tulpinilor enteropatogen de E.Coli are valoare in episoadele de gastroenterite (de obicei la copii sub 3 ani). Nu are valoare in cazuri sporadice. Prima zi: se insaminteaza proba pe un mediu diferential lactozat cu incubare peste noapte la 37C.

 A doua zi: se aglutineaza pe lama cu ser polivalent cca 10 colonii lactozo-pozitive, colonia care a aglutinat cu serul polivalent se reinsaminteaza. A treia zi se continua identificarea, pe lama si in tuburi, cu seruri monovalente, a subculturii pure.

Identificarea tulpinilor enterotoxigene de E.Coli.

Mai multe colonii se reinsaminteaza pentru a li se testa enterotoxigenitatea. Singurele teste accesibile laboratorului clinic sint coaglutinarea si latexaglutinarea. Identificarea tulpinilor enteroinvazive si enterohemoragice de E.Coli se face antigenic.

 Depistarea virusurilor diareigene majore in scaunul diareic se poate face prin imunoelectronomicroscopie, ELISA, RIA sau latexaglutinare .

 Investigarea microbiologica exhaustiva de prima intentie a bolii diareice este foarte costisitoare si nerealista. In fond, ingrijirea imediata a pacientului diareic nu depinde de diagnosticul etiologic. Prima urgenta este reechilibrarea hidroelectrolitica. Cu aceste precautii boala se vindeca adesea spontan in 24-72 ore. Coprocultura este fara impact terapeutic imediat: rezultate dupa 48-72 ore cind adesea pacientul este vindecat.

Coprocultura si examenul coproparazitologic se impun in urmatoarele circumstante :

cind exista necesitatea si posibilitatea tratamentului antimicrobian: shigeloze, holera, stadiul precoce al campylobacteriozei, gastroenterite salmonelozice sau cu Yersinia enterocolitica in conditii de risc bacteriemic (virste extreme, imunosupresati); infectii cu protozoare. cind exista un risc real de extindere a infectiei in colectivitati: diaree survenita in colectivitati de copii, imbolnaviri la personalul din alimentatia publica, comert alimentar, uzinele de potabilizare a apei

 investigarea diareii turistilor cind exista suspiciune de holera, amibiaza , giardiaza etc. la pacienti cu diaree persistenta mai mult de o saptamina sau resute dupa 2-3 saptamini la pacienti cu diaree survenita in cursul antibioticoterapiei si persistenta citeva zile dupa intreruperea medicamentului.

Examenul coproparazitologic
Indicatii Constituie examenul de baza pentru evidentierea unor infectii cu : - protozoare: amibioza, giardioza, coccidioze intestinale; - helminti: ascaridioza, tricocefaloza, strongiloidoza, anchilostomiaza, tenioze; Rezultatul examenului coproparazitologic trebuie sa mentioneze prezenta parazitului gasit si abundenta lui.

 Pentru protozoare ( in special, amibe ) rezultatul trebuie sa precizeze genul si specia parazitului gasit si stadiul sau evolutiv: forma vegetativa sau chistica. Mai trebuie notate si tehnicile folosite; se impune la ora actuala folosirea unui examen direct si cel putin a unei tehnici de concentrare . Controlul dupa tratament. Pentru majoritatea parazitozelor intestinale se indica efectuarea unui examen coprologic de control dupa 3 saptamini de la terminarea tratamentului.

 Tehnica examenului coproparazitologic . Recoltarea probei: examenul coproparazitologic se va efectua din materii fecale recoltate intr-un recipient curat, din sticla sau material plastic. Recipientul trebuie sa se inchida etans. Pentru un examen coproparazitologic de rutina se recomanda minimum 3 probe: 2 recoltate din scaun emis spontan si unul dupa administrarea unui laxativ. Daca se suspecteaza o amibioza, se recomanda examinarea a 6 probe: 3 din scaun emis spontan si 3 recoltate dupa laxativ.

 Examen direct : Preparatul direct efectuat din materii fecale emise de curind este examenul cel mai util pentru detectarea trofozoitilor mobili ai protozoarelor intestinale, poate evidentia si chisturi de protozoare, oua de helminti, precum si singe si mucus .

 Un preparat proaspat se efectueaza plasind o picatura de solutie fiziologica pe o lama de sticla, apoi cu o bacheta se adauga un mic fragment din proba de materii fecale, se omogenizeaza, apoi se acopera cu o lamela si se examineaza la microscop. Peste solutia fiziologica se poate adauga o picatura de solutie Lugol ( iodura de potasiu dizolvata in apa distilata si iod cristale ).