UNIVERSITATEA ALEXANDRU IOAN CUZA DIN IAI FACULTATEA DE BIOLOGIE

PROIECT IDEI nr. 1073/2009, COD CNCSIS 85

IMPACTUL UNOR SUPERANTIGENE DE ORIGINE BACTERIAN ASUPRA STATUSULUI FIZIOLOGIC AL ORGANISMULUI ANIMAL
- sintez lucrare faz final 2009 -

Director proiect, Lector dr. Lucian HRICU

1. STADIUL ACTUAL AL CERCETRILOR PRIVIND COMPLEXITATEA INTERACIUNILOR DINTRE SUPERANTIGENELE BACTERIENE I ORGANISMUL ANIMAL

Studiul efectelor superantigenelor bacteriene asupra organismului animal a suscitat interesul tiinific datorit efectelor lor puternice de stimulare a activitii limfocitelor T i de iniiere a unor condiii patofiziologice, incluznd ocul septic i bolile autoimune [12]. Dintre toate superantigenele, cele mai intens studiate sunt enterotoxinele produse de bacteria Grampozitiv - Staphylococcus aureus n special enterotoxinele stafilococice A i B (SEA / SEB) [12]. Ca activatori ai celulelor T, SEA i SEB acioneaz ntr-un mod unic, n sensul c activarea limfocitelor T se realizeaz independent de digestia intracelular, incluznd moleculele clasei II MHC [26]. Activarea limfocitelor T se realizeaz prin intermediul receptorilor T celulari (TCR) [6]. Numeroase studii experimentale, implicnd reactivitatea organismului animal fa de SEA i SEB, au demonstrat c aceast reactivitate este rezultatul unei sinteze rapide de citokine, precum i a factorului de necroz tumoral (TNF) i interleukinei (IL-2) la 1-2 ore dup administrarea lor [22]. Studii anterioare au evideniat faptul n urma administrrii SEA i a SEB, la oareci i la obolani au loc alterri ale funciilor endocrine, neurobiologice i comportamentale [9, 17]. De exemplu, prin administrarea SEB la oarecii BALB/cByJ, se produce stimularea axei hipotalamo-hipofizocorticosuprarenaliene (HHC), avnd ca rezultat creterea nivelului plasmatic al corticotropinei (ACTH) i al corticosteronului. Acest proces este dependent de corticoliberina hipotalamic (CRH) i de intensificarea ARNm CRH n hipotalamus, precum i n nucleul central al amigdalei. n mod similar, prin administrarea SEA la oarecii C57BL/6J se produce creterea nivelului plasmatic al ACTH i al corticosteronului [9]. Efectele neuroendocrine i comportamentale ale SEA si SEA se datoreaz specificitii particulare a fiecrui antigen fa de diferii receptori TCR. ntr-adevr, n cazul celulelor murine, regiunea lanului al receptorului TCR este codificat de cel puin 20 de gene diferite care pot da natere unor secvene unice de aminoacizi [5]. Acest lucru va determina diferenierea limfocitelor T (CD4 i CD8), n subtipuri, pe baza contribuiei genei V n construcia TCR. Enterotoxinele stafilococice A i B posed afiniti diferite pentru subtipurile V (SEB stimuleaz limfocitele T V8, n timp ce SEA prezint o afinitate ridicat pentru limfocitele T V3 i V11). Mai mult, efectele neuroendocrine ale SEA si SEB necesit prezena limfocitelor T funcionale, lucru confirmat prin imunosupresia cu ciclosporin A, aspect observat la oarecii transgenici RAG-1, lipsii de limfocite funcionale [9]. Efectele SEB au fost evideniate prin studii ale comportamentului de ingestie. Astfel, administrarea SEB determin o reducere semnificativ a consumrii unei soluii noi, iar efectul este meninut de noutatea contextului n care soluia este prezent. Expunerea animalelor de laborator la un context nou sau la excitani gustativi determin activarea axei HHC i creterea latenei de interaciune cu un nou stimul [11]. SEB determin efecte inhibitoare asupra proceselor de ingestie, inducnd anxietate. Animalele tratate cu SEB manifest o reactivitate ridicat la stimulii nconjurtori, ca n cazul rspunsurilor defensive. Tot dintre superantigenele bacteriene, mai sunt studiate i endotoxinele, cum ar fi lipopolizaharidele bacteriene (LPS), care sunt constitueni ai membranei bacteriilor Gram-negative (de exemplu, Escherichia coli). LPS au fost utilizate n multe studii neuro-imunologice datorit abilitii lor de a induce un rspuns rapid la

nivelul gazdei, ntr-o manier doz-dependent. LPS induc secreia citokinelor (TNF, IL-1, IL-6), care dac ar fi injectate n form lor pur ar mima unele efecte ale LPS n organismul gazd [1]. Numeroase studii au evideniat efectele LPS asupra funciilor organismului animal. De exemplu, prin administrarea LPS la obolani, s-au constatat modificri ale reactivitii fa de stres, disfuncii imunologice i creteri ale susceptibilitii la mbolnvire [3, 7, 14]. LPS pot induce alterri comportamentale, n special prin intermediul citokinelor n timpul dezvoltrii cortexului i n special a hipocampului, o regiune important n patologia comportamental i n bolile nervoase. Receptorii pentru citokine sunt distribuii la nivelul creierului, avnd o densitate ridicat n hipocamp [13]. Din acest motiv, hipocampul pare s fie vulnerabil la alterrile imune [13]. Numeroase studii au raportat ca infectarea neonatal cu Escherichia coli este asociat cu alterri ale proceselor cognitive (nvarea i memoria) [2]. Acest lucru poate fi evideniat numai dac LPS sunt administrate imediat dup procesul de nvare. Identificarea relaiilor neuro-imuno-endocrine va permite elaborarea unor noi modele experimentale de studiu a aciunii superantigenelor n raport cu imunitatea, metabolismul i funciile cognitive, i totodat va facilita descifrarea parial a mecanismelor complexe implicate n declanarea bolilor autoimune i neurodegenerative.

2. STABILIREA UNUI MODEL EXPERIMENTAL DE ANALIZ A RELAIEI TEMPORALE SUPERANTIGEN-RASPUNS IMUN 2.1. Imunizarea animalelor de laborator (obolani Wistar) prin administrarea acut sau cronic asuperantigenelor bacteriene i analiza fazelor de dezvoltare a rspunsului imun 2.1.1. Efectul administrrii sistemice acute a superantigenelor bacteriene asupra rspunsului imun n obolanii normali
Rspunsul neuroimunitar este caracterizat prin comunicarea bidirecional dintre imunocitele periferice i sistemul nervos central. Una dintre particularitile infeciei cu LPS const n declanarea rspunsurilor febrile i secreia corticosteronului, concomitent cu activarea sistemului imunitar, care va limita extinderea rspunsului inflamator [8, 18]. Inhibarea acestor rspunsuri imune va afecta semnificativ morbiditatea i mortalitatea asociat infeciei [8, 10, 15]. Lipopolizaharidul (LPS), bogat n acizi grai, are activitate similar cu endotoxina bacteriilor Gram-negative. Anticorpii, ca rspuns la infeciile cu LPS apar la 7 zile de la imunizare, ating nivelul maxim dup 1 lun i se menin 2-3 luni dup care dispar [24]. Astfel, administrarea acut a endotoxinelor bacteriene - lipopolizaharidelor - n timpul perioadei neonatale poate altera semnificativ rspunsurile febrile, imunologice, neuroendocrine, neurochimice i comportamentale ale animalelor de experien [3, 4, 19, 21]. De asemenea, LPS, derivat din bacteriile Gram-negative (Escherichia coli), reprezint unul dintre stimulii imunitari, a cror activitate este mediat de receptorii TLR-4 [23].

Materiale i metode Animale

Au fost utilizai 30 de obolani Wistar, cntrind 200-250g la nceputul experimentului. Animalele au fost ntreinute ntr-o camer special (Laboratorul de Fiziologie animal, Facultatea de Biologie, Iai), cu temperatur i lumin controlate (22C, ciclu de 12 ore ncepnd cu ora 8), i au avut acces liber la hran i ap ad libitum. obolanii au fost tratai n conformitate cu normele bioetice instituionale n vigoare i toate

procedurile efectuate au fost n concordan cu Directiva Consiliului European din 26 noiembrie 1986 (86/609/EEC).

Administrarea acut a LPS

Pentru studiul implicrii endotoxinelor bacteriene lipopolizaharidelor (LPS) - n modularea reactivitii imunologice, s-au luat n studiu dou loturi de animale. Loturile de animale luate n studiu au fost formate din cte 15 obolani, identici ca sex, greutate i vrst. Un lot de animale a constituit lotul de control (n=15), injectat acut, o singur dat pe parcursul experimentului, intraperitoneal (i.p.), cu o soluie fiziologic steril, administrat ntr-un volum de 0,1ml/100g/obolan. Un al doilea lot de animale (n=15), a fost imunizat prin injectarea intraperitoneal (i.p.) a unei soluii de LPS (lipopolizaharid de la Escherichia coli, serotipul 0111:B4, Sigma) (25g/250l soluie salin steril). Soluia de LPS a fost administrat o singur dat (acut) pe parcursul experimentului. Analiza fazei de dezvoltare a rspunsului imun s-a realizat n a 7-a zi de la imunizare. Toate animalele luate n studiu au fost sacrificate n a 7-a zi de la imunizare. Probele de snge au fost incubate timp de o or la temperatura camerei, apoi centrifugate pentru separarea serului (3000 rpm, timp de 10 minute). Serul a fost utilizat pentru determinarea cantitii totale de proteine serice, a globulinelor totale i a raportului albumin/globulin (metoda Weichselbaum testul biuret pentru proteine). Loturile de animale luate n studiu au fost cntrite la nceputul experimentului, naintea inducerii imunizrii i la finalul experimentului, pentru a analiza evoluia greutii lor n urma tratamentelor aplicate. Datele obinute au fost prelucrate i interpretate statistic utiliznd testul T-test a lui Student. Rezultatele sunt exprimate prin medie E.S.M. (eroarea standard a mediei). S-au considerat semnificative din punct de vedere statistic valorile lui p<0,05.

Rezultate
Administrarea acut a LPS, a determinat o scdere semnificativ (p<0,05) a nivelului proteinelor serice fa de lotul de control, sugerndu-se astfel implicarea superantigenelor n modularea proceselor de proteinosintez (Fig. 1). De asemenea, la 7 zile de la imunizare, administrarea acut a LPS a determinat o scdere semnificativ a globulinelor totale (p<0,03) fa de lotul de control, sugerndu-se astfel c o doz acut de LPS crete foarte mult susceptibilitatea la infecii (Fig. 2).
8 Proteine totale (g/ml%)
Globuline totale (g/ml%) 7 6 5 4 3 2 1 0 Control LPS

7 6 5 4 3 2 1 0 Control LPS

Fig. 1. Efectul administrrii acute a LPS (25g/kg) asupra coninutului total de proteine serice evaluat la 7 zile de la imunizare. Valorile sunt medii E.S.M. (n=15 per grup). *p<0,05 fa de Control.

Fig. 2. Efectul administrrii acute a LPS (25g/kg) asupra globulinelor totale evaluat la 7 zile de la imunizare. Valorile sunt medii E.S.M. (n=15 per grup). *p<0,03 fa de Control.

Raportul albumin/globulin nregistrat la 7 zile postimunizare, n condiiile administrrii acute a LPS nregistreaz creteri semnificative la animalele tratate (p<0,02), fa de loturile de control, ntrindu-se astfel ideea c lipopolizaharidele bacteriene, prin o singur expune a animalelor de laborator, poate induce alterri semnificative ale reactivitii imunologice (Fig. 3). Creterea raportului este n strns corelaie cu scderea globulinelor serice, indicnd aciunea antigenului asupra sistemului imunitar. Evaluarea greutii animalelor pe timpul dezvoltrii rspunsului imun indic o diminuare semnificativ a greutii animalelor (p<0,05) imunizate comparativ cu lotul de control (Fig. 4).

0,3 Raport albumin/globulin 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 Control

Diferena de greutate (g)

50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Control

LPS

LPS

Fig. 3. Efectul administrrii acute a LPS (25g/kg) asupra raportului albumin/globulin evaluat la 7 zile de la imunizare. Valorile sunt medii E.S.M. (n=15 per group). *p<0,02 fa de Control

Fig. 4. Efectul administrrii acute a LPS (25g/kg) asupra greutii corporale evaluat la 7 zile de la imunizare. Valorile sunt medii E.S.M. (n=15 per group). *p<0,05 fa de Control

2.1.2. Efectul administrrii centrale acute a superantigenelor bacteriene asupra rspunsului imun n obolanii normali
Numeroase studii experimentale au demonstrat c administrarea LPS, care mimeaz efectele infeciilor cu bacterii Gram-negative, poate determina o degradare semnificativ a neuronilor dopaminergici din substana neagr a obolanilor. Datorit degenerrii neuronilor dopaminergici intranigrali, LPS pot fi utilizate ca un agent important n elaborarea unui model experimental al bolii Parkinson. Odat cu degenerarea neuronilor dopaminergici intranigrali are loc formarea unor incluziuni denumite corpii Lewy, concomitent cu modificri ale imunitii manifestate prin activarea microgliei, creterea nivelului citokinelor proinflamatoare i permeabilizarea barierei hematoencefalice [25].

Materiale i metode Animale

Au fost utilizai 29 de obolani Wistar, cntrind 300-350g la nceputul experimentului. Animalele au fost ntreinute ntr-o camer special (Laboratorul de Fiziologie animal, Facultatea de Biologie, Iai), cu temperatur i lumin controlate (22C, ciclu de 12 ore ncepnd cu ora 8), i au avut acces liber la hran i ap ad libitum. obolanii au fost tratai n conformitate cu normele bioetice instituionale n vigoare i toate procedurile efectuate au fost n concordan cu Directiva Consiliului European din 26 noiembrie 1986 (86/609/EEC).

Administrarea acut a LPS

LPS a fost injectat stereotaxic n substana neagr (SN) a obolanilor normali. Toate procedurile chirurgicale s-au desfurat n condiii aseptice, iar animalele au fost anesteziate cu nembutal (45 mg/kg, g.c., i.p., Sigma). S-a preparat o soluie stoc de LPS (lipopolizaharid de la Escherichia coli, serotipul 0111: B4, Sigma) n concentraie de 1 g/l n soluie fiziologic steril. Injectarea stereotaxic a LPS n SN s-a realizat cu o microsering Hamilton (10 l), dup urmtoarelor coordonate stereotaxice: 5,5 mm posterior de bregma; 2 mm lateral de linia median; 7,4 mm ventral fa de suprafaa cortexului [16]. La fiecare injectare, acul seringei a fost lsat in situ, o perioad de 5 minute, n vederea evitrii refluxului substanei injectate. Etapele realizrii interveniilor neurochirurgicale pot fi vizualizate n figura 5. obolanii tratai cu LPS au fost divizai n dou loturi n funcie de doza de LPS administrat (3 g i 10 g). Loturile de control (fals-operate) au fost injectate stereotaxic n SN cu aceleai volume de soluie fiziologic steril. Analiza fazei de dezvoltare a rspunsului imun s-a realizat n a 7-a zi de la imunizare. La 7 zile postimunizare, toi obolanii au fost anesteziai, rapid decapitai i s-a realizat recoltarea sngelui. Probele de snge au fost incubate timp de o or la temperatura camerei, apoi s-a realizat separarea serului prin centrifugare la 3000 rpm, timp de 15 minute. S-a utilizat metoda SDS-PAGE pentru analiza proteinelor solubile [14], precum i densitometria n gel pentru determinarea maselor moleculare i cuantificarea cantitilor de proteine folosind tehnica IMAGE QUANT (GE Healthcare, Germania) [14]. Datele obinute au fost prelucrate i interpretate statistic utiliznd testul T-test a lui Student. Rezultatele sunt exprimate prin medie E.S.M. (eroarea standard a mediei). S-au considerat semnificative din punct de vedere statistic valorile lui p<0,05.

Rezultate
n probele de ser de la animalele tratate (obolani tratai cu LPS, 3 g i 10 g) i de la lotul de control au putut fi separate i vizualizate prin coloraia Commasie n jur de 20 de fraciuni proteice. Profilul electroforetic al proteinelor plasmatice indic o mare heterogenitate (Fig. 6), cu 4 fraciuni proteice predominante, reprezentnd circa 60-70% din coninutul total de proteine. n funcie de greutatea lor molecular, trei din aceste 4 proteine au fost recunoscute ca fiind albumine (61 kDa), gamma-globuline (lan greu 51 kDa i lan uor 21 kDa). A patra band este o protein necunoscut cu greutatea de 78 kDa luat n mod arbitrar i considerat a fi control. S-a realizat o curb etalon, utiliznd albumina seric bovin (ASB), iar prin densitometria gelurilor s-a putut cuantifica nivelul fiecrei fraciuni proteice. Astfel, n tabelul 1 se poate observa c injectarea obolanilor cu LPS (3g i 10g) a determinat o scdere semnificativ a albuminelor plasmatice (p<0,001) comparativ cu loturile de control, i o cretere semnificativ a nivelului gamma-globulinelor (lan greu - p<0,02 i lanul uor p<0,004).

Fig. 5. Etapele administrrii stereotaxice a LPS (foto originale)

LPS B

Control

A Fig. 6. Efectul administrrii acute a LPS (3 g i 10 g) asupra coninutului total al proteinelor serice evaluat la 7 zile de la imunizare. A- profilul electroforetic al proteinelor serice; B- diagrama procentelor coninutului total de protein rezultat din densitometrarea gelurilor acelorai probe (Control 27,03% - albumin; 17,62% gamma globuline (lan greu); 11,03% - gamma-globuline (lan uor); LPS 26,5% - albumin; 21,17% - gamma globuline (lan greu); 13,28% - gamma-globuline (lan uor)

Tabel 1. Efectele administrrii acute a LPS asupra coninutului proteinelor serice

LPS Media Control Protein necunoscut 78 kDa Albumine Gamma-globuline (lan greu) Gamma-globuline (lan uor) 13,88 E.S.M 0,28 Media 13,1 Control E.S.M 0,27 0,44 p

46,74 35,91 23,6

0,32 0,3 0,57

48,86 33,6 20,47

0,49 0,79 0,41

0,001 0.02 0,004

2.1.3. Efectul administrrii sistemice cronice a superantigenelor bacteriene asupra rspunsului imun n obolanii normali
Dup administrarea acut a LPS, animalele vor dezvolta un rspuns imun adaptativ avnd ca efect diminuarea activitii sistemului imunitar.

Materiale i metode Animale

Au fost utilizai 30 de obolani Wistar, cntrind 180-230g la nceputul experimentului. Animalele au fost ntreinute ntr-o camer special (Laboratorul de Fiziologie animal, Facultatea de Biologie, Iai), cu temperatur i lumin controlate (22C, ciclu de 12 ore ncepnd cu ora 8), i au avut acces liber la hran i ap ad libitum. obolanii au fost tratai n conformitate cu normele bioetice instituionale n vigoare i toate procedurile efectuate au fost n concordan cu Directiva Consiliului European din 26 noiembrie 1986 (86/609/EEC).

Administrarea cronic a LPS

Pentru studiul implicrii endotoxinelor bacteriene lipopolizaharidelor n modularea reactivitii imunologice, s-au luat n studiu dou loturi de animale. Loturile de animale luate n studiu au fost formate din cte 15 obolani, identici ca sex, greutate i vrst. Un lot de animale a constituit lotul de control (n=15), injectat cronic, intraperitoneal (i.p.), zilnic, timp de 7 zile, cu o soluie fiziologic steril, administrat ntr-un volum de 0,1ml/100g/obolan. Un al doilea lot de animale (n=15), a fost imunizat prin injectarea intraperitoneal (i.p.) a unei soluii de LPS (lipopolizaharid de la Escherichia coli, serotipul 0111:B4, Sigma) (250g/kg soluie salin steril). Soluia de LPS a fost administrat cronic, timp de 7 zile consecutive, pe parcursul experimentului. Analiza fazei de dezvoltare a rspunsului imun s-a realizat n a 7-a zi de la imunizare. Toate animalele luate n studiu au fost sacrificate n a 7-a zi de la imunizare. Probele de snge au fost incubate timp de or la temperatura camerei, apoi centrifugate pentru separarea serului (3000 rpm, timp de 10 minute). Serul a fost utilizat pentru determinarea cantitii totale de proteine serice, a globulinelor totale i a raportului albumin/globulin (metoda Weichselbaum testul biuret pentru proteine). Loturile de animale luate n studiu au fost cntrite la nceputul experimentului, naintea inducerii imunizrii i la finalul experimentului, pentru a analiza evoluia greutii lor n urma tratamentelor aplicate. Datele obinute au fost prelucrate i interpretate statistic utiliznd testul T-test a lui Student. Rezultatele sunt exprimate prin medie E.S.M. (eroarea standard a mediei). S-au considerat semnificative din punct de vedere statistic valorile lui p<0,05.

Rezultate
Administrarea cronic a LPS, a determinat o scdere semnificativ (p<0,004) a nivelului proteinelor serice fa de lotul de control, sugerndu-se astfel supresia semnificativ a proceselor de proteinosintez (Fig. 7). De asemenea, la 7 zile de la imunizare, administrarea cronic a LPS a determinat o scdere semnificativ a globulinelor totale (p<0,001) fa de lotul de control, sugerndu-se importana major a lipopolizaharidelor bacteriene n supresia vegetativ a reactivitii imunitare concomitent cu exacerbarea degradrii reactivitii imunitare (Fig. 8).

7 Proteine totale (g/ml%)

Globuline totale (g/ml%)

4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Control LPS

6 5 4 3 2 1 0 Control LPS

***

***

Fig. 7. Efectul administrrii cronice a LPS (250g/kg) timp de 7 zile consecutive asupra coninutului total de proteine serice. Valorile sunt medii E.S.M. (n=15 per grup). ***p<0,004 fa de Control.

Fig. 8. Efectul administrrii cronice a LPS (250g/kg) timp de 7 zile consecutive asupra globulinelor totale Valorile sunt medii E.S.M. (n=15 per grup). ***p<0,001 fa de Control.

Raportul albumin/globulin nregistrat dup 7 zile de administrare continu a LPS, nregistreaz creteri semnificative la animalele tratate (p<0,002), fa de loturile de control, confirmndu-se aciunea lipopolizaharidelor bacteriene n alterarea reactivitii imune (Fig. 9). Evaluarea greutii animalelor pe timpul dezvoltrii rspunsului imun indic o diminuare nesemnificativ a greutii animalelor imunizate comparativ cu lotul de control (Fig. 10).

0,4 Raport albumin /globulin 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 Control

***

45 Diferena de greutate (g) 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Control LPS

LPS

Fig. 9. Efectul administrrii cronice a LPS (250g/kg) timp de 7 zile consecutive asupra raportului albumin/globulin Valorile sunt medii E.S.M. (n=15 per grup). ***p<0,002 fa de Control.

Fig. 10. Efectul administrrii cronice a LPS (250g/kg) timp de 7 zile consecutive asupra greutii corporale Valorile sunt medii E.S.M. (n=15 per grup). *p<0,05 fa de Control

2.2. Administrarea diferitelor doze de superantigene bacteriene i stabilirea dozelor minime capabile de a induce dezvoltarea unui rspuns imun
n prezentul studiu s-au administrat acut (sistemic i central) i cronic (sistemic) diferite doze de LPS (3 g, 10 g, 25 g i 250 g) n obolanii normali. S-a constatat c la toate dozele reactivitatea imunologic a animalelor de laborator a fost semnificativ modificat, constatndu-se efecte semnificative inclusiv la cele mai mici doze (Fig. 11). Aceste modele experimentale vor putea fi utilizate n etapele urmtoare pentru studierea efectelor superantigenelor asupra statusului fiziologic al organismului animal.

Control 40 35 Globuline totale (g/ml%) 30 25 20 15 10 5 0 25g 3-10 g * *

LPS

* 3-10 g 250g

Fig. 11. Efectul administrrii acute (3g, 10g i 250g) i cronice a (250g/kg) LPS timp de 7 zile consecutive asupra globulinelor totale Valorile sunt medii E.S.M. (n=15 per grup). *p<0,05 fa de Control.

Discuii generale
Superantigenele bacteriene reprezint un grup de molecule care au suscitat interesul cercettorilor din diferite domenii tiinifice. nelegerea modului lor de aciune i a relaiei structur-funcie, va ajuta la elucidarea mecanismelor principale ale numeroaselor boli asociate infeciilor bacteriene. Este de remarcat faptul c superantigenele bacteriene au efecte diferite att in vivo, ct i in vitro asupra sistemului neuro-imuno-endocrin i c activitatea lor biologic ar putea depinde n mare msur de organismele-gazd, precum i de factorii de mediu (infecii virale, stres sau modificri hormonale) care ar putea intensifica interaciunile acestor antigeni cu organismele-gazd. Prezentul studiu evideniaz o serie de aspecte referitoare la efectele administrrii acute i cronice ale LPS asupra modulrii fazei de dezvoltare a rspunsului imun la obolanii masculi Wistar. Am evideniat faptul c administrarea unei singure doze de LPS (administrare acut) determin alterarea reactivitii imunologice, nregistrat la 7 zile postimunizare, caracterizat n special prin scderea semnificativ a cantitii totale a proteinelor serice, a globulinelor totale i creterea raportului albumin/globulin. Prin administrarea sistemic acut a unei doze sczute de LPS (25 g/kg) se poate realiza un model experimental de studiu al activrii imune. LPS acioneaz asupra receptorilor specifici TLR-4 din diferite organe, incluznd i endoteliile. Ca rspuns, se induce sinteza i secreia interleukinei IL-1. De asemenea, se produce creterea concentraiei plasmatice a corticotropinei (ACTH) i a corticosteronului, avnd ca rezultat activarea axei HHC. Prin activarea acestei axe i creterea concentraiei corticosteronului urmat de inhibarea activitii leucocitelor i a altor compenente a sistemului imunitar (n cazul de fa a globulinelor totale). n alt studiu este indicat faptul c stimularea cronic cu LPS (250 g/kg) pe o perioad de 8 zile, crete semnificativ concentraia corticosteronului plasmatic [20],

avnd ca efect intensificarea stimulrii axei HHC, concomitent cu intensificarea stresului. Din acest considerent, n prezentul studiu, posibila scdere a nivelului globulinelor totale, cantitii totale de proteine serice i creterea raportului albunin/globulin, prin injectarea reperat (cronic) a LPS, timp de 7 zile, s-ar datora intensificrii stresului (stres cronic), ca rspuns al activrii axei HHC. Unii autori au demonstrat c administrarea LPS, poate determina o degradare semnificativ a neuronilor dopaminergici din substana neagr a obolanilor, determinnd simptoame caracteristice maladiei Parkinson [25]. O serie de maladii neurodegenerative (Parkinson, Alzheimer) sunt asociate cu activarea sistemului imunitar. Astfel, n prezentul studiu prin injectarea acut a LPS (3g i 10 g), a avut loc activarea sistemului imunitar n sensul creterii semnificative a nivelului globulinelor (lan greu i uor) la 7 zile postimunizare. De remarcat este faptul ca prin aciunea specific a LPS asupra neuronilor dopaminergici din substana neagr a obolanilor, se poate crea un model experimental al bolii Parkinson. nelegerea proceselor n care aceste rspunsuri imune determin neurodegenerescen poate servi la elaborarea unor strategii terapeutice caracteristice unor maladii neurodegenerative (Parkinson, Alzheimer).

Concluzii
Pe baza datelor obinute n prezentul studiu, se poate afirma c prin administrarea superantigenelor se poate constitui un model experimental de studiu al activrii imune. Administrarea sistemic acut i cronic a superantigenelor alterez semnificativ reactivitatea imunologic, n timp ce administrarea central acut a LPS intensific rspunsul imun al animalelor de experien.

Bibliografie
[1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] A.K. Abbas, A.H. Lichtman, J.S. Pober, Cytokines, Cell. Mol. Immunol. 3 (1997) 250-277. S.D. Bilbo, L.H. Levkoff, J.H. Mahoney, L.R. Watkins, J.W. Rudy, S.F. Maier, Neonatal infection induces memory impairments following an immune challenge in adulthood, Behav Neurosci 119 (2005) 293-301. L. Boisse, A. Mouihate, S. Ellis, Q.J. Pittman, Long-term alterations in neuroimmune responses after neonatal exposure to lipopolysaccharide, J Neurosci 24 (2004) 4928-4934. S. Ellis, A. Mouihate, Q.J. Pittman, Early life immune challenge alters innate immune responses to lipopolysaccharide: implications for host defense as adults FASEB J 19 (2005) 1519-1521. R. Gonzalez-Quintial, R. Baccala, R.S. Balderas, A.N. Theofilopoulos, V beta gene repertoire in the aging mouse: a developmental perspective, Int. Rev. Immunol. 12 (1995) 27-40. S.C. Hong, G. Waterbury, C.A. Janeway Jr., Different superantigens interact with distinct sites in the Vbeta domain of a single T cell receptor, J. Exp. Med. 183 (1996) 1437-1446. L. Hritcu, M. Stefan, Acute lypopolisaccharide adminstration impaired imuune responsiveness in normal rats., Analele stiintifice ale Universitatii Alexandru Ioan Cuza, Sectiunea Genetica si Biologie Moleculara TOM X (2009) 63-68. Q. Jiang, A.S. Cross, I.S. Singh, T.T. Chen, R.M. Viscardi, J.D. Hasday, Febrile Core Temperature Is Essential for Optimal Host Defense in Bacterial Peritonitis, Infect. Immun. 68 (2000) 1265-1270. N. Kawashima, A.W. Kusnecov, Effects of staphylococcal enterotoxin A on pituitaryadrenal activation and neophobic behavior in the C57BL/6 mouse, J. Neuroimmunol. 123 (2002) 41-49. M.J. Kluger, W. Kozak, C.A. Conn, L.R. Leon, D. Soszynski, "Role of Fever in Disease", Ann.N.Y.Acad.Sci. 856 (1998) 224-233. C. Kopp, E. Vogel, M.C. Rettori, P. Delagrange, B. Guardiola-Lemaitre, R. Misslin, Effects of melatonin on neophobic responses in different strains of mice, Pharmacol. Biochem. Behav. 63 (1999) 521-526. M. Llewelyn, J. Cohen, Superantigens: microbial agents that corrupt immunity, Lancet Infect. Dis. 2 (2002) 156-162. A.M. Lynch, C. Walsh, A. Delaney, Y. Nolan, V.A. Campbell, M.A. Lynch, Lipopolissacharideinduced increase in signalling in hippocampus is abrogated by IL-10-a role for IL-1 beta?, J Neurochem 88 (2004) 635-646.

[14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26]

M. Mihasan, L. Hritcu, V. Artenie, A. Ciobica, M. Stefan, L. Gorgan, Bacterial lypopolisaccharide enhanced immunological responsiveness in exposed rats, Analele stiintifice ale Universitatii Alexandru Ioan Cuza, Sectiunea Genetica si Biologie Moleculara TOM X (2009) 41-44. S. Nadeau, S. Rivest, Glucocorticoids Play a Fundamental Role in Protecting the Brain during Innate Immune Response J Neurosci 23 (2003) 5536-5544. G. Paxinos, C. Watson, A.P. 2005, Sidney, The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, Academic Press, Sidney, 2005. A. Rossi-George, F. LeBlanc, T. Kaneta, D. Urbach, W.A. Kusnecov, Effects of bacterial superantigens on behavior of mice in the elevated plus maze and lightdark box, Brain Behav Immun 18 (2004) 4654. B. Schobitz, J.M.H.M. Reul, F. Holsboer, The role of the hypothalamic-pituitary-adrenocortical system during inflammatory conditions, Critical Rev Neurobiol. 8 (1994) 263-291. N. Shanks, R.J. Windle, P.A. Perks, M.S. Harbuz, D.S. Jessop, C.D. Ingram, S.L. Lightman, Early-life exposure to endotoxin alters hypothalamic-pituitary-adrenal function and predisposition to inflammation, Proc Natl Acad Sci U S A 97 (2000) 5645-5650. L. Soto, A. Martn, S. Milln, E. Vara, A. Lpez-Caldern, Effects of endotoxin lipopolysaccharide administration on the somatotropic axis, J Endocrinol. 159 (1998) 239-246. S.J. Spencer, J.G. Heida, Q.J. Pittman, Early life immune challenge - effects on behavioural indices of adult rat fear and anxiety, Behav. Br. Res. 164 (2005) 231-238. A. Sundstedt, M. Dohlsten, G. Hedlund, I. Hoiden, M. Bjorklund, T. Kalland, Superantigens anergize cytokine production but not cytotoxicity in vivo, Immunology 82 (1994) 117-125. R.I. Tapping, S. Akashi, K. Miyake, P.J. Godowski, P.S. Tobias, Toll-Like Receptor 4, But Not TollLike Receptor 2, Is a Signaling Receptor for Escherichia and Salmonella Lipopolysaccharides, J. Immunol. 165 (2000) 5780-5787. F. Toma Sacarea, Bacteriologie medicala, Ed. Universitatii Oradea, 2006. S. Wang, J.Y. Yan, Y.K. Lo, P.M. Carvey, Z. Ling, Dopaminergic and serotoninergic deficiencies in young adult rats prenatally exposed to the bacterial lipopolysaccharide, Brain Res. 1265 (2009) 196204. J.J. Yagi, S. Rath, C.A. Janeway Jr., Control of T cell responses to staphylococcal enterotoxins by stimulator cell MHC class II polymorphism, J. Immunol. 147 (1991) 1398-1405.