Organite implicate n sinteza i turnoverul macromoleculelor Traficul vezicular intracelular

RIBOSOMII RETICULUL ENDOPLASMIC APARATUL GOLGI LIZOSOMII

Sinteza, sortarea i traficul intracelular al macromoleculelor aspecte generale

Cea mai mare parte a proteinelor i lipidelor membranare sunt sintetizate la nivelul RE. Transportul proteinelor membranare ce au ca destinaie RE, AG, lizosomii sau MP necesit prezena unor secvene semnal specifice n structura proteinei nou-sintetizate. n absena unor secvene semnal, proteinele sintetizate la nivelul RE urmeaz urmtorul parcurs:
REAGvezicule de secreiesuprafaa celular

Prin fuzionarea veziculelor desprinse din AG cu MP, n structura acesteia se adaug fragmente noi de membran. Pentru a mpiedica creterea suprafeei celulare n urma proceselor de fuziune de membrane, suprafaa celular este reciclat prin endocitoz.

RIBOSOMII (Corpusculii lui Palade)

Ribosomii reprezint componentele celulare (complexe macromoleculare ribonucleoproteice/organite nedelimitate de membrane) la nivelul crora se desfoar sinteza de proteine (translaia informaiei din mARN). Ribosomii maturi din celulele EK (80S) sunt formai dintr-o subunitate mic (40S) i o subunitate mare (60S). Fiecare subunitate este un complex ribonucleoproteic format la rndul su din diferite tipuri de ARN i proteine specifice: Subunitatea 60S (GM 2.800.000 Da): 5S ARN (120 nucleotide) 5,8S ARN (160 nucleotide) 28S ARN (4700 nucleotide) 49 proteine Subunitatea 40S (GM 1.400.000 Da): 18S ARN (1900 nucleotide) 33 proteine

Comparaia dintre ribosomii procariotelor i eucariotelor

Ribosomii celulelor eucariote

Prin asamblarea celor dou subuniti rezult un edificiu multimolecular (organit nedelimitat de endomembran), cu geometrie sferoidal, cu dimensiunea de 22 nm x 32 nm ce reprezint sediul biosintezei proteinelor.

Ribosomii din celulele eucariote de tip 80S sunt localizai n citoplasm. Ei pot fi separai din punct de vedere spaial n 2 tipuri de populaii: ribosomi liberi, neataai de membrane (se numesc liberi, n ciuda faptului c sunt asociai de componente ale citoscheletului) i ribosomi ataai de membrana RE (pe faa citoplasmatic). ntre cele 2 tipuri de populaii de ribosomi nu exist diferene structurale, ntruct fac parte din acelai stoc intracelular. Factorul care decide dac un ribosom va fi ataat la membran sau va fi liber nu are legtur cu anumite caracteristici ale ribosomului, ci cu secvena de aminoacizi a proteinei la a crei sintez particip ribosomul respectiv.
n celulele EK, un alt tip de ribosomi (70S) sunt localizai n matricea mitocondrial i sunt responsabili de sinteza proteic la nivel mitocondrial.

 Proteinele sintetizate de ribosomii ataai de membrana RE includ: proteinele transmembranare din MP, proteinele din RE, complexul Golgi, endosomi, proteinele lisosomale, precum i proteinele de secreie. Ribosomii liberi sunt responsabili de sinteza proteinelor din citosol, a proteinelor membranare periferice i a unor proteine ce au ca destinaie nucleul, mitocondriile i peroxisomii.

- Premiul Nobel pentru Fiziologie i Medicin 1974:

Albert Claude, Christian de Duve, George E. Palade, pentru descoperirea ribosomilor

- Premiul Nobel pentru Chemie 2009:

Venkatraman Ramakrishnan, Thomas A. Steitz, Ada E. Yonath, pentru descrierea ribosomilor la nivel atomic In 1955 Palade, i colaboratorul su Philip Siekevitz, au identificat moleculele ataate la RER ca fiind ribosomi, i ulterior au artat natura lor ribonucleoproteic. In colaborare cu ali cercettori Palade a identificat funcia ribosomilor (sediul sintezei proteinelor celulare). Palade a avut o contribuie important n investigarea funciei ribosomilor i a altor componente celulare. In 1974 i-a fost decernat Premiul Nobel pentru Fiziologie i Medicin (alturi de Albert Claude and Christian De Duve).

George Palade, the Ribosome and the Nobel Prize

RETICULUL ENDOPLASMIC

RETICULUL ENDOPLASMIC
RE este un ansamblu de membrane intracitoplasmatice, prezent n toate celulele eucariote, care particip la numeroase procese biochimice eseniale pentru viaa celulei. La nivelul RE se desfoar biosinteza i modificarea-post translaional a proteinelor (att a proteinelor destinate diferitelor compartimente celulare, ct i a proteinelor de secreie ce sunt eliminate n mediul extracel). De asemenea, la nivelul RE se realizeaz biosinteza lipidelor membranare. n celulele animale membranele RE pot reprezenta mai mult de 50% din totalitatea membranelor. Reeaua de membrane ale RE a fost evideniat pentru prima oar de ctre Porter i colab. (1953) prin examinarea la microscopul electronic a macrofagelor cultivate in vitro.

Izolarea microzomilor provenii din RER i REN prin centrifugare n gradient de densitate.

Funciile reticulului endoplasmic

Sinteza i depozitarea lipidelor
RE particip la sinteza i depozitarea lipidelor. Sinteza lipidelor membranare (fosfogliceride, compui steroidici, triacilgliceroli) are loc att la nivelul RER ct i la nivelul REN.

Detoxifierea celular
REN este implicat n reacii de detoxifiere ce au ca scop transformarea unor compui toxici liposolubili (fiziologici, patologici sau farmacoligici n compui netoxici (metabolii hidrosolubili) prin aciunea citP450/NADPH citP450 reductazei.

Depozit dinamic de Ca2+

Reticulul endoplasmic - depozit dinamic de Ca2+

REN conine proteine ce funcioneaz ca pompe pentru ionii de Ca2+ ce particip la transportul i stocarea ionilor de Ca2+ n lumenul reticulului endoplasmic. Aceast rezerv de calciu este eliberat n citosol ca rspuns la diverse semnale. REN din fibrele musculare poart numele de reticul sarcoplasmic i se dispune sub form de tubuli (sarcotubuli) aezai n iruri, ce mbrac ca nite manoane miofibrilele. Reticulul sarcoplasmic este implicat n procesul de contracierelaxare al fibrelor musculare. Dinamica acestui proces se realizeaz prin cooperarea mai multor componente moleculare. O componente important este calsechestrina, protein cu mare afinitate pentru ionii de calciu, aflat n cantitate mare n lumenul organitului.

Calsechestrina (monomer)

Reticulul sarcoplasmic dispoziia sub form de tubuli ce mbrac ca nite manoane miofibrilele. RS funcioneaz ca depozit dinamic de Ca2+ n cursul procesului de contracie-relaxare.

Funciile prii rugoase a RE

Principalele funcii ale RER se refer la: Biosinteza proteinelor: (i) proteine membranare (ii) proteine destinate s funcioneze n RE, n aparatul Golgi, sau lizosomi (iii) proteine destinate exportului (proteine de secreie) Prelucrarea a proteinelor nou-sintetizate n RE: transformri asupra proteinelor care au loc concomitent cu translaia (modificri co-translaionale). Un exemplu l constituie iniierea glicozilrii proteinelor care const n grefarea unor secvene oligozaharidice pe resturi de Asn ale catenei polipeptidice n curs de sintez (legturi Nglicozidice). Transformri dup terminarea translaiei (modificri post-translaionale); de ex. ancorarea GPI. Sortarea proteinelor i transportul vezicular ctre aparatul Golgi.

Sinteza proteinelor de ctre ribosomii ataai de membrana RER

Rolul secvenei semnal n transferul ribosomilor angajai n traducere ctre membrana RE

Glicozilarea proteinelor n RER

secvena consens Asn-X-Ser(Thr)- ....

dolichol-difosfooligozaharid

-(GlcNAc)2Man9Glc3

Sinteza precursorului oligozaharidic pe carrierul lipidic (dolichol)

Modificri post-translaionale: ancorarea proteinelor de lipidele membranare n RE ancor (gliparea)

glicofosfatidilinozitolic (GPI)

Structura ancorei glicofosfatidilinozitolice (ancora GPI)

Asistarea proteinelor n RE pentru plierea corect

n lumenul RE sunt condiii oxidante, ceea ce favorizeaz formarea punilor S-S-. Adoptarea structurii teriare a proteinelor prin formarea de puni S-S- este mediat de enzima numit numit protein disulfid izomeraza. Asistarea plierii proteinelor este realizat de proteine chaperone. Proteina chaperone cu cea mai larg sfer de aciune din RE este proteina de legare (prescurtare BiP, binding protein; denumire alternativ Grp78). BiP complexeaz proteinele nou-sintetizate translocate n lumenul RE i le elibereaz numai dup definitivarea plierii corecte. Proteinele pliate incorect sunt returnate de BiP transloconului i sunt expulzate n citosol, intrnd n procesul de degradare proteolitic mediat de proteasom.

Inserarea n bistratul lipidic al proteinelor transmembranare (topologia proteinelor TM)

Topologia proteinelor inserate n bistratul lipidic prin segmente TM cu conformaie de -helix este determinat de combinaii ale unor secvene de aminoacizi hidrofobi (sau preponderent hidrofobi) start-transfer i stop-transfer, ce alterneaz n structura primar a proteinei cu secvene de aminoacizi hidrofili. Procesul este controlat la nivelul transloconului din membrana RE (reglarea nchiderii i deschiderii porului transloconului).

Biogeneza membranelor n RE
Rennoirea membranelor necesit sinteza de noi molecule lipidice. n celulele animale la nivelul RE sunt sintetizate clasele majore de lipide membranare (fosfolipide, colesterol) sau precursori ai unora dintre ele ce sunt ulterior prelucrai n aparatul Golgi (ceramide - precursori ai sfingomielinelor i glicolipidelor). Biosinteza fosfolipidelor se desfoar n mai multe etape catalizate de enzime membranare, numai la nivelul feei citosolice a membranei RE. Pentru a echilibra compoziia n fosfolipide a celor dou straturi moleculare ale bistratului membranei RE, la nivelul acesteia acioneaz un traslocator fosfolipidic (scramblaza) ce mediaz transferul fosfolipidelor de pe un strat molecular pe cellalt (micri de flip-flop), echilibrnd distribuia fosfolipidelor pe cele dou straturi moleculare ale bistratului lipidic (transferul are loc cu o frecvena de 100.000 de ori mai mare dect micarea de flip-flop spontan) .

Translocatori fosfolipidici: scramblaza din membrana RE i flipaza din membrana plasmatic

Distribuirea lipidelor nou sintetizate ctre sistemele membranare din celul

Lipidele sunt distribuite endomembranelor (aparat Golgi, lizosomi) i membranei plasmatice pe calea transportului vezicular. Pentru nveliul nuclear distribuirea lipidelor se face prin difuzie lateral. n cazul mitocondriilor i peroxizomilor importul lipidelor membranare se desfoar prin intermediul unor proteine de transfer. Acestea sunt proteine hidrosolubile ce au capacitatea de a transfera moleculele individuale de fosfogliceride ntre membrane. Ele pot extrage un fosfoglicerid dintr-o structur membranar i l pot elibera altei membrane. Proteinele de transfer sunt specifice pentru un anumit tip de fosfoglicerid ntruct interacioneaz specific cu capul polar al acestuia.

APARATUL GOLGI (Complexul Golgi)

 Aparatul Golgi, denumit i complex Golgi, este un organit celular ce ndeplinete un rol important n procesele de biogenez a membranelor, precum i n procesele de prelucrare, sortare i distribuire a proteinelor ce au ca destinaie anumite compartimente intracelulare sau mediul extracelular. Aadar complexul Golgi face parte din sistemul de organite implicate n traficul intracelular al membranelor i macromoleculelor.
Acest organit a fost pus n eviden pentru prima dat de ctre cercettorul italian Camillo Golgi (1898), n celulele Purkinje, prin tehnica histochimic numit impregnare argentic. Structura intracelular s-a dezvluit ca o dantel esut n jurul nucleului. Golgi a denumit-o, pe baza morfologiei, aparat reticular endocelular, sau aparat reticular intern.

n 1906 Camillo Golgi a primit mpreun cu Santiago Ramon y Cajal Premiul Nobel pentru Fiziologie i Medicin, ca recunoatere a contribuiei sale privind evidenierea aparatului reticular n celulele sistemului nervos.

Camillo Golgi

n 1954 a descris pentru prima dat ultrastructura n imagini de microscopie electronic. Studiile de microscopie electronic au artat c aparatul Golgi este format dintr-un complex de membrane, dispuse de obicei ntre reticulul endoplasmic i membrana plasmatic. Caracteristica structural a aparatului Golgi o constituie prezena cisternelor aplatizate (numite i saculi), mai dilatate la capete. Mai multe cisterne turtite aezate unele peste altele (n stiv) constituie un dictiozom.

Organizarea structural a aparatului Golgi

Aparatul Golgi este structurat ca o stiv de cisterne. Cisternele aparatului Golgi sunt deseori curbate, avnd o fa convex (numit i fa formatoare, proximal sau faa cis), orientat spre nucleu i reticulul endoplasmic i o fa concav (numit i fa matur, distal sau fa trans) orientat spre membrana plasmatic. Se consider c aparatul Golgi are 3 compartimente distincte: reeaua cis, pachetul de cisterne i reeaua trans. n ceea ce privete stiva de cisterne, se opereaz cu noiunile: cisterne cis, cisterne mediene i cisterne trans, dup cum acestea sunt orientate ctre faa cis-Golgi, ctre faa trans-Golgi, sau sunt aezate n zona din mijloc a stivei. Numrul i distribuia cisternelor aplatizate depind de tipul celular, starea funcional i etapa ciclului celular, fiind de regul cuprins ntre 4-8. Golgi este caracterizat din punct de vedere ultrastructural prin polaritate morfologic, dar i prin polaritate funcional.

Modelul organizrii structurale a aparatului Golgi

Ultrastructura aparatului Golgi:

(A) reprezentare schematic; (B) imagine de microscopie electronic.

Aparatul Golgi face parte din sistemul de organite implicate n traficul intracelular al membranelor, care ncepe cu reticulul endoplasmic i se termin la membrana celular sau la componentele sistemului endolizosomal.
1. nveli nuclear 2. Por nuclear 3. Reticul endoplasmic rugos 4. Reticul endoplasmic neted 5. Ribosomi ataai de RE 6. Macromolecule 7. Vezicule de transport 8. Complex Golgi 9. Faa cis a complexului Golgi 10. Faa trans a complexului Golgi 11. Cisterne ale complexului Golgi

Funciile aparatului Golgi

Aparatul Golgi joac un rol fundamental n: 1. Procesarea lanurilor oligozaharidice legate Nglicozidic n RE pe proteinele nou-sintetizate, conducnd la formarea glicoproteinelor cu oligozaharide complexe i oligozaharide cu coninut ridicat de manoz (nalt manozilate). 2. Formarea structurilor O-glicozidice inserate pe Ser sau Thr. 3. Sinteza glicozaminoglicanilor i asamblarea proteoglicanilor (molecule ce se formeaz prin ataarea unor lanuri polizaharidice de dimensiuni mari de structuri proteice prin legturi O-glicozidice). 4. Biosinteza sfingomielinelor i glicolipidelor prin modificarea ceramidelor produse n RE. 5. Sulfatarea unor glucide (att din glicozaminoglicani, ct i din unele glicoproteine);

6.

7. 8.

Sortarea i transportul proteinelor la destinaia final din celul, i eliminarea proteinelor de secreie n mediul extracelular prin secretare (exocitoz). Biogeneza lizosomilor. Biogeneza i traficul intracelular al membranelor pe calea transportului vezicular.
De menionat c toate aceste procese se petrec ntr-o succesiune ordonat de etape, bine controlate i reglate, pe msur ce substanele primite de la RE avanseaz prin aparatul Golgi dinspre faa cis, ctre faa trans. Ordonarea etapelor este posibil datorit polaritii morfologice i polaritii biochimice.

Glicozilarea proteinelor n aparatul Golgi

Una dintre principalele funcii ale aparatului Golgi const n prelucrarea i definitivarea structurilor N-glicozidice. Procesul de glicozilare ncepe n RE, procesul de glicozilare fiind nespecific. Din structura oligozaharidic iniial adugat n RE, dup prelucrri n AG rmne o regiune core: 2GlcNac 3Man. Calea de sintez a catenelor glucidice este o cale nalt ordonat, ce se desfoar secvenial n compartimente diferite ale aparatului Golgi, unde fiecare cistern conine propriul set de enzime de procesare, cataliznd o anumit etap a glicozilrii. Aadar, n reeaua cis i cisternele nvecinate se desfoar primele etape de glicozilare, iar enzimele implicate n etapele finale sunt localizate n cisternele i reeaua trans. Secvene glucidice devin structuri nalt manozilate sau structuri complexe.

Procesarea secvenelor oligizaharidice n compartimentele complexului Golgi

Oligozaharidele complexe i oligozaharidele cu coninut mare de Man legate prin legturi N-glicozidice de Asn, caracteristice glicoproteinelor de la mamifere.

Biosinteza structurilor O-glicozidice

Structurile O-glicozidice se produc n ntregime la nivelul cisternelor complexului Golgi.
Tipuri de structuri O-glicozidice produse n complexul Golgi:

Sortarea i transportul proteinelor

Proteinele nou-sintetizate sunt regsite n aparatul Golgi dup 15-60 min de la momentul sintezei lor n RE, iar dup 1-2 ore n mediul extracelular, la nivelul MP sau n diferite compartimente intracelulare. Pe baza studiilor experimentale a fost elaborat un model de transport care arat c exist un flux al proteinelor nou-sintetizate din RE prin complexul Golgi, spre destinaii anumite destinaii intracelulare. Acest flux se realizeaz atunci cnd nu exist semnale de retenie n structura proteinelor respective care s determine localizarea (reinerea) lor n RE sau n aparat Golgi. La nivelul aparatului Golgi proteinele sunt sortate ctre diferite destinaii intracelulare. Procesul de sortare depinde de prezena n structura proteinelor a unor secvene specifice de aminoacizi sau a unor grupri de natura glucidic care funcioneaz ca semnale de sortare. Aadar, sortarea proteinelor ce au ca destinaie un anumit compartiment celular necesit prezena secvenelor semnal specifice. n absena unei secvene semnal, proteinele sintetizate la nivelul RE urmeaz urmtorul parcurs: RE Aparat Golgi vezicule de secreie suprafa celular

Sortarea i transportul proteinelor din RE n AG

Traficul ntre RE i complexul Golgi se realizeaz prin vezicule i prin intermedierea unor structuri veziculotubulare (prescurtat VTC, de la Vesicular Tubular Clusters), cunoscute i sub numele ERGIC (de la Endoplasmic Reticulum-Golgi Intermediate Compartment) a cror prezen a fost evideniat n preparatele de microscopie electronic. Transportul ntre RE i Golgi respect un mecanism tip suveic. Prin acest mecanism se realizeaz pe de o parte exportul proteinelor destinate s ajunge n alte locaii din celul (calea anterograd), iar pe de alt parte returnarea componentelor rezidente n RE (calea retrograd), adic a acelor componente care scap accidental n microveziculele de transport n timpul selectrii i segregrii materialului exportat, nmuguririi i desprinderii structurilor de transport din membrana RE.

Transportul ntre RE i Golgi respect un mecanism tip suveic fiind evideniat: - o cale anterograd (REAG)
- o cale retrograd (AGRE) 1989 Jennifer Lippincott-Schwartz Transportul direct (calea anterograd) este blocat de brefeldina A (antibiotic produs de fungul Eupenicillium brefeldianum)

Motive de aminoacizi cu rol de semnal de retenie, sau returnare n RE

(i) -Lys-Asp-Glu-Leu-COO-, deci KDEL (evident n captul carboxi-terminal, dup cum rezult din descriere) pentru proteinele solubile n lumen, (ii) motivul di-lizin (KK) pentru proteinele transmembranare tip I (aflat n endodomeniul carboxi-terminal) (iii) motivul di-arginin (RR) pentru proteinele transmembranare tip II (aflat n endodomeniul aminoterminal). Aceste motive opereaz pe de o parte n meninerea n RE a proteinelor rezidente, neimplicate n transportul ctre Golgi, dar i n returnarea proteinelor ce asigur selecia, segregarea i transportul.

Traficul ntre reeaua trans-Golgi i lizosom

Markerul Man-6-fosfat din structura proteinelor cu destinaie lizosomal.

Structuri cu nveli de clatrin. Fiecare subunitate de clatrin e format din 3 lanuri grele i 3 lanuri uoare, rezultnd o structur cu 3 brae numit triskelion.

Asamblarea subunitilor de clatrin

Asamblarea i dezasamblarea nveliului de clatrin n cursul formrii veziculelor. Asamblarea clatrinei induce curbarea membranei i nmugurirea ei. nveliul de clatrin este rapid ndeprtat dup desprinderea veziculei. Adaptinele se leag de clatrin i mediaz recrutarea selectiv a moleculelor de transportat interacionnd cu receptorii corespunztori.

Calea secretorie celular se definete ca o succesiune de

procese prin care se realizez: Biosinteza moleculelor de secreie; Prelucrarea (maturarea), sortarea i condensarea n vezicule de secreie; Secreia propriu-zis (constitutiv sau semnalizat)

Formarea veziculelor de secreie

Exocitoza veziculelor de secreie

Eliberarea insulinei din veziculele secretorii din celulele -pancreatice

Transportul vezicular ntre membrana donor i membrana int

Direcionarea transportului vezicular prin proteine SNARE specifice

(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive Attachment protein REceptor)

Structura complexului trans-SNARE

Disocierea complexului v-SNARE/t-SNARE sub aciunea NSF dup fuziunea membranelor NSF (N-ethylmaleimid sensitive fusion protein)

Sortarea proteinelor codificate de gene nucleare in celulele eucariote

Exemple de peptide semnal i rolul lor

Funcia secvenei semnal Ataarea de RE a ribosomilor angrenai n biosinteza catenelor polipeptidice Structura n aminoacizi a semnalului*
+H NMet-Met-Ser-Phe-Val-Ser3

Tipul secvenei semnal Semnal secvenial (secven hidrofob compact) Semnal secvenial (secven pozitiv compact) Semnal secvenial ? Semnal combinat (secvenial/c onformaional)

Leu-Leu-Leu-Val-Gly-Ile-LeuPhe-Trp-Ala-Thr-Glu-Ala-GluGln-Leu-Thr-Lys-Cys-Glu-ValPhe-Gln-

Import n nucleu

-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-LysVal-Ser-Lys-LeuCOO / SKL-COOH (PTS1) +H NX-X-Arg-Leu-X-X-X-X-X-His3 Leu- (PTS2)

+H NMet-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln3

Import n peroxisom

Import n mitocondrie

Ser-Ile-Arg-Phe-Phe-Lys-ProAla-Thr-Arg-Thr-Leu-CysSer-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu-

* Semnificaia culorilor: portocaliu hidrofob; rou pozitiv; albastru negativ; bleu - hidrofil

EXOCITOZA I ENDOCITOZA