5.

Rezonana magnetic nuclear

nc din 1978, rezonana magnetic nuclear,RMN-ul, a fost utilizat pe scar larg n
studiul structurii i dinamicii acizilor nucleici n soluii. Tehnica a devenit o alternativ viabil i
este complementara metodei difraciei cu raze X printr-un singur cristal.
Spectroscopia RMN se bazeaza pe faptul c anumii nuclei atomici fiind supui unui
cmp magnetic puternic absorb radiaiile la frecvene caracteristice, cteva sute de MHz n zona
radiofrecvenei din spectru. Pentru chimiti i biologi, valoarea RMN-urilor este dat de nucleii
aceluiai element, particular pentru H, care dau natere unor linii spectrale diferite n acord cu
mediu. Ca un rezultat, este posibil s se observe semnale discrete de la atomi individuali, chiar i
n moleculele mari, pn la o mas de 30 kDa pentru proteine i apropiindu-se de 20 perechi de
baze pentru acizii nucleici. Mai mult dect att, rspunsul RMN poate fi transferat ntre nuclei,
astfel oferindu-se informaii despre distanele nucleare i despre orientarea relativ a nucleilor.
Parametrii RMN-urilor care pot deriva din spectrele rezultate ofer informaii precise despre
structura moleculara, conformaie i dinamica acizilor nucleici.
RMN-ul acizilor nucleici utilizeaz atomi de H(1), C(13), N(15) i P(31). Dintre acetia,
hidrogenul (H, protonul) este cel mai important datorit sensibilitii sale nalte la detectarea de
ctre RMN i datorit abundenei sale izotopice naturale de aproape 100%. Instrumentaia
modern detecteaz n mod curent ali nuclei, ca de exemplu C(13) i N(15), care prin protonii
lor ataai doresc s maximizeze avantajele sensibilitii protonilor. n cele din urm, faptul c
izotopii hidrogenului, carbonului i azotului au caracteristici diferite ale RMN-urilor,asta
presupune ca instabilitatea izotopilor (H(1)->H(2), C(12)->C(13), N(14)->N(15)) s poat fi
utilizat pentru a schimba comportamentul moleculei cu privire la RMN-uri.
De la primele aplicaii n problemele biologice n 1950, rezonana magnetic nuclear a
evoluat ca rezultat a trei evenimente. n primul rnd, magneii superconductori rcii cu lichid de
heliu au cptat fore de la 1T la 20T. n al doilea rnd, probele sunt acum supuse iradierii cu
radiofrecvene prin folosirea impulsurilor i metodelor de transformare Fourier, n care radiaia
este aplicat sub forma unor impulsuri, mai mult sau mai puin complexe, generate cu ajutorul
computerului, iar spectrul este obinut prin transformarea Fourier a raspunsurilor diverselor
spinuri nucleare ale acestor impulsuri. n al treilea rnd, rezonanele magnetice nucleare
multidimensionale implic utilizarea a dou, trei sau chiar patru variabile ale frecvenei n
nregistrarea intensitilor rezonanei. n RMN-urile unidimensionale, spectrul H(1) are cte un
semnal al rezonanei pentru fiecare tip distinct de proton din punct de vedere chimic, iar acest
semnal este masurat ca i schimbrile chimice.
Manipularea cu ajutorul computerului a spinurilor nucleilor pune bazele RMN-urilor
multidimensionale moderne. n RMN-urile bidimensionale sau cele multidimensionale,
diagonala spectrului corespunde unui spectru al unui RMN unidimensional convenional, iar
vrfurile ncruciate ce apar pe diagonala conin informaii despre conexiunile dintre rezonane
pe diagonala. Acest fapt este ilustrat de seciunea unui spectru a unui NOESY bidimensional
(spectroscopie nuclear Overhauser) realizat pentru helixul triplu format din secvena d5
(TCTCTCTTTGAGAGA) i oligonucleotidele d5(TCTCTCT). Se arat astfel c o parte din
spectrul protonic cu rezonane provenite de la protonii imino este implicat n tripletele de baze.
Sunt trei tipuri de astfel de conexiuni: conexiuni prin legaturi( n care nucleii asociai sunt
separai de 2,3 sau chiar 4 legaturi(COSY sau spectroscopia corelativ)), conexiuni prin spaii
(ntre nuclei exist un spaiu mai mic de 5 armstrong) i conexiuni prin schimbare(care implic
prezena aceluiai nucleu n dou medii diferite, unul n care are rol de ligant aflat n echilibru n
soluii libere i unul legat de nucleu ). n RMN-urile tridimensionale sau patrudimensionale,
spectrul RMN-ului bidimensional al H(1) este efectiv mprtiat ntr-o a treia sau a patra
dimensiune prin folosirea unor mijloace ale schimbrilor chimice ale C(13) sau ale N(15).
Primul pas n studiul oricrui RMN este atribuirea rezonanelor nucleilor individuali,
aceasta este de obicei etapa limitant a operaiunii. Substituia selectiv a protonilor cu deuteriu
poate accelera cu succes asocierea unui spectru a protonului H(1) prin simplificarea problemelor
legate de suprapunerea rezonanelor. Aceasta abordare este acum utilizat pentru studiul
structurii ADN-ului i ARN-ului. Este astfel posibil continuarea studiului conexiunilor prin
spaii cu ajutorul metodelor NOESY i ROESY (metode spectroscopice Overhauser cu cadre
rotate).
Cele mai multe informaii despre structura soluiei provin din analiza geometriei
distanelor internucleare NOESY, unde intensitatea semnalului NOE este proporional cu inversa
distanei la puterea a asea dintre doi nuclei de H. Tipic, intensitile NOE ale protonilor sunt
sortate n puternic, mediu i slab pentru intervalele de distan: 1,8-2,5A, 1,8-3,5A i 1,8-
5A. Structura tridimensional care deriv din aceast analiz este o fotografie protonic a
moleculei. Aceast fotografie trebuie s fie convertit ntr-o structur tridimensional complet
prin adiia n cunotine a lungimii legturilor chimice standard i ale unghiurilor de legtur.