ENDONUCLEAZE DE RESTRICTIE

Definitie
Endonucleazele de restricie sunt enzime care recunosc secvene de ADN specifice, scurte, legarea fiind urmat de clivare, fie la situsul de
recunoastere, fie la o distan oarecare de acesta, n funcie de tipul de enzim.
Restriction enzymes are a group of enzymes that can cut doule!stranded DNA molecules into smaller restriction fragments. "he enzymes
#or$ y cleaving the onds in the phosphate ac$one of the DNA molecule. "hese onds can e reformed y ligase enzymes and in this
manner restriction fragments #ith different origin can e spliced together in novel #ays.
Clasificare
%istemele enzimatice de restricie&modificare 'sau restricie&metilare( au fost mparite n ) categorii* Tipul I, Tipul II +i Tipul III. "ipurile , +i
,,, constau n enzime care au at-t funcii de restricie c-t +i funcii de modificare. amele tipuri recunosc secvene specifice, nemetilate, de
ADN dc. enzimele de tip , cliveaz ADN!ul ntr!o manier randomizat 'situs!nespecific(, pe c-nd cele de tip ,,, taie la situsuri specifice, dar
nu n cadrul secvenei de recunoa+tere, ci la o distana de /0!/1 nucleotide de acesta 'e2* Eco34 5 codificat de fagul 34(. %istemele de tip
,, constau n enzime separate care ndeplinesc funciile de metilare, respectiv, restricie.
E2ist +i un al 6!lea sistem de restricie&modificare care opereaz n sens invers* conine o enzim de restricie care recunoa+te +i cliveaz o
secvena de ADN metilat. Anumite tulpini de Steptococcus pneumoniae prezint enzim Dpn, care cliveaz secven 7A"8 numai dac
aceast este metilat. aceste tulpini nu prezint o metilaza care s metileze secvenele 7A"8.
Nomenclatura
Descoperirea unui numr foarte mare de enzime de restricie a impus adoptarea unei nomenclaturi universale. Astfel, se folose+te un cod de
) litere, n format italic, prima litera semnific-nd genul, iar celelalte / specia acterian de la care a fost izolat enzima 'spre e2emplu, Eco 5
Escherichia coli(. n unele cazuri, o a patra liter 'n format normal( indic tulpina acterian 'e2* EcoR(. Dac o anumit tulpin acterian
are mai mult de 4 sistem de restricie!modificare, acestea se identific prin numere romane * spre e2emplu Bgl , si Bgl ,,.
Tip II TipIII TipI
Structura proteica Metilaze i endonucleaze
distincte
Enzima bifuncional care
conine 2 subuniti
Enzima bifuncional
careconine 3 subuniti
Situs de recunoastere Secvene de 4-6 pb,
adesea palindromice
Secvene asimetrice de -
! pb
Secvene bipartite i
asimetrice
Situs de clivare "celai sau apropiat de
situsul de recunoastere
#a 24-26 pb $n aval faa
de situsul de
recunoastere
%especific, la mai mult
de&''' pb de situsul de
recunoastere
Restricie i metilare (eacii separate Simultane E)clusive
Sisteme de restricie/modificare de tip II
%istemele de restricie&modificare de tip ,, sunt cele mai des ntilnite 'se nt-lnesc la una din ) tulpini acteriene( +i constau n endonucleaze
+i metilaze distincte, activitatea amelor enzime fiind dependent de ioni de magneziu.
ER de tip ,, au o secvena de recunoa+tere scurt, de 6!9 nucleotide, n cele mai multe cazuri palindromic. De e2emplu, enzima EcoR,
recunoa+te o secvena he2anucleotidic*
0:!7!A!A!"!"!8!):
):!8!"!"!A!A!7!0:
%imilar altor endonucleaze de restricie, EcoR, nu taie la nivelul a2ei de simetrie a secvenei de recunoa+tere, ci spre captul 0:, ntre 7 +i A,
duc-nd la formarea de capete 0: coezive*
0:!7!): 0:!A!A!"!"!8!):
):!8!"!"!A!A!0: ):!7!0:
;n mod similar, multe alte enzime de restricie genereaz fragmente cu capete 0: coezive. altele 'e2* Pst ,( genereaz fragmente cu capete ):
coezive, n timp ce alte enzime taie la nivelul a2ei de simetrie a secvenei de recunoa+tere, duc-nd la formarea de fragmente cu capete
drepte. %pre e2emplu, enzima Bal, recunoa+te secvena
0:!"!7!7!8!8!A!):
):!A!8!8!7!7!"!0:
+i taie la nivelul a2ei de simetrie ducnd la otinerea de capete drepte *
0:!"!7!7!): 0:!8!8!A!):
):!A!8!8!0: ):!7!7!"!0:
enzimele de restricie de tip ,, pot fi mparite n / sufamilii, n funcie de tipul de fragmente de ADN generate dup clivare. Astfel, Bam<,,
EcoR, +i Cfr4=, hidrolizeaz secvenele de recunoa+tere n zigzag, duc-nd la formarea de capete ADN 0: coezive, +i sunt structural mai
nrudite ntre ele dec-t cu EcoR> +i Pvu,,, care cliveaz ADN!ul duc-nd la oinerea de capete drepte. Bgl,, o endonucleaz care produce
capete ): coezive, este structural mult mai apropiat enzimele EcoR> +i Pvu,,, dar actualmente nu este considerat ca reprezentant al unei
sufamilii diferite.
Some examples of Type II restriction endonucleases
Restriction endonucleases are used y acteria to recognize foreign DNA and destory 'restrict( it y introducing doule!stranded cuts at
characteristic palindromic reconition sites. "hey are typically named after the acterial species from #hich they #ere first isolated. ?or
1
e2ample, EcoRI #as the 'I(st 'R(estriction endonuclease isolated from E. coli* Eco @ R @ I! Aost endonucleases used in molecular iology
recognize four or si" #ase sites 'Bfour-cuttersB and Bsix-cuttersB(. some have ten!ase sites, and are called Blong cuttersB ecause the
interval et#een sites is much greater.
A palindrome is a #ord or phrase that reads the same for#ard or ac$#ard* BAle #as , ere , sa# ElaB, BAadame ,Cm Adam,B or the
?innish #ord for a soap seller, B%aippua$auppiasB. DNA palindromes read the same for#ard and ac$#ard #hen oth strands are
considered. ,n the first e2ample aove, the recognition site of EcoRI is $%&'AATTC&(%, so the paired strand is (%&CTTAA'&$%* the doule!
stranded 9 p seDuence #ill therefore read the same in either direction.
Enzima
En)imele i)osc*i)omere +i neosc*i)omere
;n general, enzimele de restricie recunosc secvene de ADN diferite. 8u toate acestea, din gazde diferite au fost izolate enzime care au
acela+i situs de recunoa+tere. Enzimele care au aceea+i secvena de recunoa+tere +i taie n acelea+i poziii se numesc izoschizomere. spre
e2emplu, secvena
E7!A!"!8
este recunoscut de enzimele Mbo , +i Sau3A ,, care taie n aceea+i poziie. prin urmare aceste enzime sunt izoschizomere.
F enzim este neoschizomer fa de alt enzim dac amele enzime recunosc aceea+i secvena, dar au situsuri de clivare diferite*
8E!8!8!7!7!7 Gma,
8!8!8E!7!7!7 %ma,
A piece of target DNA can be inserted into a
plasmid if both the circular plasmid and the target
DNA have been cleaved by the same restriction
nuclease in such a way as to create sticky ends. The
newly created recombinant molecule is stabilized
with the DNA ligase enzyme which repairs nicks in
the backbone of the DNA molecule.
2