UNIVERSITATEA DE STIINTE AGRONOMICE

SI MEDICINA VETERINARA BUCURESTI

FACULTATEA DE HORTICULTURA










TEZ DE DOCTORAT






CONDUCTOR TIINIFIC,
PROF.UNIV.DR.CMPEANU GHEORGHE



DOCTORAND
ING.CORNELIA CMPEANU



2010
UNIVERSITATEA DE STIINTE AGRONOMICE
SI MEDICINA VETERINARA BUCURESTI
FACULTATEA DE HORTICULTURA














TEZ DE DOCTORAT

CERCETRI PRIVIND OBINEREA BIOETANOLULUI
DIN MATERII VEGETALE AUTOHTONE





CONDUCTOR TIINIFIC,
PROF.UNIV.DR.CMPEANU GHEORGHE

Doctorand
ING.CORNELIA CMPEANU


2010

UNIVERSITATEA DE STIINTE AGRONOMICE
SI MEDICINA VETERINARA BUCURESTI
FACULTATEA DE HORTICULTURA











TEMA: CERCETRI PRIVIND OBINEREA
BIOETANOLULUI DIN MATERII VEGETALE
AUTOHTONE





CONDUCTOR TIINIFIC,
PROF.UNIV.DR.CMPEANU GHEORGHE

Doctorand
ING.CORNELIA CMPEANU




2010











PhD THESIS

RESEARCH ON OBTAINING BIOETHANOL FROM
INDIGENOUS VEGETABLE RAW MATERIALS
















CUPRINS


CAP. I. STADIUL ACTUAL AL CERCETRILOR PRIVIND BIOETANOLUL
CARBURANT ECOLOGIC DIN MATERII PRIME VEGETALE

1
1.1. Noutati si abordari actuale la producerea bioetanolului 1
1.2. Etanolul din generatia I de biocombustibili: prezent si perspective 11
1.3. Descrierea principalelor materii prime agricole pentru producerea de bioetanol 16
1.3.1 Materii prime cerealiere 17
1.3.1.1 Orzul 17
1.3.1.2 Grul 17
1.3.1.3 Secara 17
1.3.1.4 Sorgul 18
1.3.1.5 Porumbul 18
1.3.2 Materii prime tuberculi 19
1.3.2.1.Cartoful 19
1.3.2.2 Topinamburul 19
1.3.3 Sfecla de zahar 19
1.3.4 Melasa 20
1.4. Utilizarea preparatelor enzimatice exogene pentru industria etanolului 21
1.4.1 Folosirea preparatelor enzimatice pentru moderarea parametrilor de
prelucrare a materiilor prime
21
1.4.2 Enzime care degradeaza amidonul 23
1.4.3 Prezentarea tehnologiilor utilizate in industria spirtului din materii prime
amidonoase aplicate in ar
25
1.4.4 Procedeul tehnologic de plamadire-zaharificare cu plamezi de densitate
inalta (Very High Gravity )
30
1.5. Microorganismele capabile s produc fermentaia alcoolic 32
1.5.1 Drojdii versus bacterii utilizate in fermentaia alcoolic. Drojdii versus
bacterii utilizate n fermentatia alcoolica
32
1.5.2. Microorganisme / drojdii termorezistente 45
1.5.3. Microorganisme / drojdii alcoolotolerante 49
CAP.II.OBIECTIVELE TIINIFICE ALE TEZEI DE DOCTORAT 57

CAP.III. MATERIALE I METODE UTILIZATE N EXPERIMENTRILE
EFECTUATE



59
3.1. Materii prime 59
3.2. Preparate enzimatice 59
3.2.3 Tulpini de drojdie utilizate 64
3.2.4.Izolarea de tulpini de drojdie producatoare de alcool 64
3.3. Metode utilizate n experimentri 66
3.3.1.Controlul plmezilor de cereale n curs de fermentare 66
3.3.2. Studierea, testarea si caracterizarea din punct de vedere fizico chimic,
bacteriologic si al continutului de micotoxine pentru diferite resurse agricole
indigene regenerabile si identificarea acelor resurse care asigure randamente
tehnologice optime, la obtinerea de bioetanol
73
3.3.2.1. Testarea si caracterizarea cerealelor (considerate energy crops) 73
3.4. Aparatur utilizat n experimentri 109
3.4.1 Aparatura de laborator 109
3.4.2. Instalaiile pilot

110
CAP.IV. REZULTATELE CERCETRILOR PROPRII PRIVIND
CARACTERISTICILE MATERIILOR PRIME UTILIZATE N OBINEREA
BIOETANOLULUI

112
4.1. Studierea si caracterizarea din punct de vedere fizico chimic a cerealelor 112
4.2. Studierea si caracterizarea din punct de vedere bacteriologic 113
4.3. Studierea si caracterizarea din punct de vedere al continutului de micotoxine

114
CAP.V. TESTAREA, STUDIEREA I VERIFICAREA IN LABORATOR A
UNOR PREPARATE ENZIMATICE DE ULTIM GENERAIE, DESTINATE
OBINERII BIOETANOLULUI

119
5.1. Metode analitice de determinare a activitatii enzimatice 119
5.1.1. Determinarea activitatii alfa-amilazice bacteriene 119
5.1.2. Determinarea activitatii amiloglucozidazice fungice (metoda Sumyzyme) 120
5.2. Rezultatele studiului la nivel de laborator al comportarii enzimelor amilolitice
destinate fabricarii etanolului combustibil din materii prime amidonoase de la firma
Novozymes
121

CAP.VI. SELECTIONAREA UNOR CULTURI DE DROJDIE
TERMOREZISTENTE SI ALCOOLOTOLERANTE SI IDENTIFICAREA
UNOR SUE CARE SA PERMITA OBTINEREA UNUI CONTINUT CAT MAI
RIDICAT DE ALCOOL

126
6.1. Experimentri de laborator privind izolarea, selecionarea i testarea unor tulpini
de drojdie capabile s realizeze randamente superioare de fermentare. Metode de
izolare, testare, selectie, verificare si pastrare a drojdiilor
126
6.1.1. Izolarea de tulpini de drojdie producatoare de alcool. Materialul biologic si
metoda de cercetare
126
6.1.2. Examinarea caracterelor morfologice si culturale ale tulpinilor de drojdii
izolate, Diagrama morfologica si diagrama Dalmau
128
6.1.3. Identificarea tulpinilor i ntocmirea fielor tulpinilor de drojdii izolate.
Fiele de caracterizare morfologic a tulpinilor
134
6.1.4. Stabilirea condiiilor de conservare a tulpinilor de drojdie selecionate 148
6.2. Drojdii termorezistente si alcoolotolerante 149
6.2.1.Experiene privind drojdiile termorezistente 149
6.2.2. Experiene privind drojdiile alcolotolerante 151
6.3. Experimentari pilot pentru testarea si verificarea caracteristicilor tulpinilor de
drojdie izolate de a forma concentratii ridicate de alcool


154
CAP.VII. STABILIREA TEHNOLOGIEI CADRU DE OBTINERE A
BIOETANOLULUI DIN MATERII MATERII PRIME AMIDONOASE
(CEREALE)

161
7.1. Varianta tehnologic n cazul utilizrii enzimelor NOVOZYMES destinate
producerii de bioetanol
161
7.2. Varianta tehnologica n cazul utilizarii enzimelor enzime GENENCOR destinate
producerii de bioetanol
167

CAP.VIII.CONCLUZII FINALE ALE CERCETARILOR PRIVIND
OBTINEREA BIOETANOLULUI DIN MATERII PRIME VEGETALE
AUTOHTONE
Bibliografie

172
179









TABLE OF CONTENTS

CHAPTER. I. CURRENT STAGE OF RESEARCH ON BIOETHANOL -
ECOLOGICAL FUEL FROM VEGETABLE RAW MATERIALS
1
1.1. News and current approaches in producing bioethanol 1
1.2.The ethanol from the first biofuels generation: present and future 11
1.3. Description of the main agricultural raw materials for bioethanol production 16
1.3.1 Starch crops: Cereals (Feedstock: Cereals) Feedstock 17
1.3.1.1 Barley 17
1.3.1.2 Wheat 17
1.3.1.3 Rye 17
1.3.1.4 Sorghum 18
1.3.1.5 Corn 18
1.3.2 Starch crops: Tubers (Feedstock: Tubers) 19
1.3.2.1.Potato 19
1.3.2.2 Topinambur 19
1.3.3 Sugar beet 19
1.3.4 Molasses 20
1.4. The use of exogenous enzyme preparations for ethanol industry 21
1.4.1 The use of enzyme preparations for moderating raw materials processing
parameters
21
1.4.2 Enzymes altering the starch 23
1.4.3 Prezentation of the nationwide technologies used in the industry of
alcohol obtaind from starch crops
25
1.4.4 The technological process of leaven-saccharification with high density
meals
30
1.5. Microorganisms able of producing alcoholic fermentation 32
1.5.1Yeasts versus bacteria used in alcoholic fermentation 32
1.5.2. Microorganisms / thermoresistant yeasts 45
1.5.3. Microorganisme / alcohol-tolerant yeasts

49
CHAPTER II. SCIENTIFIC OBJECTIVES OF PhD THESIS 57
CHAPTER.III. MATERIALS AND METHODS USED IN THE EXPERIMENTS
CONDUCTED


59
3.1. Raw materials 59
3.2. Enzyme preparations 59
3.2.3 Yeast 64
3.3. Methods used in experiments 64
3.3.1. The control of cereal meals under fermentation 66
3.3.2. The study, testing and physico-chemical, bacteriological and
mycotoxins-content characterization of various indigenous renewable
agricultural resources and identification of those resources that ensure optimal
technological efficiencies in order to obtain bioethanol

66
3.3.2.1. The testing and characterization of cereals considered energy
crops
73
3.4. Equipment used for experiments 73
3.4.1 Laboratory equipment 109
3.4.2 Pilot instalations 109
CHAPTER IV. THE RESULTS OF OWN RESEARCH ON THE
CHARACTERISTICS OF RAW MATERIALS USED IN OBTAINING
BIOETHANOL
110
4.1. The study and physico-chemical characterization of cereals 112
4.2.The study and bacteriological characterization 112
4.3.The study and mycotoxines-content characterization

113
CHAPTER V. THE TESTING, STUDY AND VERIFICATION IN
LABORATORY AND PILOT INSTALLATIONS, OF LAST GENERATION
ENZYME PREPARATIONS, SET FOR BIOETHANOL PRODUCTION

114
5.1. Analytical methods to determine the enzymatic activity 119
5.1.1. Determination of alpha-amylase bacterial activity 119
5.1.2. Determination of fungal amyloglucosidase activity (Sumyzyme method) 119
5.2. The results of laboratory study concerning the behaviour of amylolytic enzymes
set for the production of fuel ethanol from starchy materials from Novozymes
company

120
CAP.VI. THE SELECTION OF SOME THERMORESISTANT AND
ALCOHOL-TOLERANT YEASTS CULTURES AND IDENTIFICATION OF
SOME STRAINS ABLE TO ALLOW THE ACHIEVEMENT OF AN
ALCOHOL CONTENT AS HIGHEST AS POSSIBLE
121

6.1. Laboratory experiments for isolation, selection and testing of some yeast strains
able to achieve superior returns by fermentation. Methods for yeasts isolation, testing,
selection, verification and storage
126
6.1.1. Isolation of yeast producing alcohol strains. Biological material and
reseach method
126
6.1.2. Examination of morphological and cultural properties of isolated yeast
strains.
Morphological chart and Dalmau chart
126
6.1.3. Identification of strains and preparation of isolated yeast strains schedules.
Schedules of strains morphological characterization
128
6.1.4. Determination of conditions for conservation of selected yeast strains 134
6.2. Thermoresistant and alcohol-tolerant yeasts 148
6.2.1. Experiments on thermoresistant yeasts 149
6.2.2. Experiments on alcohol-tolerant yeasts 149
6.3. Pilot experiments to test and verify the characteristics of isolated yeast strains
to form high concentrations of alcohol



151
CHAPTER VII. DETERMINATION OF THE TECHNOLOGY FOR
OBTAINING BIOETHANOL FROM STARCH CROPS

154
7.1. Technological variant if using NOVOZYMES enzymes for bioethanol production 161
7.2.Technological variant if using GENENCOR enzymes for bioethanol production 167
CHAPTER VIII.FINAL CONCLUSSIONS REGARDING THE BIOETHANOL
TEHNOLOGY FROM RAW MATERIALS
172




Bibliography

179










CERCETRI PRIVIND OBINEREA BIOETANOLULUI DIN MATERII
VEGETALE AUTOHTONE

Drd.Cornelia Cimpeanu
In conformitate cu documentul oficial de politic energetic a Romniei pentru
perioada 2006 2009 (Energie sigur, accesibil i curat, pentru Romnia), obiectivul
principal urmrit n promovarea utilizrii biocarburanilor sau a altor carburani
regenerabili pentru nlocuirea benzinei i motorinei folosit n transporturi, se refer la
ndeplinirea angajamentelor privind schimbrile climatice, precum i la promovarea
resurselor regenerabile de energie (Proiect Politica energetic a Romniei, 2006).
Cercetarile efectuate in Romania privind obinerea de bioetanol din biomasa
vegetale energy crops se afl n faza incipient, iar dezvoltarea rapid a acestui gen
de cercetari este impus de necesitatea nlocuirii ct mai rapide a unei proporii de
combustibili fosili cu combustibili proveniti din resurse vegetale regenerabile.
tiina in acest domeniu a facut pai uriai, care se bazeaz pe unele realizari de
prestigiu de pe plan mondial, printre care vom meniona:

descoperirea preparatelor enzimatice de ultim generaie i a culturii de drojdie care
permite zaharificarea amidonului i fermentarea glucozei n acelasi timp. Aceasta
conduce la o serioas economie de energie estimata la cca. 30% din energia utilizat
pentru producerea de alcool etilic de uz alimentar;
promovarea sitelor moleculare pentru deshidratarea alcoolului etilic obinut;
dezvoltarea principiilor de producie ecologic prin minimalizarea consumurilor de
materii prime, materiale auxiliare i utiliti.



Producerea efectiv a bioetanolului prin utilizarea de resurse energetice agricole, implic
trei principii de baz:
- utilizarea uneia sau mai multor materii prime agricole regenerabile autohtone
specifice zonei n care este localizat fabrica de bioetanol;
- micorarea ct de mult (posibil) a consumului energetic, att la obinerea plmezii
dulci, ct i la distilarea i uscarea bioetanolului, precum i obinerea unor
randamente mai nalte de etanol;
- utilizarea tuturor deeurilor i produilor secundari rezultai conform tehnologiei
de obinere a bioetanolului aplicate, n cazul nostru dioxidul de carbon i borhotul
de cereale.
Producerea de energy crops este condiionat de condiiile de mediu ntr-o
regiune dat i de managementul agricol, care poate asigura producii mari i constante la
hectar, cu disponibiliti pentru bioetanol.

Producerea de energy crops, care pentru Romnia este reprezentat n primul
rnd de porumb, prezint o serie de avantaje, aa cum sunt:

- porumbul reprezint o producie specific pentru Romnia, practicabil la scar larg i
care este regenerabil;
- asigur locuri de munc pentru localitile rurale i ctiguri suplimentare pentru
organismele locale;
- borhotul poate fi utilizat n furajarea anumitor categorii de animale, la o paritate de 0,8 /
1 (borhotul rezultat de la prelucrarea porumbului de pe 1 hectar echivaleaz ca valoare
nutritiv cu porumbul de pe o suprafa de 0,8 hectare).
Culturile energetice pentru Romnia sunt declarate rapi, floarea soarelui, soia i
porumb (www.maap.ro).

Tema prezentei teze, Cercetari privind obinerea carburanilor ecologici din
materii prime vegetale autohtone, se nscrie n efortul comun al specialitilor i al multor
instituii din ara noastr, de a obtine bioetanol n condiii de eficien economic.

Obiectivul principal al tezei a fost obinerea de bioetanol de generatia I din
resurse agricole energetice regenerabile autohtone. Pn la ora actual, n Romnia nu
s-a produs niciodata bioetanol, indiferent de generaie.
Cercetarile efectuate la nivelul anilor '80, de obinere a alcoolului carburant din
paie, stuf, tulpini de floarea soarelui, coceni de porumb, au dat rezultate nesatisfacatoare
din punct de vedere economic.
Este pentru prima data in Romnia cnd la zaharificarea plmezilor se folosesc
preparatele enzimatice de ultima generaie STARGEN, destinate exclusiv producerii
bioetanolului, precum i drojdia specifica ETHANOL RED.

Teza are n vedere, de asemenea, i propunerea unor soluii tiinifice i
tehnice viabile de ordin practic, de absolut noutate pentru Romnia, pentru
obinerea de alcool carburant din materii prime agricole indigene regenerabile,
aplicnd tehnologii ecologice.

Obiectivele specifice ale lucrrii de doctorat sunt:

studierea, testarea i caracterizarea din punct de vedere fizico chimic i bacteriologic
a unor diferite resurse agricole indigene regenerabile, pe care le vom denumi biomasa
vegetal i identificarea acelor resurse care asigur randamente tehnologice optime;
testarea, studierea i verificarea, att n laborator, ct i n instalaia pilot, a unor
preparate enzimatice de ultima generaie. Prin testarea se are n vedere stabilirea
activitii enzimatice la un moment dat, precum i pierderi de activitate enzimatic pe
parcursul pstrrii n anumite condiii de temperatur i umiditate relativ a aerului;
stabilirea dozelor optime de preparate enzimatice industriale i a parametrilor optimi de
aciune asupra amidonului, precum i urmrirea evoluiei proceselor enzimatice de
hidroliz a amidonului;
selecionarea unor culturi de drojdie termorezistente i alcoolotolerante i identificarea
unor sue care s permit obinerea unui coninut ct mai ridicat de alcool;
elaborarea unor metode de izolare, testare, selecie, verificare i pstrare a unor noi
tulpini de drojdie termorezistente i alcoolotolerante, specifice pentru Romnia;
elaborarea unor floxuri tehnologice pe baza studiilor i experimentarilor efectuate n
instalaia pilot pentru propunerea unei tehnologii optime, cu potenial de aplicare
practic.
Resursele agricole indigene regenerabile principale care au fost luate n studiu n
cadrul tezei de doctorat, n scopul valorificrii lor pentru producerea de bioetanol, au fost
porumbul i graul.
Toate materiile prime energetice au fost de provenien intern i au fost furnizate
de agricultori i de fabrici productoare de alcool din ar.
Materiile prime selectate au fost studiate i caracterizate din punct de vedere
fizico chimic, bacteriologic, dar i al coninutului de micotoxine. Acestea au fost
grupate pe categorii, analizele fiind efectuate n funcie de specificul fiecarei grupe.
Astfel, n cadrul studiilor i experimentarilor derulate s-au avut n vedere
abordarea a dou categorii principale de preparate enzimatice destinate producerii de
bioetanol:

- preparatele enzimatice dezvoltate de compania danez NOVOZYMES, care n
Romnia sunt comercializate prin intermediul firmei G & G INTERNATIONAL, cu
sediul in Avrig (Sibiu);
- preparatele enzimatice dezvoltate de compania americana GENENCOR
INTERNATIONAL, care la ora actuala a devenit parte a companiei DANISCO i care
au fost pentru prima dat testate n Romnia, n vederea producerii de bioetanol la nivel
de laborator i pilot. Enzimele furnizate de GENENCOR sunt comercializate prin
intermediul firmei Enzymes & Derivates Romania, cu sediul in Costia (Neam).
Teza conine, sub form de anexe, fiele tehnice ale tuturor preparatelor
enzimatice, n original.
Preparatele enzimatice NOVOZYMES utilizate n experimentari au fost
urmatoarele:
- Liquozyme SC DS;
- Spirizyme Fuel.
Preparatele enzimatice GENENCOR utilizate n experimentri au fost
urmatoarele:
- STARGEN 001 (complex enzimatic compus dintr-o amilaz i o amiloglucozidaz);
- FERMGEN (proteaz).
Pentru fermentarea plmezilor de cereale n scopul obinerii de bioetanol am folosit,
separat de drojdiile selectionate, o drojdie uscat activ special destinat obinerii de
concentraii ridicate de etanol. Drojdia este produs de compania FERMENTIS (Franta)
i are denumirea comerciala de ETHANOL RED.


Cercetrile privind obinerea bioetanolului s-au efectuat la dou cereale
considerate energy crops pentru Romnia i anume la gru i porumb lundu-se n
considerare 20 probe de porumb i 15 probe de gru. Aceste probe au fost testate prin
metodele specifice prezentate n capitolul de material i metode iar apoi s-a trecut la
experimentarea acestora n staia pilot pentru estimarea cantitii i calitii bioetanolului
obinut.
Toate materiile prime energetice au fost de provenien intern i au fost furnizate
de agricultori i de fabrici productoare de alcool din ar.
Materiile prime selectate au fost studiate i caracterizate din punct de vedere
fizico chimic, bacteriologic, dar i al coninutului de micotoxine. Acestea au fost
grupate pe categorii, analizele fiind efectuate n funcie de specificul fiecarei grupe.
1.Coninutul de protein, grsime, celuloz i amidon se ncadreaz n limitele
prrezentate de literatura de specialitate pentru cele dou cereale;
2. ncrcarea microbiologic a materiilor prime este normal;
3. Legislatia romneasca n vigoare limiteaz la maximum 4 ppb prezena aflatoxinelor
totale n gru i respectiv 10 ppb pentru porumb.Se constata c toate probele analizate s-
au ncadrat n valoarea maxima admisa pentru coninutul de aflatoxine;
4. n cazul orchratoxin limita maxim admis n Romnia 5 ppb-cereale brute i 3 ppb-
produse derivate din cereale. Se constat c toate probele analizate s-au ncadrat n
valoarea maxim admis;
5. In Romnia, limita maxima n cazul DON pentru cereale neprocesate este 1250
ppb.Din analizele efectuate la probele de gru i porumb se constat c toate probele
analizate s-au ncadrat n valoarea maxim admis.

In cadrul tezei au fost testate, studiate i verificate n laborator i n instalaiile
pilot preparate enzimatice NOVOZYMES destinate producerii de bioetanol, de ultim
generaie, Testrile au avut ca scop stabilirea variaiei n timp a activitatii enzimatice, n
anumite condiii determinate de temperatur i umiditate relativ a aerului.

Studiul a fost constituit din dou componente:
- studiul n condiii de laborator al comportamentului enzimelor amilolitice destinate
fabricrii etanolului combustibil din materii prime amidonoase, de la firma Novozymes
Danemarca;
- studiul n condiii pilot al comportamentului enzimelor amilolitice destinate fabricrii
etanolului combustibil din materii prime amidonoase.
La nivel de laborator a fost determinat evoluia n timp a activitaii enzimatice a
preparatului de amilaza Liquozyme SC DS i a preparatului de amiloglucozidaza
Spirizyme Fuel, n diferite condiii de temperatur i umiditate relativ a aerului.

Studiul a fost efectuat pe parcursul a 7 luni, pe parcursul prezentei etape, dar
astfel ncat s permit i analiza i interpretarea rezultatelor.
Regimurile la care au fost pstrate enzimele i pentru care s-au determinat apoi
activitile enzimatice au fost urmatoarele:
1. temperatura de depozitare: 4C / umiditate relativa a aerului 70%
2. temperatura de depozitare: 25C / umiditate relativa a aerului 70%
3. temperatura de depozitare: 35C / umiditate relativa a aerului 70%
4. temperatura de depozitare: 25C / umiditate relativa a aerului 85%
5. temperatura de depozitare: 25C / umiditate relativa a aerului 90%

Rezultatele experimentrilor au artat:
n cazul Liquozyme SC DS
1. S-a constatat c, dup 7 luni de depozitare la temperatura de 4C i umiditate
relativ a aerului 70%, preparatul cu activitate -amilazica nc mai pastreaz cca. 96,5%
din activitatea sa iniial.
2. In urma cercetrilor realizate, s-a constatat o scdere a activitaii enzimatice
amilolitice a preparatului Liquozyme SC DS cu circa 12,4%, dupa meninerea sa timp de
7 luni la o temperatur a mediului de 25C i umiditate relativa a aerului 70%.
3. S-a constatat c, prin meninerea preparatului Liquozyme SC DS timp de 7
luni, la o temperatur de 35C, activitatea amilolitica a acestuia a sczut cu circa 65%.
4. In urma cercetarilor realizate, s-a constatat o scdere a activitaii enzimatice
amilolitice a preparatului Liquozyme SC DS cu circa 23%, dupa meninerea sa timp de 7
luni la o temperatur a mediului de 25C i umiditate relativ a aerului 85%,
5. In urma cercetrilor realizate, s-a constatat o scdere a activitaii enzimatice
amilolitice a preparatului Liquozyme SC DS cu circa 30%, dup meninerea sa timp de 7
luni la o temperatur a mediului de 25C i umiditate relativ a aerului 90%.
n cazul Spirizyme Fuel
1. S-a constatat c, dupa 7 luni de depozitare la temperatura de 4C i umiditate
relativa a aerului 70%, preparatul enzimatic cu activitate glucoamilazica nc mai
pastreaz cca. 97% din activitatea sa iniiala.
2. In urma cercetrilor realizate, s-a constatat o scdere a activitaii enzimatice
glucoamilazice a preparatului Spirizyme Fuel cu circa 15%, dup meninerea sa timp de 7
luni la o temperatur a mediului de 25C i umiditate relativ a aerului 70%,
3. S-a constatat c, prin meninerea timp de 7 luni a preparatului Spirizyme Fuel
la o temperatur de 35C i umiditate relativ a aerului 70%, activitatea glucoamilazic a
acestuia a sczut cu cca. 39%.
4. In urma studiilor realizate, s-a constatat o scdere a activitaii enzimatice
amilolitice a preparatului Spirizyme Fuel cu circa 31%, dup meninerea sa timp de 7 luni
la o temperatur a mediului de 25C umiditate relativ a aerului 85%.
5. In urma cercetarilor realizate, s-a constatat o scdere a activitaii enzimatice
amilolitice a preparatului Spirizyme Fuel cu circa 44%, dup meninerea sa timp de 7 luni
la o temperatur a mediului de 25C i umiditate relativ a aerului 90%,

Un alt capirtol at tezei s-a bazat pe selecionarea unor culturi de drojdie termorezistent i
alcolotolerante i identificarea unor sue care s permit obinerea unui coninut ct mai
ridicat de alcool.
In cadrul acestui capitol s-au realizat urmatoarele activitai:
- Izolarea de drojdii nalt productoare de alcool;
- Stabilizarea tulpinilor izolate i care au dat cele mai bune rezultate n ceea ce priveste
acumularea de alcool pe parcursul fermentaiei alcoolice;
- Caracterizarea morfologica, fiziologica, biochimica a tulpinilor pure i identificarea lor
taxonomic.
De asemenea, s-a studiat i mbunatit performanele unor tulpini de drojdie
izolate.
Pentru izolare s-au folosit medii naturale, urmrindu-se etapele:
- izolarea drojdiilor sub form de culturi pure;
- caracterizarea macroscopic i microscopic a drojdiilor izolate;
- caracterizarea fiziologic i studierea comportamentului fermentativ a drojdiilor alese.
Studiul seleciei unor tulpini de drojdie capabile s fermenteze, n condiii optime,
mediile ce conin ca substrat fermentescibil zaharoza, urmrete att aspectul cantitativ,
ct i pe cel calitativ, al producerii etanolului de fermentaie.
n cazul subcapitolului Izolarea de tulpini de drojdie producatoare de alcool obinerea
de colonii izolate de drojdii s-a realizat prin aplicarea tehnicii diluiilor succesive,
avndu-se ca reper densitatea celulelor de drojdie, determinat folosind camera Thoma.
S-au izolat un numr de 41 tulpini de drojdii. Pentru izolare s-au folosit att medii
naturale, ct i medii speciale, pregtite n laborator.
Drojdiile care au format cel mai bogat sediment, au fost izolate din nou n cultur
pur i au fost studiate amnunit n ce privete calitile lor pentru producerea de
biomasa.
Pentru repicare i conservare s-a utilizat ca mediu de cultur mustul de mal cu
agar (MMA). S-au fcut repicri n eprubete cu MMA nclinat, iar termostatarea s-a
efectuat timp de 3-5 zile la 20-26
0
C. Mediul de cultur utilizat conine must de mal cu
concentraia de 8% s.u. cu adaos de agar-agar 2 %.
Examinarea caracterelor morfologice si culturale ale tulpinilor de drojdii izolate,s-a
efectuat cu ajutorul Diagramei morfologice si a diagramei Dalmau.

Diagrama Dalmau
Celule Tulpina
Forma Grupare Mod de
inmugurire
Pseudomiceliu Sporulare
E27 Celule rotunde si
rotund ovale
izolate sau grupate
in grupuri mici
muguras
unipolar
nu formeaza 1-4 spori
M17

Celule rotund- ovale grupate in grupuri
mari, rar izolate
muguras
unipolar
formeaza
pseudomicelii
1 - 4 spori
F3 Celule rotund-ovale izolate sau grupate
in grupuri mici
muguras
unipolar
nu formeaza 1 - 4 spori
F7 Celule rotund-ovale izolate sau grupate
in grupuri mici
muguras
unipolar
nu formeaza 1 - 4 spori
M18

Celule rotund-ovale izolate sau grupate
in grupuri mici
muguras
unipolar
formeaza
pseudomicelii
1-4 spori
M21

Celule rotund-ovale izolate sau grupate
in grupuri mici
muguras
unipolar
formeaza
pseudomicelii
1-4 spori
D7 Celule rotund-ovale izolate sau grupate
in grupuri mici
muguras
unipolar
nu formeaza 1 - 4 spori
Rezultatele testului API ID32C pentru cele 7 tulpini de drojdie
izolate i selectionate la nivel de laborator, apoi testate la nivel
pilot, au dovedit c toate drojdiile aparin genului Saccharomyces, specia
cerevisiae. Rezultatele testelor API pentru tulpinile de drojdie selectionate i testate sunt
prezentate ca anexe la teza de doctorat.
Stabilind pe baza testelor efectuate c drojdiile izolate apartin genului
Saccharomyces, s-a procedat apoi la efectuarea de teste suplimentare, pentru stabilirea
speciei. Astfel, s-a folosit mediul WLD.




Stabilirea speciei prin efectuare de teste suplimentare

Tulpina de drojdie Rezultate examen macroscopic
E27 Colonii verde deschis, lucioase, cu mediul decolorat
M18 Colonii verde nchis, lucioase, cu mediul decolorat puternic
F7 Colonii verzi, lucioase, cu mediul decolorat
D7 Colonii verzi, lucioase, cu mediul decolorat
M17 Colonii verde nchis, lucioase, cu mediul decolorat puternic
F3 Colonii verzi, lucioase, cu mediul decolorat
M21 Colonii verde nchis, lucioase, cu mediul decolorat puternic
Urmtoarea etap a fost satbilirea capacitii de fermentare a principalelor zaharuri, ca
metod s-a folosit metoda auxonografic. Compuii de carbon utilizai au fost: glucoz,
zaharoz, maltoz, fructoz, galactoz i rafinoz.
Capacitatea de fermentare a drojdiilor

Tulpina Glucoz Zaharoz Maltoz Galactoz Fructoz Rafinoz
E27 + + + + + + + + + + + + + + +
M18 + + + + + + + + + + + + + + + +
F7 + + + + + + + + + + + + + + +
D7 + + + + + ++ + + + + + + +
M17 + + + + + + + + + + + + + + + +
F3 + + + + + + + + + + + + + + +
M21 + + + + + + + + + + + + + + + +

+ + + Tubul Durham este plin cu CO
2
fermentare energic
+ + Tubul Durham este doar 2/3 plin cu bule de gaz fermentare lent
+ Tubul Durham este 1/3 plin cu bule de gaz
Microorganismele pstrate n colecie trebuie meninute viabile i cu activitate de
biosintez la nivelul potenialului maxim.
Metoda de conservare adoptat a fost cea a trecerilor succesive pe medii de must de mal
- agar, n eprubete nclinate.
S-a trecut apoi la determinarea drojdiilor termorezistente. Lucrrile
efectuate n prezenta etap au avut n vedere cercetri privind comportamentul tulpinilor
de drojdie selecionate la concentraii superioare de D-glucoz, la temperaturi ridicate
(37
0
C), n vederea caracterizrii i identificrii lor din punct de vedere fiziologic.
Termorezistena tulpinilor de drojdii izolate s-a evideniat prin testarea creterii
lor la 37
0
C pe mediul extract de mal-agar.
Rezultate privind osmosensibilitatea unor tulpini de drojdii

Tulpina de drojdie
Osomosensibilitatea
(mal drojdie + 50% glucoz)
Termorezistena
E27 + (+)
F7 + (+)
D7 + (+)
M18 + (+)
M17 + (+)
F3 + (+)
M21 + (+)
+ rspuns pozitiv; - rspuns negativ; V rspuns variabil; (+) rspuns pozitiv printr-o dezvoltare moderat,
In ceea ce privete osmosensibilitatea, din datele prezentate n tabel se observ c
toate tulpinile de drojdii izolate au rspuns pozitiv, prin dezvoltare moderat pe mediile
testate, dup o perioad mai lung de timp (3 - 4 zile).
Determinarea alcoolorezistenei drojdiilor s-a efectuat prin experimentri care au avut ca
scop selecionarea cu ajutorul alcoolului etilic, n musturi cu concentraii ridicate, a celor
7 tulpini de drojdii izolate. Aprecierea fermentrii s-a fcut n comparaie cu dou drojdii
ce servesc drept martor i cu probe de must fr alcool.
Rezultatele obinute n studierea capacitii tulpinilor de drojdii izolate de a
fermenta mustul de mal n concentraii de 8 pn la 16% alcool sunt ilustrate n tabelul
nr.27
Se poate vedea din acest tabel ca n toate probele de must fr alcool fermentaia
demareaz n primele 24 ore.
n probele cu must de 8 % concentraie alcoolic fermentaia demareaz n
primele 24 de ore de la nsmnare.
n probele cu must de 9 % concentraie alcoolic fermentaia demareaz, n
primele 24 de ore de la nsmnare.
n probele cu must de 10 % concentraie alcoolic fermentaia demareaz n
primele 24 de ore de la nsmnare.
n probele cu must de 11 % concentraie alcoolic fermentaia demareaz n
primele 24 de ore de la nsmnare.
n probele cu must de 12 % concentraie alcoolic fermentaia demareaz n
primele 24 de ore de la nsmnare.
n probele cu must de 14 % concentraie alcoolic fermentaia demareaz n
primele 24 de ore de la nsmnare.
n probele cu must de 16 % concentraie alcoolic fermentaia demareaz n
primele 24 de ore de la nsmnare.
Pentru toate tulpinile de drojdii izolate, testate pe must cu concentraii diferite de
alcool (8 16% v/v), comparativ cu probe martor (must fr alcool), se remarc o
alcoolorezisten ridicat.

Experienele au continuat n staii pilot pe materialul vegetal porumb.
Experimentrile efectuate n condiii de laborator i pilot, pe plmezi pe baz de melas
i porumb, au demonstrat c se pot realiza culturi de drojdie cu potenial alcooligen,
capabile s fermenteze materii prime diferite.
Experimentrile n staie pilot s-au axat pe testarea a 7 tulpini de drojdie, izolate
din diverse medii. Condiiile de lucru au fost identice n toate cazurile, att din punct de
vedere tehnologic, ct i al utilajului.
n urma testelor de laborator, din cele 41 tulpini de drojdie luate n lucru, au fost
selecionate 7. Selecia s-a realizat pe baza nsuirilor de fermentare specifice fiecrei
tulpini, principalul indicator fiind coninutul de alcool n plmada fermentat.
Prin testele efectuate n staia pilot s-a remarcat tulpina F7, care a produs cea mai
mare cantitate de alcool n plmada fermentat. Tulpina F7 a produs rezultate bune n
cazul fermentrii plmezilor de melas i porumb.
Randament practic n etanol este de 93,9% din randamentul teoretic, ceea ce
reprezint un randament excelent, la un consum specific de 259,57 kg porumb / 100
litri etanol absolut.
Teza a continuat cu stabilirea tehnologiei cadru de obtinere a bioetanolului din
materii materii prime amidonoase (cereale).Rezultatele obinute arat c:
- experimentarile efectuate la temperatura de 30
0
C au nregistrat rezultate mai slabe dect
cele efectuate la temperatura de 35
0
C, ilustrate de coninutul de alcool obinut n
plmada fermentat, dar mai ales de zaharul rezidual la finalul fermentarii;
- procesul de fermentare n cazul arjelor 1 4 s-a oprit dup o perioad de timp mai
mare de 72 de ore;
- n cazul arjelor 1 4 cantitatea de zahr rezidual, respectiv glucoz, rmase
neconsumate la finalul procesului de fermentare sunt mari, reprezentnd pierderi, ceea
ce denot c procesul de fermentare nu a decurs n condiii optime;
- temperatura optima de desfaurare a ntregului proces este de 35
0
C;
- randamentul practic n etanol pentru sarjele 1 4 se situeaza n intervalul 84,58
87,73% din randamentul teoretic, ceea ce reprezint un randament bun, la o medie a
consumului specific de 294,16 kg porumb / 100 litri etanol absolut;
- randamentul practic n etanol pentru sarjele 5 8 se situeaz n intervalul 89,61 -
90,55% din randamentul teoretic, ceea ce reprezint un randament foarte bun, la o
medie a consumului specific de 267,38 kg porumb / 100 litri etanol absolut.

Procesul tehnologic de obtinere a etanolului din cereale (porumb), utiliznd
preparate enzimatice NOVOZYMES


Porumb
Plmdire Ap de
plmdire
Plmad
Dextrinizare
Alfa-amilaza
Plmad fermentat
Distilare
Borhot
Etanol 95% v/v
Deshidratare
BIOETANOL
Site
moleculare
Ap
indepartat
Regenerare site
moleculare
Fermentare
Zaharificare

Drojdie
Amilo-
glucozidaza









Procesul tehnologic de obtinere a etanolului din cereale (porumb), utilizand
preparate enzimatice GENENCOR

Pe baza experimentarilor efectuate la nivel de laborator i apoi verificate i validate la
nivel pilot, propunem urmatoarele variante tehnologice, cu potential de aplicare practica
la nivel industrial:
A. Fluxul tehnologic propus n cazul preparatele enzimatice NOVOZYMES

- mcinarea porumbului la o moar cu ciocnele, cu site cu orificii de 1 mm;
- hidromodul porumb : apa = 1 kg : 2 litri;
- adaos de Liquozyme SC in doza de 0,2 g / kg porumb ;
- adaos de ioni Ca
+2
in doza de 2 ppm (sub forma de clorura de calciu);
Porumb
Plmdire Ap de
plmdire
Plmad
Dextrinizare-
Zaharificare-
Fermentare
Enzime +
Drojdie
Plmad fermentat
Distilare Borhot
Etanol 95% v/v
Deshidratare
BIOETANOL
Site
moleculare
Ap
indepartat
Regenerare site
moleculare
- plmadire 10 minute, la temperatura de 50
0
C ;
- creterea temperaturii plmezii pn la 85
0
C;
- meninere la 85
0
C timp de 90 minute ;
- rcirea plmezii pn la 70
0
C, temperatura de adaos a amiloglucozidazei ;
- adaos de Spirizyme Fuel n doza de 0,5 ml / kg porumb;
- rcirea n continuare a plmezii pn la temperatura de 32
0
C, temperatura de
nsmnare cu drojdie;
- nsmnarea cu drojdie Ethanol Red sub form de soluie cu 20% substan uscat,
adgat n plmad n doz de 0,5% m/v;
- fermentarea alcoolica a plamezii s-a desfurat n urmtoarele condiii:
- temperatur - 32
0
C;
- pH - 4,5 4,8;
- adaos de uree n doza de 1000 ppm;
- s-a lucrat n varianta tehnologic cu reglarea valorii de pH la 4,5 prin adaos de H
2
SO
4

concentratie 1/6, urmat de meninerea pe tot parcursul fermentrii a acestei valori prin
adaos de ap amoniacal concentraie 25%,

B. Fluxul tehnologic propus n cazul preparatele enzimatice GENENCOR

- mcinarea porumbului la o moar cu ciocnele, cu site cu orificii de 0,6 mm (min, 95%
mcintur de dimensiuni 0,59 mm);
- raport porumb : apa = 1 : 2 (1 kg mcintur de porumb : 2 litri ap);
- dozarea porumbului macinat n apa i agitare timp de 1 or la temperatura de iniiere a
procesului de 35
0
C, Procesul s-a realizat sub form de agitare uoar i continu, care
s permit meninerea permanent n suspensie a particulelor de mcintur;
- dupa o or s-au adugat cele dou preparate enzimatice i ureea, astfel:
- adaos de preparat enzimatic STARGEN n doz de 1,7 g / kg porumb;
- adaos de preparat enzimatic FERMGEN n doz de 0,4 g / kg porumb;
- adaos de uree n doz de 1000 ppm;
- reglarea pH cu acid sulfuric concentraie 1/6 pn la valoarea de 4,2 fr reglarea
ulterioara a valorii de pH;
- nsmnarea cu drojdie Ethanol Red sub form de soluie cu 20% substan uscat,
adgat n plmad n doz de 0,5% m/v.