UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE CRAIOVA

INTRODUCERE N HISTOCHIMIE I
IMUNOHISTOCHIMIE

Partea I


PLANUL PREZENTRII

Prelucrarea i fixarea esutului
Secionarea i arhivarea
Principii de imunohistochimie

PLANUL PREZENTRII

Prelucrarea i fixarea esutului
Secionarea i arhivarea
Principii de imunohistochimie

Rolul fixrii
Previne autoliza i atacul bacterian
Modificrile anoxice, leziunile mitocondriale apar n 10
minute de la moartea esutului
Enzimele ciclului fosforilrii oxidative dispar n prima
or
Menine structura esuturillor aproape de
statusul in vivo
Prin aciunile lor mascheaz situsurile
antigenice recunoscute de anticorpi
Exist anticorpi sintetizai pentru epitopii fixai, dar au
utilizare limitat

Tipuri de fixativi (n funcie de aciune):

Denaturani (coagulani)
metanol, etanol, acid acetic
Cu funcie aditiv
aldehide, carbodiamide
Cu funcie mixt
cloruri mercurice
Tipuri de fixativi (n funcie de structur):
Aldehide: formaldehid, paraformaldehid,
glutaraldehid
Ageni oxidani:ioni metalici, tetraoxid osmic
Ageni coagulani:acid acetic, metanol, etanol
Ali ageni aditivi: carbodiamide
Factori fizici: cldur, microunde
Alte structuri: cloruri mercurice
Mecanismul fixrii
Unul din cei mai cunoscui fixatori, formalina,
fixeaz prin formarea de puni metilenice
ntre reziduurile peptidice
Metoda fixrii n formalin
Recoltarea piesei
Fixarea propriu zis
(formalina fixeaz 0,5 cm/h)
Deshidratarea esutului
(alcool 50%, 70%, 90%, 100%)
Clarificarea n xilen sau cloroform
(maxim o or, esutul devine friabil)
Includerea n blocul de parafin
* Greelile de
fixare i clarificare
sunt ireversibile,
deshidratarea se
poate reface
retrograd pornind
de la blocul de
parafin
PLANUL PREZENTRII

Prelucrarea i fixarea esutului
Secionarea i arhivarea
Principii de imunohistochimie

Secionarea cu ajutorul microtomului
1. Secionarea propriu-zis

Se obine o band continu
de seciuni unite.

2. Seciunile se ntind pe o
baie de ap cald i se
pescuiesc pe lam.

3. Se las s se usuce peste
noapte.
Prezervarea i secionarea esutului
Clasic, biopsiile sunt fixate n formalin neutr
tamponat, apoi fixativul este ndeprtat i esutul
deshidratat, splat ntr-un mediu puternic polar
(xilen sau cloroform), dup care este inclus n
parafin.
Secionarea se face cu ajutorul microtomului, la
grosimi variabile, de cel puin 1 m.
Tehnica este ideal pentru procedeele clasice de
microscopie n care secionarea subire duce la o
bun vizualizare cu obiective mari
esutul se poate post-fixa n glutaraldehid pentru
microscopie electronic (0.1 m).
PLANUL PREZENTRII

Prelucrarea i fixarea esutului
Secionarea i arhivarea
Principii de imunohistochimie

PRINCIPII DE IMUNOHISTOCHIMIE (IHC)
Introducere n IHC
Antigene, anticorpi
Ce este recuperarea antigenic?
Particulariti ale procesrii esutului
pentru IHC
Secvena tipic a IHC
Vizualizarea semnalului n IHC
INTRODUCERE N IMUNOHISTOCHIMIE (IHC)
Histochimia combin tehnicile de biochimie i histologie n
studiul compoziiei chimice a esuturilor i celulelor.

Imunologia se ocup de sistemul imun, de aspectele
umorale i celulare ale imunitii, de rspunsul imun.

Imunohistochimia (IHC) integreaz cele dou discipline
de mai sus.
INTRODUCERE N IMUNOHISTOCHIMIE (IHC)
IHC folosete o tehnologie bazat pe anticorpi pentru a
detecta i localiza antigene specifice tisulare.

Principiul de baz al IHC este faptul c un anticorp se
leag specific de un antigen prin formarea unui complex
antigen anticorp unic.

Aceast legtur (detecie) este folosit pentru
vizualizarea aspectelor normale i patologice ale
esuturilor, aspecte ce nu pot fi puse n eviden prin
tehnici normale de histochimie.
Antigene
Un antigen este un element strin self-ului fiecrui
organism, avnd proprietatea de a stimula formarea de
anticorpi, i apoi de a se lega la acei anticorpi.

De obicei, antigenele sunt proteine sau glicoproteine cu
mas molecular mare.

Un antigen ce determin un rspuns imun puternic se
numete puternic imunogen.
Antigene
Epitopul reprezint un situs de pe suprafaa antigenului
fa de care un anticorp complementar poate prezenta o
reactivitate specific.
Anticorpi
Anticorpul este o imunoglobulin capabil de o
reactivitate specific fa de antigenul care a declanat
sinteza sa.

Anticorpii sunt produi de limfocitele B ca rspuns la
invazia elementelor strine n organism (bacterii,
virusuri, etc.)

Specia de limfocite B responsabile de producerea
anticorpilor se numesc plasmocite, iar fiecare plasmocit
produce un anticorp cu o specificitate unic.
Anticorpi
Fiecare anticorp tipic este alctuit din patru polipeptide
unite ntr-o molecul n form de Y:
Dou lanuri grele
Dou lanuri uoare
Structura anticorpilor
Funcional, anticorpul tipic n form de Y este compus din
2 regiuni variabile de legare a antigenului (Fab) i
poriunea de activare a complementului (Fc).
Poriunea din fragmentul Fab direct implicat n legarea
epitopului se numete paratop.
Structura anticorpilor
Pe baza structurii fragmentului Fc, se deosebesc 5 clase
majore de anticorpi: IgG, IgM, IgA, IgD i IgE.
Lanurile grele ale imunoglobulinelor sunt de mai multe
tipuri: (gama), (miu), (alfa), (delta) i (epsilon).
Lanurile uoare pot fi clasificate ca lanuri (kapa) sau
(lambda).
Datorit prezenei sale majoritare n ser i a
perioadei crescute de njumtire, n IHC, IgG este
cea mai frecvent folosit clas de imunoglobuline.
Reacia antigen-anticorp
Anticorpii leag antigenele prin intermediul regiunilor
variabile. Aceste legturi sunt asigurate de cele 4 fore
non-covalente (hidrofobice, ionice, Van der Waals sau
puni de hidrogen).

Afinitatea este un indice al forei de legtur dintre un
anticorp monovalent i un epitop.

Aviditatea este cea care descrie afinitatea funcional, i
este de fapt o msur a afinitii totale de legare dintre
un anticorp i un antigen.

Producerea anticorpilor
n mod clasic, anticorpii sunt produi prin
imunizarea unor animale (iepure, oarece) fa de
antigenul purificat. Animalele rspund prin
producerea de anticorpi ce recunosc specific aceste
antigene.

Anticorpii pot fi policlonali sau monoclonali.

Producerea anticorpilor policlonali
Anticorpii policlonali se prezint ca diferite tipuri de
Ig produse de ctre mai multe clone de plasmocite
i recunosc epitopi variai ai antigenului.

Deoarece recunosc o clas de epitopi, au o toleran
crescut la variaii mici de structur a antigenului.

Iepurele este cel mai folosit animale pentru
producerea serurilor imune.

Producerea anticorpilor policlonali
Iepurele este injectat intradermic sau subcutanat cu
antigenul purificat.
antigen
Producerea anticorpilor policlonali
Sistemul imun al iepurelui produce anticorpi specifici
antigenului injectat.
Y
Y
Y
anticorpi
Producerea anticorpilor policlonali
Cnd se nregistraz producerea maximal de Ig,
sngele este recoltat de la nivelul urechii.
Producerea anticorpilor policlonali
Hematiile i fibrinogenul sunt eliminate, antiserul se
purific.
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Producerea anticorpilor monoclonali
Anticorpii monoclonali sunt derivai dintr-o singur clon
de limfocite B i sunt produi sub forma unei singure
clase de imunoglobuline.
Limfocitele B specifice sunt fuzionate cu celule
imortalizate (mielom) i formeaz un hibridom.
Celulele hibride se multiplic indefinit i produc n mod
continuu anticorpul monoclonal specific.
Anticorpii monoclonali recioneaz cu un anumit epitop al
antigenului (fond redus).
Acest fapt i face ns vulnerabili la prelucrarea chimic a
esutului (fixare).

Producerea anticorpilor monoclonali
antigen
oarecele este injectat intradermic sau subcutanat cu
antigenul purificat.
Producerea anticorpilor monoclonali
Sistemul su imun produce anticorpi specifici antigenului
injectat.
Y
Y Y
anticorpi
Producerea anticorpilor monoclonali
Limfocite B productoare de anticorpi sunt recoltate din
splin.
Limfocite B
splin
Producerea anticorpilor monoclonali
Limfocite B sunt fuzionate in vitro cu celulele
mielomatoase rezultnd celule hibride imortalizate sau
hibridoame.
Celule mielomatoase
Limfocite B
Producerea anticorpilor monoclonali
Hibridoamele produc la infinit copii identice ale unui
anticorp.
Producerea anticorpilor monoclonali
A. Hibridoamele sunt transplantate n cavitatea
peritoneal a unor oareci singeni, iar anticorpii produi
sunt recoltai ca lichid de ascit.
Producerea anticorpilor monoclonali
B. Hibridoamele sunt cultivate pe medii de cultur, iar
anticorpii produi sunt preluai sub form de supernatant.
ANTICORPII PRIMARI
Sunt anticorpii folosii la detecia antigenelor de interes.

Sunt disponibili n form concentrat sau prediluat.

Fia tehnic a anticorpului detaliaz de obicei diluiile
recomandate pentru diferite procedee. De multe ori ns este
necesar optimizarea n fiecare laborator.

Titrul anticorpului este cea mai mare diluie ce duce la o
marcare specific a structurilor de interes cu o marcare de fond
minim.


ANTICORPII PRIMARI
ANTICORPII PRIMARI
Secvena tipic a IHC
Secionare a blocului de parafin

Clarificare (solveni organici)

Hidratare (alcool n concentraie descresctoare)
Recuperarea antigenica

Splare n ap

Blocarea enzimelor endogene

Splare n sol. salin

Blocarea situsurilor antigenice nespecifice

Blocarea biotinei endogene

Incubare cu primul anticorp

Splare n sol. salin

Incubare cu anticorpul secundar i sistemul de detecie

Detecia semnalului

Deshidratarea, clarificarea i acoperirea cu lamela
Demascarea antigenic
Este procesul de recuperare a structurii
situsurilor antigenice blocate n timpul fixrii
Metode de demascare antigenic:
Fierbere n soluii tampon (citrat pH6, EDTA pH9)
Alternativ, se poate face o incubare la 80C peste
noapte n aceleai soluii tampon ca mai sus
Digestie enzimatic (proteinaz K, tripsin)
Digestie chimic (acid formic)
Particulariti ale procesrii esutului pentru
IHC
Recuperarea antigenicitii este o metod dur de
tratare a esuturilot. Frecvent duce la desprinderea
acestora de pe lam.
Pentru a preveni acest lucru se folosesc lame electrostatic +
(siliconi ncrcai pozitiv sau cu lizin): Super Frost / Poly
Lysine

Pentru un acces mai bun al anticorpilor la antigene,
se utilizeaz seciuni subiri (2-3m).
Secvena tipic a IHC
Soluia salin (PBS)
= 0,9g% NaCl

pH ~ 7,4

Se pot aduga detergeni
(Tween, Triton)
pentru seciunile mai groase.
esutul cu antigenele de interes,
Ex. endoteliul vascular prezint molecula CD34
Secvena tipic a IHC
Anticorpul primar, Ex. oarece anti-CD34 (uman)
Anticorpul se dilueaz n sol. salin
mbogit cu albumin
(un mediu asemntor plasmei sanguine)

Incubarea se poate face:
- 1 h la 37C
- peste noapte la 4C
Secvena tipic a IHC
Secvena tipic a IHC
Anticorpul senundar, cu sistemul de
vizualizare, Ex. iepure anti-oarece
Secvena tipic a IHC
Reacia se poate amplifica (tipuri de
amplificare n LP-ul urmtor).
Secvena tipic a IHC
Enzima cu care este etichetat anticorpul convertete un substrat
incolor ntr-un precipitat colorat (DAB, diamino benzidina).
Secvena tipic a IHC
Colorare cu DAB
40x 20x
Rezultatul precipitrii DAB