Microscopie

UMFCD - Biofizica

Microscopie - Dr. Octavian Clinescu

Microscopia

Greaca: mikrs = mic, skopein = a vedea

Primul microscop - inventat in sec XVI XVII

Prima tehnica microscopica = microscopia

optica

In prezent = o multitudine de tehnici de

microscopie

UMFCD - Biofizica

Microscopie - Dr. Octavian Clinescu

Tehnici de microscopie

Microscopie optica
o Microscopie optica de transmisie
o Microscopie de fluorescenta
o Microscopie confocala
o Microscopie STED (depletie prin emisie stimulata)
premiul Nobel pentru chimie 2014

Microscopie electronica
o Microscopie electronica de transmisie (TEM)
o Microscopie electronica de baleiaj (SEM)

Microscopie de forta atomica (AFM)

UMFCD - Biofizica

Microscopie - Dr. Octavian Clinescu

Microscopul optic componente

1. Ocularul contine lentilele ocular;
valori tipice ale maririi: 5x, 10x, 2x
2. Obiectivul marirea tipica de 4x, 5x,
10x, 20x, 40x, 50x, 100x
3. Masa sustine proba de examinat
4. Sursa de lumina
5. Condensorul controleaza
cantitatea de lumina ce ajunge la
proba
6. Macroviza
7. Microviza
UMFCD - Biofizica

Microscopie - Dr. Octavian Clinescu

Microscopia optica

Microscopie optica de transmisie

o
o
o
o

Lumina traverseaza proba

Lumina e absorbita diferentiat de componentele probei
De multe ori este nevoie de colorarea artificiala a probei
Imaginea finala este virtuala, marita si rasturnata

UMFCD - Biofizica

Microscopie - Dr. Octavian Clinescu

Microscopia optica

=
=
=

1 2

= =
4
41 2
2
=
1

=

=
1
=

1,22
=
2 sin
=

Putere

Grosisment

Putere separatorie
Rezolutie
o
o
o
o
o

UMFCD - Biofizica

l = lungimea de unda a luminii

n = indicele de refractie al mediului dintre obiectiv si preparat
u = unghiul de apertura a obiectivului
nsin u = NA (apertura numerica a obiectivului)
Cobiectiv, Cocular = convergenta obiectiv/ocular (in dioptrii)

Microscopie - Dr. Octavian Clinescu

Microscopia optica imersie in ulei

=

1,22 o
2 sin
o

UMFCD - Biofizica

Cu cat d e mai mica, cu atat pot fi distinse mai bine

detaliile fine
In practica, valoarea minima pentru d e de 200 nm (cu
lentile conventionale, 100 nm cu lentile speciale)

Microscopie - Dr. Octavian Clinescu

Microscopia optica de transmisie

Epiglota

Limba

Tesut adipos

Corpus luteum

www.olympusmicro.com
UMFCD - Biofizica

Microscopie - Dr. Octavian Clinescu

Microscopia de fluorescenta
o Vizualizarea luminii emise de molecule fluorescente
(necesita iluminarea/excitarea cu lumina de lungime de
unda mai scazuta)

Astrocita care exprima

GFP (Green Fluorescent
Protein)
UMFCD - Biofizica

Microscopie - Dr. Octavian Clinescu

Microscopia in contrast de faza

o Imbunatateste contrastul microscopiei de transmisie
o Transforma diferente de faza in diferente de amplitudine
o Nu necesita colorarea preparatului

Imagine in camp luminos

UMFCD - Biofizica

Imagine in contrast de faza

Microscopie - Dr. Octavian Clinescu

Microscopia confocala
o Permite vizualizarea unei sectiuni foarte subtiri din
preparat
o Prin scanarea la adancimi diferite se poate reconstrui o
imagine 3D a preparatului

http://www.hi.helsinki.fi/amu/AMU%20Cf_tut/cf_tut_part2-3.htm
UMFCD - Biofizica

Microscopie - Dr. Octavian Clinescu

Microscopia electronica de transmisie (TEM)

o Foloseste lentile electromagnetice
o Permite o rezolutie de maxim ~ 1
(1 = 10-10 m)

Mitocondrii
UMFCD - Biofizica

Microscopie - Dr. Octavian Clinescu

Microscopia electronica de baleiaj (SEM)

o Detecteaza electronii emisi de atomii care sunt loviti de un
fascicul de electroni
o Permite vizualizarea suprafetelor

Hematii
UMFCD - Biofizica

Microscopie - Dr. Octavian Clinescu

Microscopia de forta atomica (AFM)

o Un varf foarte ascutit este plimbat peste proba
o Atunci cand varful se apropie foarte mult de suprafata el
este deviat de diferite forte van der Waals, capilare,
electrostatice, magnetice etc.
o Vizualizeaza suprafetele

http://biologicalphysics.iop.org/cws/article/lectures/50698
UMFCD - Biofizica

Microscopie - Dr. Octavian Clinescu

Microscopia de depletie prin emisie stimulata

(STED)
o Permite imbunatatirea rezolutiei microscopiei confocale
o Fluorescenta moleculelor din afara
zonei tinta e impiedicata (depletie)

http://iopscience.iop.org/1367-2630/8/6/106/fulltext/
UMFCD - Biofizica

Microscopie - Dr. Octavian Clinescu

Activitate experimentala

Caracterizarea diametrului unei populatii de eritrocite

Pasi experimentali:
o

Calibrarea microscopului

Masurarea diametrului a 20-30 eritrocite

Calcularea diametrului mediu si a deviatiei standard

Reprezentarea grafica (histograma)

UMFCD - Biofizica

Microscopie - Dr. Octavian Clinescu

Calibrarea microscopului

Micrometru ocular = reticul

Micrometru obiectiv = diviziuni de 10 mm / 20 mm (scris pe micrometru)
Prin suprapunerea imaginii celor doua micrometre se determina
factorul de conversie (CF) al microscopului (in mm/div)
Micrometrul obiectiv e inlocuit cu un frotiu de sange

UMFCD - Biofizica

dcelula = diametrul unei

celule
Ndiv = numarul de
diviziuni de pe
reticul
Obmasurare = obiectivul
cu care s-a masurat
diametrul
Obcalibrare = obiectivul
cu care s-a facut
calibrarea

Microscopie - Dr. Octavian Clinescu

Folosirea corecta a microscopului

1. Se verifica pozitia preparatului pe lama si se plaseaza
aceasta fata spre obiectiv
2. Se aseaza lama si se fixeaza
3. Se alege un obiectiv de putere mica (10x) folosind
revolverul
4. Privind din lateral, se coboara obiectivul folosind
macroviza pana aproape atinge preparatul
5. Privind prin ocular, se ridica obiectivul folosind macroviza
pana cand imaginea e clara
6. Se alege un obiectiv mai puternic rotind revolverul
7. Se coboara obiectivul nou folosind microviza atentie,
daca se foloseste macroviza se poate sparge lama!
8. Se manipuleaza condensorul pana cand imaginea are
iluminarea si contrastul adecvate
UMFCD - Biofizica

Microscopie - Dr. Octavian Clinescu

Microscopia

Reticul (micrometru ocular)

Determinarea CF

INCORECT
UMFCD - Biofizica

Masurarea diametrului

CORECT
Microscopie - Dr. Octavian Clinescu

Analiza datelor
1. CF = mm/div

dmas
(div)

4. Deviatia standard: =

2. Masurarea
diametrului
Nr. crt.

3. Diametrul mediu:

dreal
(mm)

=1

2
(

=1

5. Histograma

1.
2.
3.

UMFCD - Biofizica

Microscopie - Dr. Octavian Clinescu

Contributii
Dr. Anca Popescu

UMFCD - Biofizica

Microscopie - Dr. Octavian Clinescu