ANALIZA MULTIPLEX PRIN TEHNOLOGIA XMAP

ARRAY
1.

PRINCIPIUL METODEI

Multiplexarea prin tehnologia xMAP este o tehnic proteomic ce

permite identificarea i cuantificarea simultan a seturilor de proteine
din probe biologice complexe, utiliznd ca suport solid pentru
imunodetecie populaii de microsfere marcate cu concentraii
precise de 2 fluorocromi; aceast marcare creeaz microsferelor
spectre unice de absorb ie.
n funcie de procentul de ncorporare specific a celor 2 fluorocromi
de marcare, care au spectre de citire n rosu i infrarou, au putut fi
create 100 de popula ii distincte de microsfere.

Fiecare dintre

aceste 100 de tipuri de microsfere poate fi acoperit cu anticorpi de

captur specifici. Astfel, 100 de analii diferii pot fi identificai i
cuantificai simultan din acelai volum de prob. Populaiile de
microsfere pot fi combinate ntre ele, fiecare populaie pstrndu-i
ns adresa spectral unic.
Dup legarea specific a analitului din proba de cercetat la anticorpul
care mbrac microsfera, se adaug un anticorp biotinilat care se va
lega la un alt epitop al analitului. Pentru eviden ierea reac iei
antigen-anticorp, amestecul este apoi incubat cu streptavidin-

ficoeritrin (SAPE), care va emite un semnal fluorescent direct

proporional cu cantitatea de analit din proba biologic de cercetat.
Tehnologia xMAP array st la baza funcionrii mai multor
platforme dezvoltate de ctre Luminex Corporation Luminex
100/200, FLEXMAP 3D, MAGPIX.
2. PLATFORMA

LUMINEX200

include

analizorul

Luminex 200, citometrul Luminex XY, sistemul Luminex SD

de livrare a fluidului Sheath, software-ul i PC-ul (Figura 1).

Figura 1 - Platforma Luminex200

Tehnologia folosit de platforma Luminex 200 are la baz:

- interaciunea specifica antigen-anticorp de tip ELISA (enzymelinked immunosorbent assay), care este nc considerat metoda
standard de analiz cantitativ a proteinelor. ELISA clasic permite
testarea unui numr mare de probe biologice, dar nu permite analiza
dect a unui singur analit pe o plcu cu 8/96/384 de godeuri n
func ie de format;

- tehnica citometriei n flux. n citometria n flux clasic, o

suspensie de celule este condus din tubul ce conine proba spre
analizor. Fiecare celul marcat fluorescent este analizat individual
i separat n grupuri specifice pe baza granularit ii, mrimii
celulare

i pozitivit ii fa de anticorpii cu care a fost marcat

suspensia celular. Zeci

i sute de mii de celule pot fi astfel studiate

individual n doar cteva secunde. Citometria n flux poate s

analizeze pe baza caracteristicilor fizice/biochimice

i alte particule

subcelulare n suspensie ca nuclei, organite celulare etc.

Platforma Luminex 200 folosete aceste dou metodologii,
mbinate cu idei inovatoare i analizeaz astfel microsfere (beadsuri) n locul celulelor, microsferele jucnd i rol de suport de legare
pentru moleculele de interes.

Figura 2 Dirijarea microsferelor spre camera de detecie

Etapele generale ale acestei tehnologii prezentate schematic n

Figura 2. Proba este aspirat la o rat de 1 l/sec i antrenat de
ctre fluidul specific (Sheath fluid) n cuva de msurare din
interiorul analizorului Luminex 200 cu o vitez de 90 l/sec astfel

nct s se creeze un flux laminar, iar prin acest proces de

focusare hidrodinamic, microsferele sunt direcionate una cte
una ctre camera de detecie, unde laserele bombardeaz
microsferele, iar semnalele fluorescente emise sunt analizate de
ctre procesoare de semnal digital de mare vitez (1000 de
evenimente /semnale de fluorescen pentru fiecare microsfer n
parte).

Microsferele MicroPlex-caracteristici
- microsfere de polistiren
-diametru mic (5.6 microni)

=5.6m

- u or de resuspendat n mediu
lichid
- raport optim suprafa/ volum
- cinetic rapid
- marcate fluorescent

Figura 3. Microsferele MicroPlex-caracteristici

Microsferele MicroPlex prezint pe suprafa grupri carboxil
pentru realizarea de legturi covalente stabile ntre suprafaa
microsferelor i setul de anticorpi specifici (Figura 3).

Activarea microsferelor pentru includerea n kitul de detec ie se

realizeaz de ctre productor prin incubare timp de 2 ore cu soluie
de anticorp. Pentru ndeprtarea reactivilor necuplai se realizeaz
etapele de splare, prevenind astfel i activarea gruprilor carboxil de
pe moleculele de proteine care ar determina formarea legturilor
protein - protein, n detrimentul legturilor specifice protein
microsfer (Figura 4).

Figura 4 Cuplarea microsferelor cu anticorpii specifici de captur

Iniial microsferele sunt produse n loturi foarte mari pentru a se

asigura o suprafa identic din punct de vedere chimic pentru
fiecare populaie de microsfere, apoi loturile sunt mprite n subloturi n vederea marcrii microsferelor prin imersarea acestora
ntr-o soluie organic ce conine un amestec de 2 fluorocromi.
Tehnologia xMAP folosete aceast tehnic de marcare a
microsferelor cu ajutorul unei combinaii precise de 2 fluorofori
(cu lungime de unda de excitatie la 635 nm si benzi de emisie la
658, respective 712 nm), astfel putnd fi creat o hart cu 100 de
populaii distincte de microsfere. n funcie de raporturile de

concentratie ale fluoroforilor, fiecare microsfer interogat emite

o fluorescen cu o adres spectral unic ce aparine unei
anumite populaii de microsfere (Figura 5).

Figura 5 Harta popula iilor de microsfere 100-plex.

Alte tipuri de Microsfere

MagPlex sunt microsfere avnd n compozi ia chimic polistiren
cu proprieti magnetice; pot fi create 500 de populaii distincte cu
adrese spectrale unice.
MagPlex-TAG sunt microsfere din polistiren cu proprieti
magnetice

i care au fost cuplate cu oligonucleotide; pot fi create

pn la 150 de populaii distincte, fiecare populaie avnd o

secven unic de 24 de perechi de baze ADN.
LumAvidin sunt microsfere din polistiren

i care sunt direct

cuplate cu avidin, putnd fi create 100 de populaii distincte de

microsfere.

Sunt

adecvate

pentru

testri

proteice

imunogenetice.
SeroMAP sunt microsfere de polistiren, optimizate pentru
reducerea legturilor nespecifice dintre molecule, fiind astfel
ideale pentru testri serologice. Reprezint varianta mbuntit a
microsferelor MicroPlex.
Tehnologia xMAP array n 5 etape (diagrama din Figura 6)
1. Resuspendarea microsferelor
2. Legarea anticorpului de captur specific (cuplarea)
3. Adugarea analitului de cercetat (antigenul)
4. Legarea anticorpului de detecie biotinilat la un alt epitop al
antigenului
5. Legarea complexului streptavidin-ficoeritrin (SAPE)
molecula raportor

Figura 6. Microsfera cuplat cu anticorpul de captur care s-a legat de

antigenul din proba de analizat. Reac ia antigen-anticorp a fost eviden iat
prin anticorpul de detec ie biotinilat care a cuplat molecula-raportor

Microsferele antrenate ntr-un singur ir ctre camera de detecie

trec consecutiv prin faa a dou fascicule laser:
LASERUL ROU realizeaz identificarea microsferei pe baza
adresei spectrale unice identific analitul de cercetat.
LASERUL

VERDE

excit

ficoeritrina

fluorescena acesteia cuantific analitul de cercetat.

determin

Figura 7 Excitarea microsferelor de ctre cele dou tipuri de lasere

Laserul rou (laser pentru clasificare, lungime de und = 635

nm) excit cei 2 fluorocromi ncorporai n microsfer, care vor
emite semnale fluorescente ce vor putea fi msurate de ctre o
serie de fotodiode (3 APD = Avalanche Photodiode). n acelai
timp, fiecare microsfer sau microsfere legate nespecific ntre ele
(dublete), bule de aer etc. emit fluorecen n funcie de
dimensiunea fiecreia, semnalul fiind preluat de alt serie de
fotodiode care permite determinarea mrimii fiecrei particule
interogate.
Laserul verde (laser Yttrium-Argon-Germanium, la lungimea de
und = 532 nm) excita microsferele iar fotomultiplicatorul
(PMT, photomultiplier) detecteaz semnalele raportor emise de
ctre ficoeritrina legat de suprafaa microsferelor. Intensitatea
fluorescenei este direct corelat cu cantitatea de analit legat de
microsfer.

Sistemul optic analog unui citometru clasic este reprezentat n

Figura 8.

Figura 8 Sistemul optic al Platformei Luminex 200 Laser de 532

nm (laser raportor) i 635 nm (laser clasificator) fotomultiplicator (PMT pentru
ficoeritrina, 565-585 nm), APD pentru detectie clasificator 1 si 2; APD opus
PMT = discriminator de dublet

Analiza i prelucrarea datelor

Sistemul de analiz Luminex 200 este capabil s proceseze i s
nregistreze pn la 20.000 de evenimente/secund (Diagrama
Figurii 9).!
n urma aciunii sistemului optic sunt nregistrai
4 parametri pentru fiecare microsfer:
-

emisia moleculei raportor la =565-585nm (RPT)

emisia fluorescent a microsferei la = 635nm (DD)

emisia fluorocromului cu spectru rou cu care este marcat

microsfera (CL1)

emisia fluorocromului cu spectru infrarou cu care este

marcat microsfera (CL2)

Luminex200 Procesarea semnalului

APD ( CL1, CL2, DD),
PMT (RPT)

SEMNALE
FLUORESCENTE

PROCESOR DE
SEMNALE

SEMNALE DIGITALE:
(HISTOGRAME)

MEDIAN
FLUORESCENCE
INTENSITY (MFI)

CURBA DE ETALONARE
FIVE PARAMETER LOGISTICS

pg/mL
Figura 9. Schema de procesare a fluorescen ei captate pe fotomultiplicator
pn la furnizarea rezultatelor exprimate ca

i concentra ie /mL.

3. TIPURILE DE PROBE BIOLOGICE ce pot fi analizate prin

tehnologia xMAP array i pregatirea/prelucrarea lor:
3.1.SER
- sngele recoltat n vacutainer cu capac rou (fr anticoagulant)
este lsat s coaguleze cel puin 30 de minute
- se centrifugheaz 10 min la 1000g
- serul se separ i se analizeaz imediat sau este alicotat n tuburi
de polipropilen i stocat la < -20C
3.2.PLASMA
- sngele se recolteaz pe anticoagulant (EDTA) i se
centrifugheaz timp de 10 min la 1000g n maxim 30 min de la
recoltare
- plasma se separ i se analizeaz imediat sau este alicotat n
tuburi de polipropilen i stocat la <-20C
3.3.SUPERNATANII DE CULTURI CELULARE
-dup recoltare se centrifugheaz pentru a ndeprta resturile
celulare
-se analizeaz imediat sau sunt stocai n aceleai condiii descrise
mai sus
n cazul n care sunt analizate probe congelate, acestea se
decongeleaz complet, se vortexeaz i apoi se centrifugheaz. Se
recomand evitarea repetrii ciclurilor nghe/dezghe.

Serurile i plasma se dilueaz nainte de analiz conform

recomandrilor productorului sau conform diluiei optime
determinate n prealabil.
Alte probe biologice ce pot fi analizate prin tehnologia xMAP
array: lichid cefalorahidian (LCR), urin, saliva, lichid sinovial,
pleural etc.
n cazul supernatanilor de culturi celulare sau a extractelor
tisulare, se recomand determinarea concentraiei de proteine
nainte de efectuarea analizei.
Trasabilitatea probelor este asigurat prin alocarea unui cod unic de
identificare pentru fiecare prob, cod ce nsoete probele pe timpul
analizelor/stocare i se regsete att n sistemul informatic al
laboratorului, ct i n registru. E antioanele extrase din prob trebuie
de asemenea s fie trasabile la proba primar.
4. METODOLOGIA DE MULTIPLEXARE
Kitul furnizat de ctre MERCK-MILLIPORE (Figura 9) este
livrat

cu

urmtoarele

componente: microsfere x-plex,

standard

liofilizat,

controale

QC1 i QC2, soluie SAPE,

matrix

(pentru

ser/plasm),

anticorpi de detecie, plcua cu

96 godeuri filtrante, tampon de
diluare a microsferelor, tampon de splare, protocolul kitului.
Figura 10 - Kit furnizat de ctre MERCK-MILLIPORE

Urmtorii reactivi

i echipamente trebuie s fie asigurate de

utilizator:
Luminex Sheath Fluid
Pipete ajustabile pentru volume cuprinse ntre 25

i 1000 L

Pipete multicanal
Flacoane de preparare pentru reactivi
Tuburi de propilen pentru microcentrifugare
Folie de aluminiu
Benzi de cauciuc
Tampoane absorbante
Vortex Mixer
Sonicator
Shaker pentru plcu ele de lucru
Pomp de vid pentru filtrare
Suport pentru placa

Pregtirea kitului
Toate componentele kitului trebuie lsate s ajung la temperatura
camerei nainte de a fi folosite.
Pregtirea suspensiei de microsfere tapetate cu anticorpi de
captur:
-Fiecare flacon coninnd microsferele dintr-o anumit populaie
se sonicheaz 30 secunde i se vortexeaz 1 minut

-Se realizeaz un cocktail prin adugarea a cte 60 L din fiecare

flacon ce conine suspensia de microsfere i tampon de diluare a
microsferelor pn la un volum total de 3 mL conform
recomandrilor kitului.
Pregtirea suspensiei ce conine anticorpii de detectie
biotinilai:
-Se vortexeaz soluia stock ce conine anticorpii de detecie
biotinilai i se reconstituie cu tampon de reacie conform
recomandrilor din protocol
Pregtirea suspensiei ce conine SAPE:
-Se vortexeaz soluia stock ce conine SAPE i se aduce la
concentraia de lucru

cu tampon de reacie conform

recomandrilor din protocol

Pregtirea controalelor QC:
-Controalele QC1 i QC2 se resuspend folosind ap ultrapur
conform recomandrilor din protocol
-Se agit flacoanele i apoi se vortexeaz
-Se las 5-10 minute apoi se transfer n tuburi de polipropilen,
care pot fi pstrate timp de maxim 1 lun la -20C.
Pregtirea tamponului de splare:
-Tamponul de splare (10x) se aduce la concentraia de lucru
folosind ap ultrapur.
Pregtirea matricei:
-Pentru probele din ser i plasm se va utiliza matricea de ser
furnizata n kit. Aceasta se reconstituie adugnd tampon de

reacie conform recomandrilor din protocol i se va lsa 10

minute nainte de a fi utilizat.
Pregtirea standardelor:
-Standardul furnizat n kit se reconstituie folosind ap ultrapur i
se amestec pn la dizolvare.
-Se agit i se vortexeaz, apoi se las 5-10 minute nainte de a fi
utilizat. Acesta reprezint standardul cu concentraia cea mai
mare.
-Pornind de la standardul cu concentraie maxim, se realizeaz
diluii seriale cu ajutorul tamponului de reacie. Ultimul tub
conine numai tampon de reacie care se utilizeaz ca standard cu
concentraia 0 (vezi Figura 11).

Figura 11 -Diluii seriale pentru realizarea curbei de etalonare

5.PROTOCOL DE LUCRU
Poate fi parcurs n 2 zile dac se aplic
incubarea peste noapte.

Imunodetecie ziua I
-Se umezesc filtrele n prealabil cu tampon de splare/de reacie.
-Se ndeprteaz tamponul prin aspirare cu pompa de vid, apoi se
ndeprteaz excesul de tampon prin tapotare pe prosoape de
hrtie.
-Se adaug standardele, controalele i tamponul de reacie n
godeurile destinate probelor.
-Se adaug matrixul peste standarde i controale. n cazul
analizrii de supernatani din culturi celulare/ lizate tisulare, se
folosete drept control mediul de cultur adecvat.
-Se adaug probele biologice diluate n prealabil conform
recomandrilor din protocol.
-Se adaug cocktail-ul de microsfere pregtit dup ce a fost
vortexat n prealabil.
-Plcua cu 96 de godeuri se sigileaz cu o folie i se incubeaz la
ntuneric la temperatura camerei (20-25 C) timp de o or sau
peste noapte la 4C cu agitare continu.

Imunodetecie ziua II
-Plcua cu 96 de godeuri se filtreaz cu ajutorul pompei de vid.
-Se realizeaz splri cu tampon de splare pentru ndeprtarea
substanelor nelegate folosind pompa de vid, iar la sfrit se
tapoteaz plcua pe prosoape de hrtie.
-Se adaug soluia ce conine anticorpii de detecie biotinilai
-Se sigileaz plcua cu o folie i se incubeaz o or la
temperatura camerei (20-25 C) daca s-a urmat protocolul cu
incubare peste noapte sau 30 minute dac s-a urmat protocolul cu
incubare la temperatura camerei.
Atenie! Nu se aspir cu pompa de vid dup incubare.
-Se adaug suspensia ce conine SAPE.
-Se sigileaz plcua cu o folie i se incubeaz 30 minute la
temperatura camerei (20-25 C) cu agitare continu.
-Se filtreaz plcua cu ajutorul pompei de vid.
-Se realizeaz splri cu tampon de splare pentru ndeprtarea
substanelor nelegate folosind pompa de vid, iar la sfrit se
tapoteaz plcua pe prosoape de hrtie.
-Se adaug fluidul de antrenare a microsferelor (Sheath Fluid).
-Se resuspend microsferele prin agitare 5 minute pe shaker.
-Se citesc probele

utiliznd platforma Luminex 200, dup

editarea protocolului de msurare i realizarea mentenanei

sistemului.

6.EDITAREA PROTOCOLULUI DE MSURARE

Definirea kitului i a plcuei este o etap necesar nainte de
citirea probelor

i se poate efectua i nainte de realizarea

nclzirii sistemului (vezi mai jos sec iunea MENTENANA

DE PORNIRE A PLATFORMEI)
n cadrul acestei etape se editeaz denumirea kitului, a analiilor
(x-plex), numrul de concentraii pentru curba standard i
numrul de controale (Figura 12).

Fig. 12 Ecranul n care se editeaz denumirea kitului, a anali ilor,

numrul de standarde i de controale.

-se selecteaz populaiile de microsfere analizate (x-plex), se

introduc unitile de msur (pg/mL), se selecteaz modul de
reprezentare a rezultatelor i de calculare a curbei standard (five

parameter logistics sau conform recomandrilor kitului) Figura

13.

Fig. 13 Ecranul n care se editeaz propriet ile fiecrui test

-se introduc datele legate de furnizor, date de expirare, loturi

(Figura 14);
-se introduc concentraiile pentru calcularea curbei standard (se
pot introduce doar cele mai mari concentraii i factorul de diluie
iar restul de concentraii vor fi generate automat) (Figura 15)

Fig. 14 Ecranul n care se introduc informa ii legate de furnizorul de reactivi,

data de expirare, numrul lotului

Fig. 15 Ecranul n care se introduc concentra iile standardelor pentru fiecare

test

-se introduc valorile pentru controale, se verific kitul.

-se definesc poziiile (standard, control, probe) pentru achiziia
datelor (Figura 16).

Fig. 16 Ecranul n care se definesc pozi iile pentru standarde, controale

probe
n vederea achizi iei datelor

Achiziia datelor
Pentru achiziia datelor, se deschide worklist-ul setat anterior,
plcua se introduce n sistem i se selecteaz numrul de
evenimente ce va fi analizat pentru fiecare populaie n parte,
timpul pentru achiziie, numrul maxim de evenimente dup care
se poate opri achiziia datelor i volumul din care se va realiza
analiza (Figura 17).

Fig. 17 Ecranul n care se selecteaz condi iile de oprire a achizi iei datelor

7. NOIUNI PRIVIND SOFTUL STARSTATION 2.3 I

NTREINEREA SISTEMULUI
Utilizare - se selecteaz din Instrument controls i se ruleaz
scripturile predefinite. Folosirea scripturilor permite parcurgerea
facil a mai multor pai pentru realizarea mentenanei sistemului.

Fig. 18 Ecranul n care se deruleaz protocolul de ini ializare a sistemului

MENTENANA DE PORNIRE A PLATFORMEI

Derularea protocolului de iniializare a sistemului (Default Startup) cuprinde urmtoarele operaiuni (Figura 18)
-nclzirea laserelor dureaz aproximativ 30 de minute (un timer
din bara de instrumente va indica timpul rmas pn la nclzirea
complet).
-Verificarea presiunii sistemului (normal 6-9 psi).
-ndeprtarea bulelor de aer din sistem (comanda Prime) i ciclul
de splare cu alcool etilic 70%, ap i Sheath fluid.
AJUSTAREA NLIMII SONDEI (AC DE PIPETARE)
-Se efectueaz nainte de citirea plcuei i de realizarea calibrrii
sistemului.
-Se realizeaz cu ajutorul kitului de aliniament furnizat la
achizi ia platformei (2-3 discuri de metal pentru plcua cu 96

de godeuri cu baza plat sau o sfer metalic pentru godeuri cu

baza rotunjit).
-De asemenea este obligatoriu ca volumul final n fiecare godeu al
plcuei s fie cu cel puin 30 L mai mult dect volumul setat
pentru a fi preluat de ctre sond (care este aprox. de 50 L).
CALIBRAREA SISTEMULUI
-Se realizeaz dup ce sistemul i-a ncheiat cu succes paii de
mentenan (care pot genera cldur).
-Pentru o performan optim se recomand calibrarea sistemului
n fiecare zi ca parte a protocolului de mentenan i de fiecare
dat cnd variaiile de temperatur afiate pe bara de instrumente
sunt +/- 3C.
-Statusul calibrrii sistemului este afiat pe bara de instrumente,
individual pentru cei 2 calibratori (Figura 19?):
Cal 1- Classification Calibrator
Cal 2- Reporter Calibrator

Figura 19 Bara de instrumente ce furnizeaz n orice moment date despre

statusul sistemului

-Calibratorii sunt populaii de microsfere cu proprieti de difuzie

a luminii i intensiti fluorescente cunoscute care se ncadreaz
n lungimile de und ale canalelor RPT, DD, CL1 i CL2.

-Rata evenimentelor n timpul calibrrii este afiat pe bara de

instrumente

trebuie

se

ncadreze

ntre

100-300

evenimente/secund.
-O rat mic de evenimente sugereaz o ajustare incorect/
nfundare a sondei.
-Calibrarea se realizeaz efectiv prin adugarea a cte 5 picturi
de Cal 1 i Cal 2 n godeurile selectate.
CONTROLUL SISTEMULUI
-nainte de efectuarea controlului sistemului, ne asigurm c
sistemul a fost nclzit, sonda curat i ajustat corespunzator,
iar calibrarea s-a ncheiat cu succes.
-Se deruleaz dup selectarea script-ului Control Verification care
se regsete n Instrument Controls.
-Microsferele de control (CON 1 i CON 2) sunt folosite pentru
verificarea calibrrii i a integritii optice a sistemului.
-CON 1 (Classification Control Beads) sunt folosite pentru
verificarea eficienei clasificrii microsferelor. CON 1 este un
cocktail de 5 populaii diferite de microsfere folosite pentru
verificarea funcionrii la parametri optimi a canalelor de
clasificare. Aceste populaii de microsfere sunt special selectate
pentru a corespunde unei zone periferice a hrii populaiilor de
microsfere, ID-ul lor fiind 6, 21, 73, 81 i 96 (vezi

i Figura 5).

-CON 2 (Reporter Control Microspheres) este un cocktail care

conine n proporii relativ egale 4 populaii de microsfere cu

concentraii diferite de fluorocrom (ficoeritrin molecula

raportor). Sunt folosite pentru verificarea funcionrii la parametri
optimi a canalului raportor pentru ficoeritrin. Microsferele CON
2 nu au amestecul de 2 fluorocromi cu care sunt marcate
populaiile de microsfere MicroPlex, dar au 4 nivele de
concentraii de ficoeritrin. Aceste microsfere nu pot constitui un
4-plex veritabil, deoarece nu pot fi identificate individual sau demultiplexate prin filtre de clasificare (gating).
Controlul efectiv se realizeaz prin adugarea a cte 5 picturi de
CON 1 i CON 2 n godeurile selectate.
MENTENANA DE NCHIDERE A PLATFORMEI
-Se realizeaz prin derularea operaiunilor din script-ul Default
Shutdown: SANITIZE (dureaz 5 minute i folosete hipoclorit
pentru decontaminarea sistemului i a sondei) i SOAK (folosete
apa ultrapur pentru reducerea potenialului de precipitare a
srurilor coninute de Sheath fluid).
ANALIZA I PRELUCRAREA REZULTATELOR.
EXPORTUL DATELOR
Platforma Luminex 200 afieaz n timp real informaii legate de
achiziia datelor; astfel pot fi urmrite histogramele care apar n
cele 3 ferestre (DD, CL1/CL2, RPT) (Figura 20).

Fig. 20 Histogramele afi ate n ferestrele DD, CL1/CL2, RPT

Pentru analiza i prelucrarea rezultatelor se va urmri aspectul

fiecrei curbe corespunztoare analiilor luai n studiu i se vor
elimina valorile aberante (valorile eliminate din curba standard
vor fi reprezentate prin elipse goale) (Figura 21).

Fig. 21 Exemplu de curb standard pentru IL-4R

Softul permite calcularea a 4 variante de curb (se va selecta

varianta optim conform recomandrilor kitului de multiplexare) (Figura 22).

Fig. 22 Exemplu de selectare a variantei de curb

-Dup optimizarea curbelor standard, rezultatele pot fi salvate

ntr-un fiier de format .xml. Se poate genera un raport al analizei
sau fiierul poate fi importat n documente de tip Microsoft Excel
(Figura 23).

Figura 23 Exemplu de raport generat n urma citirii plcuei

8.TEHNOLOGIA

XMAP

ARRAY

UTILITATE

AVANTAJE
Vitez

1 set de microsfere = 1 analit/prob biologic.

Flux Crescut

100 seturi de microsfere = 100 de analii/prob

biologic.
De exemplu pentru 100-plex:
30 de probe x 100 de analii/prob biologic = 3000
analii
Ace ti 3000 de analiti sunt msurai simultan pe o
plcu cu 96 de godeuri.

Versatilitate

Analiza variat de biomarkeri (acizi nucleici,

proteine, enzime etc.) datorit posibilitii cuplrii
microsferelor cu diverse molecule (anticorpi /
antigene, peptide / oligonucleotide, alte proteine i
molecule mici).

Reproductibilitate

Numrul mare de microsfere din acelai lot permite

standardizarea testului n comparaie cu testele pe

suport solid (ELISA).

Acuratee

Analiza n timp real.

Acurateea procesrii datelor.

Flexibilitate

Platforma Luminex 200 permite updatarea soft-ului

pentru

folosirea

microsfere

kiturilor

magnetice

xPONENT 3.1).

de

(exemplu

multiplexare

cu

software-ul

III.

BIBLIOGRAFIE

1. B. Nolen, A. Lomakin, W. L. Bigbee, J. Siegfried and A. Lokshin.

Serum biomarkers for early detection of lung cancer. Journal of Clinical
Oncology, 2010 ASCO Annual Meeting Proceedings (Post-Meeting
Edition).Vol 28, No 15_suppl (May 20 Supplement), 2010: e21057.
2.

Faina Linkov1, Robert L. Ferris, Zoya Yurkovetsky, Adele

Marrangoni, Lyudmila Velikokhatnaya, William Gooding, Brian Nolan,

Matthew Winans, Eric R. Siegel, Anna Lokshin, and Brendan C. Stack
Jr. Multiplex analysis of cytokines as biomarkers that differentiate
benign and malignant thyroid diseases. Proteomics Clin Appl. 2008
October 10; 2(12): 15751585.
3. Panel Jindra Vrzalova, Marketa Prazakova, Zdenek Novotny, Ondrej
Topolcan, Miroslava Casova, Lubos Holubec Jr. Test of Ovarian
Cancer Multiplex xMAP Technology. ANTICANCER RESEARCH 29:
573-576 (2009).
4. Xu BJ, An QA, Srinivasa Gowda S, Yan W, Pierce LA, Abel
TW, Rush SZ, Cooper MK, Ye F, Shyr Y, Weaver KD, Thompson RC.
Identification of blood protein biomarkers that aid in the clinical
assessment of patients with malignant glioma. Int J Oncol. 2012. Epub
2012 Feb 3.

5.

Melinceanu

R, Sarafoleanu

L, Lerescu
C, Salageanu

L, Tucureanu
A.

C, Caras

Serum perioperative

I, Pitica
profile

of cytokines in patients with squamous cell carcinoma of the larynx. J

Otolaryngol Head Neck Surg. 2011 Apr;40(2):143-50.
6. Bortolin MT, Tedeschi R, Bidoli E, Zanussi S, Pratesi C, Vaccher
E, Tirelli U, De Paoli P. Multiplex analysis of blood cytokines as a
prognostic tool in HIV related non-Hodgkin lymphoma patients: a
potential role of interleukin-Cytokine 2012 Oct;60(1).
7. Ayalew Tefferi, Rakhee Vaidya, Domenica Caramazza, Christy
Finke, Terra Lasho, and Animesh Pardanani. Circulating Interleukin
(IL)-8, IL-2R, IL-12, and IL-15 Levels Are Independently Prognostic in
Primary Myelofibrosis: A Comprehensive Cytokine Profiling Study.
Journal of Clinical Oncology, vol.29, No.10, 2011.
8. Zia A. Dehqanzada, Catherine E. Storrer, Matthew T. Hueman,
Rebecca J. foley, Katie A. Harris1, Yusuf H. Jama, Craig D. Shriver,
Sathibalan Ponniah, George E. Peoples. Assessing serum cytokine
profiles in breast cancer patients receiving a HER2/neu vaccine using
Luminex technology. Oncology Reports, 17: 687-694, 2007. 687
9. Clint Allen, Sonia Duffy, Theodoros Teknos, Mozaffarul Islam,
Zhong Chen, Paul S. Albert, Gregory Wolf, Carter Van Waes. Nuclear
Factor Kappa-B-Related Serum Factors as Longitudinal Biomarkers of
Response and Survival in Advanced Oropharyngeal Carcinoma. Clin
Cancer Res 2007;13(11) June 1, 2007.
10. Hamerlik P, Lathia JD, Rasmussen R, Wu Q, Bartkova J, Lee M, et
al. Autocrine VEGF-VEGFR2-Neuropilin-1 signaling promotes glioma

stem-like cell viability and tumor growth. The Journal of experimental

medicine. 2012;209(3):507-20. Epub 2012/03/07.
11. Wehland M, Bauer J, Magnusson NE, Infanger M, Grimm D.
Biomarkers for anti-angiogenic therapy in cancer. International journal
of molecular sciences. 2013;14(5):9338-64. Epub 2013/05/01.
12. Sharma T, Dhingra R, Singh S, Sharma S, Tomar P, Malhotra M, et
al. Aflibercept: a novel VEGF targeted agent to explore the future
perspectives of anti-angiogenic therapy for the treatment of multiple
tumors. Mini reviews in medicinal chemistry. 2013;13(4):530-40. Epub
2013/01/16.
13. Yun SM, Jung KH, Lee H, Son MK, Seo JH, Yan HH, et al.
Synergistic anticancer activity of HS-173, a novel PI3K inhibitor in
combination with Sorafenib against pancreatic cancer cells. Cancer
letters. 2013;331(2):250-61. Epub 2013/01/24.
14. Tanase CP, Dima S, Mihai M, Raducan E, Nicolescu MI, Albulescu
L, et al. Caveolin-1 overexpression correlates with tumour progression
markers in pancreatic ductal adenocarcinoma. Journal of molecular
histology. 2009;40(1):23-9. Epub 2009/01/23.
15. Tanase CP, Neagu M, Albulescu R, Hinescu ME. Advances in
pancreatic

cancer

detection.

Advances

2010;51:145-80. Epub 2010/09/23.

in

clinical

chemistry.