1

BIOCHIMIE
LABORATOR 1/08.03.2012
ANALIZA FOTOCOLORIMETRIC
Analiza fotocolorimetric este acea metod de analiz cantitativ fizico-chimic care
se bazeaz pe msurarea intensittii de culoare a unei soluii, intensitate care este direct
proporional cu concentraia substanelor de analizat din soluie.
Consideraii generale
Orice raz de lumin care provine de la o surs este alctuit din radiaii cu = 400
760 nm, ceea ce reprezint domeniul vizibil, dar i din radiaii cu >760 nm domeniul
infrarou (IR) i <400 nm domeniul ultraviolet (UV).
Se numete radiaie monocromatic o singur radiaie caracterizat de o singur
lungime de und i deci de o singur culoare.
S-a constatat c, substanele din care sunt alctuite corpurile absorb din spectrul vizibil
n mod selectiv radiaiile, adic le absorb pe toate cu excepia aceleia n care corpurile apar
colorate.
Pornind de la aceste date, fizicianul Lambert a emis legea de baz a fotocolorimetriei
care spune c: straturi de soluii (colorate) de aceeai grosime i care conin dizolvat o
anumit cantitate de substan absorb n condiii experimentale identice aceeai cantitate din
lumina incident. Aceasta lege se transpune ntr-o ecuaie matematic de forma:
It = Io 10 -k d

unde:

It = intensitatea radiaiei transmise

Io = intensitatea radiaiei care cade pe suprafaa soluiei
k = coeficient de extincie
d = grosimea stratului de lichid absorbant
S-a demonstrat experimental c coeficientul k este direct proporional cu concentraia
substanelor dizolvate n soluie.
K= c

unde:

= coeficient de proporionalitate
c = concentraia substanei dizolvate n soluie.
Ii = Io 10 c d
Aceasta este legea Lambert- Beer, este legea fundamental a analizei fotocolorimetrice
i este valabil pentru o radiaie monocromatic.

Mrimi fotometrice
In analiza fotocolorimetriei se lucreaz cu 3 mrimi:
I o 10 ccd
=
= 10-cd
Io

- transmisia

T=

It
Io

- absorbia

A=

Io It
Io

- extincia

E = lg

1
T

= lg

1
10

cd

= cd

Dac n aceast relalie considerm c grosimea stratului de soluie care absoarbe lumina este
constant d = constant atunci relaia de mai sus devine:
E= c
Aceasta relaie poate fi transpus ntr-o funcie matematic de forma E = f(c), a carei
reprezentare grafica este o dreapta care trece prin origine.

S-a constatat ns c la concentraii mari de substana dizolvate n soluie, dreapta

graficului se aplatizeaz (capat un palier). Pe aceast poriune nu mai este proporionalitate
direct ntre extincie si concentraie i nu ne mai intereseaz din punct de vedere al metodei
fotocolorimetrice.

BIOCHIMIE
LABORATOR 2/15.03.2012
FORMULA GENERAL DE CALCUL DIN ANALIZA FOTOCOLORIMETRIC
Dac facem urmatoarele presupuneri:
- fie C1 concentraia cunoscut n compusul de analizat a unei soluii sau probe de
analiza C1 = Cp
- fie C2 concentraia n compusul de ananlizat, dar cunoscut dintr-o soluie care porta
numele de etalon C2 = Cet
- presupunem c E1 reprezint extincia, determinat cu ajutoul unui instrument optic,
a soluiei de analizat E1 = Ep
- fie E2 extincia determinat cu ajutorul acestui aparat optic a soluiei etalon E2 = Eet
Ep
Cp

E et

= C
et

Cp =

Ep
E et

Cet

Aceasta este formula general de calcul din analiza fotocolorimetric.

Aparatura folosit n analiza fotocolorimetric spectrofotometre. Cel mai utilizat este
spectofotometrul SPEKOL. Este un fotometru cu celul fotoelectric care functioneaz cu un
singur fascicul de lumin provenit de la o lamp, iar msurarea extinciei se face prin metoda
deviaiei.
Metode de determinare a concentraiei unei substante dintr-o solutie prin fotocolorimetrie
Exist 2 metode:
a) metoda folosind o soluie etalon
b) metoda folosind o curb etalon
a) Metoda folosind o soluie etalon
Consideraii generale
Mai nti, alturi de proba de analizat vom prepara n laborator o soluie etalon de
concentraie cunoscut n compusul ce urmeaz s-l analizm i notm aceast concentraie.
Apoi, peste prob i peste soluia etalon vom aduga volume egale de anumii reactivi cu
care compusul ce urmeaza s-l analizm va da o reacie de culoare. Vom citi apoi la SPEKOL
intensitatea acestei reacii de culoare sub form de unitai de extincie, pe care le vom
introduce apoi in formula de calcul.
Caz particular/aplicaie: determinarea fosforului dintr-o prob de sange prin metoda cu
soluia etalon.
Mai ntai preparm o soluie etalon de fosfor cu concentraie cunoscut:
1 mol KH2PO4 (136 g) . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 atom P (31 g)
X
. . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.004 g

X=

0,004 136
31

g KH2PO4

Principiul metodei:
Fosforul, att din prob ct i din soluia etalon va reaciona cu reactivul molibdat de
amoniu (NH4)2MoO4 cu care n mediul alcalin i n prezena unei soluii reductoare
formeaz un compus de culoare albastr a crei intensitate de culoare se va citi la SPEKOL la
lungimea de und = 700 nm.
Tehnica de lucru:
Solute reductoare
Ap distilat
Molibdat de amoniu
Proba de analizat
Soluia etalon de P
Na OH 4 ml

P
1
2
0.5
0.1
0.5

E
1
2
0.5
0.1
0.5

M (ml)
1
2.1
0.5
0.5

Citirea i calculul rezultatelor:

EM = 0.098
Eet = 0.279
Ep = 0.310
Ep E M

Cp = E E x Cet =
et
M

0.310 0.098
0.279 0.098

= 4,68 mg P la 100 ml snge.

x4 =

0,212
0,181

x4 =

agitare
t = 5 minute
albastr
INCOLOR
( = 700 nm)

BIOCHIMIE
Laborator nr.3/22.03.2012
DETERMINAREA CONCENTRATIEI UNEI SUBSSTANTE DINT-O SOLUTIE PRIN
METODA CU O CURBA ETALON
Consideraii generale
Se prepar o soluie stoc din compusul ce urmeaz s-l analizm din care se vor
prepara un ir de soluii diluate cu ap distilat. Pentru fiecare din aceste soluti diluate se va
calcula concentraia i se va dezvolta o reacie de culoare cu reactivi specifici pentru
compusul de analizat. Se va citi la SPEKOL extincia acestor compui i se va trasa graficul
extincie funcie de concentraie.
Caz particular: determinarea fosforului dintr-o prob de snge prin metoda cu curba
etalon
Se prepar o soluie stoc de fosfor cu concentraia:
Cstoc = 10 mg P/100 ml sol.
Din aceast soluie stoc se prepar un ir de soluii distilate folosind apa distilat, dup
cum urmeaz:
Nr.
Volum soluie Volum ap Concentraie Extincie
Factor de
Eprubet
stoc (ml)
(ml)
(mgP/100 ml) CE - Emartor
pant F
1
1
9
C1 = 1
E1 = 0,050
2
2
8
C2 = 2
E2 = 0,100
3
3
7
C3 = 3
E3 = 0.148
4
4
6
C4 = 4
E4 = 0,200
5
5
5
C5 = 5
E5 = 0,250 Cp = 0,212 x20,3
6
6
4
C6 = 6
E6 = 0,300
7
7
3
C7 = 7
E7 = 0,350
8
8
2
C8 = 8
E8 = 0,390
9
9
1
C9 = 9
E9 = 0,450
10
10
C10 = 10
E10 = 0.510
100 mg P . . . . . . . . . . . . . . . 100 ml sol.
X mg P . . . . . . . . . . . . . . . 1 ml sol.
X=

10
100

= 0,1 mg P/ml

0,1 mg P . . . . . . . . . . . . . . . . 10 ml sol.
Y mg P . . . . . . . . . . . . . . . . 100 ml sol.
Y=

0,1 100
10

= 1 mg/100 ml sol.

Pentru fiecare din aceste soluii diluate se va dezvolta o reacie de culoare cu reactivi
specifici pentru fosfor: 1 ml soluie reductoare + 2 ml ap distilat +0,5 ml soluie molibdat
de amoniu + cte 0,1 ml din fiecare soluie + 0,5 ml NaOH. O s se dezvolte un ir de culori
albastre a cror culoare se va citi la SPEKOL la = 700 nm.
Se obin un ir de extincii. Aceste valori sunt n tabel. Cu aceste valori de extincie i
cu concentraiile C1 , C2 . . . . C10 se traseaz graficul extincie funcie de concentraie.

Dac se lucreaz corect toate punctele de intersecie trebuie s se gseasc pe o dreapt

care trece prin origine. Dreapta aceasta se va numi curb etalon pentru fosfor.
Apoi se lucreaz proba de snge cu coninut de fosfor necunoscut: - ntr-o eprubet cu
1 ml soluie reductoare + 2 ml ap distilat + 0,5 ml molibdat de amoniu + 0,1 ml snge +
0,5 ml NaOH rezult culoarea albastr. Se citete extincia la SPEKOL la = 700 nm => o
valoare = 0,212. Ep EM = 0,212. Se caut pe axa OE a graficului. Din punctul E p de pe axa
OE se duce o paralela la axa OC pn intersecteaz curba etalon i din acest punct se coboar
o perpendiculalar pe axa OC. Piciorul acelei perpendiculare este concentraia probei.
Dac se lucreaz corect pe aceeai prob de analizat trebuie s dea aceeai valoare.
Factor de pant F este cotangenta unghiului pe care-l face fiecare punct de pe
dreapt cu o paralela dus la axa OC.
OC

F = ctg = OE =

C
E

Pentru fiecare punct de pe dreapt se calculeaz un factor F:

C1

C10

C2

F1 = E ; F2 = E . . . . . . .F10 = E
1
2
10
Se face media lor aritmetic:
Fmediu =

F1 F2 ... F10
10

Se mai poate calcula prin a treia metod concentraia probei:

Cp = Ep x F
F = 20,3

BIOCHIMIE
Laborator nr.4/29.03.2012
[Glucide] Dozarea glucozei din snge
(Metoda fotocolorimetric)
Consideraii generale
Glucoza este principala surs de energie din organismul animal, iar principala rezerv
de glucoza din organism glicogenul hepatic.
Din glicogenul hepatic printr-un proces de fosforilare (rupere sub actiunea H 3PO4) se
formeaz G1P (glucoza 1 fosfat) i acesta formeaz mai departe G6P printr-un proces de
izomerizare, iar acesta se transform n glucoz care este preluat de snge i dus la esuturi
(ficat) unde este degradat i rezult energia sub form de ATP.

Continutul fiziologic de glucoz din snge se numete glicemie i se exprim n mg

glucoz la 100 ml snge. Pentru meninerea glicemiei n limitele fiziologice intervin
hormonii insulin i glucagon, dar si hormonii adrenalina, noradrenalina, ACTH
(corticoadenotrop) si hormonul de crestere (chiar si tiroxina).
Determinarea glucozei din sange prezinta importanta deoarece se pot diagnostica
starile de diabet zaharat la toate animalele domestice, dar si corelatii ale nivelului de glucoza
cu alte afectiuni metabolice cetoza (acumulare de corpi cetonici) si totodata se poate
aprecia si starea de denutritie a animalului.
Principiul metodei de dozare
Glucoza din sange reactioneaza cu reactivul ORTOTOLUIDINA cu care la cald si in
mediu de acid acetic glacial formeaza un amesctec de glicozilamina si baza Schiff, amestec
de culoare verde si a carui intensitate de culoare se va citi la specol la =610 nm.

Tehnica de lucru:

Fierbe

Reactivi
Proba Etalon Martor (ml)
Proba de sange 0,1
Solutia etalon
0.1
Glucoza
Apa distilata
0.1
ortotoluidina
3
3
3

t=10
Verde

incolor

Calculul rezultatelor:
E P EM

Cp = E E x Cet
et
M
Glicemia difera de la specie la specie si pe specii are urmatoarele valori:
- la om : 80 110
- la bovine : 40 70
- la cabaline : 58 115
- la suine : 55 100
- la ovine : 50 82
- la iepure : 113 156
Glicemia depinde si de temperatura corporala la unele specii:
- la pasare t=42C, glicemia = 230 mg/100 ml sg
- la marmota t=9C vara si 7C iarna, glicemia 8-9 mg /100 ml sg
Mai este influentata si de starea de gestatie si stres.
Hiperglicemie in afectiuni :
- afectiuni pancreatice : insuficienta in secretia de insulina = diabet zaharat
- intoxicatii (Pb, Hg, alimente)
- hepatite
- nefrite
- boli infectioase (unele) si
- dezechilibre endocrine (hipertiroidism)
Hipoglicemie in afectiuni :
- stari de denutritie (lipsa glucide in hrana)
- disfunctii ale hipofizei si ficatului
- disfunctii ale glandei suprarenale
Buletin de analiza
Proba sg bovin
= 610nm

EM= 0,043
Eet=0,057
Ep=0.444
0,444 0,043

Cp= 0,657 0,043 x100

0,401
40,1
x100
65,30mg / 100mlsange
0,614
0,614

BIOCHIMIE
Laborator nr.5/05.04.2012
Dozarea lactozei din lapte
Consideraii generale
Lactoza este principalul diglucid reductor din lapte unde se gsete n proporie 26 %.
Este sintetizat n glanda mamar din galactopiranoz si glucopiranoz.

Este scindat n intestinul subire de enzima lactoz.

Pincipiul metodei de dozare
Lactoza reacioneaz cu fenolul n mediu de H2SO4 cu care formeaz un produs de
condensare de culoare galben cafenie a crui intensitate de culoare se estimeaz
fotocolorimetric la 490 nm.

Tehnica de lucru
Este metoda fotocolorimetric.

10

S-a lucrat metoda cu factor de pant F=

C
E

La proba de lapte se dilueaz 1 la 1000 (1g lapte la 999 ml ap).

Reactiv
Prob lapte
Ap distilat
Fenol 80%
Soluie H2SO4
conc.

P
1
3 pic.
2,5

M ml
1
3 pic.
2,5

Galben Galbui
cafeni
u
agitare t = 15 min racire
Calculul rezultatelor
Cp=

x Ep = 6,67 x 0,131 = 0,87 g lactoza/100 ml

(formula)

Interpretarea rezultatelor
Coninutul fiziologic de lactoz se exprim n grame la 100ml lapte i pe specii au
urmtoarele valori:
- laptele uman 6,5%
- mgri 6,2%
- pisic 5%
- scroaf 5,4%
- vac 4,7 %
- oaia-capra 4,5 %
- lapte praf 38 %
B.I. Prob lapte vac
Ep=0,524
EM =0,393
0,231

11

BIOCHIMIE
Laborator 6/24.05.2012
Dozarea lipidelor totale din ser
Lipidele n snge se gsesc heterogene ca structur, fiind formate din: trigliceride,
colesterol, acizi grasi liberi sau esterificai i fosfolipide.
Determinarea cantitativ a lipidelor din ser, respectiv din snge, prezint importan
practic deoarece permite diagnosticarea modificrilor lipidice la nivelul ficatului (deoarece
acesta este cel care are rolul central n reglarea metabolismului lipidic).
Principiul metodei
Lipidele totale din sange sunt mai nti hidrolizate cu acid sulfuric la fierbere cnd
rezult glicerol sau glicerin i acizi saturai care apoi darorit prezenei H 2SO4 n mediul de
reacie sufer o dehidrogenare i trec n acizi grai nesaturai.
Acizii grai nesaturai formai cupleaz un ion de H 2+ din mediul de reacie i trec n
carbocation.
Carbocationul format reacioneaz cu reactivul numit fosfovanilin (este esterul
fosforic al vanilinei) i la rece formeaz un compus colorat n rou intens a crui intensitate
de culoare se citete la SPEKOLL la = 530 nm.

12

Tehnica de lucru
Metoda este fotocolorimetric i se lucreaz cu soluie etalon de trioleina cu
concentraia corespunzatoare la 1000 mg de lipide din 100 ml snge.
= 530 nm
Cet = 1000 mg lipide/100 ml snge
reactivi
- proba de ser
- solutie etalon
trioleina
- apa distilata
- H2SO4
- hidrolizate
- fosfovanilina

P
0.1

E
0,1

M (ml)
-

Fierbere la 1000C
t = 10 min

2
0,1
2

2
0,1
2

0,1
2
0,1
2

racire

rou
E P EM

Cp = E E Cet
et
M
(mg lipide/
|
100 ml ser
1000
Interpretarea rezultatelor

incolor

13

Concentraia fiziologic de lipide din snge se numete lipemie i apare la toate

speciile de animale. Este cuprins ntre 400 700 mg/100 ml snge.
Valori crescute hiperlipemie apare n cazuri patologice:
-deficit n catabolismul lipidelor la nivelul ficatului;
-obstrucie a cilor biliare;
-nefroza;
-diabet zaharat;
-hiperlipidemie congenital (ereditar);
-o mobilizare crescut de acizi grai din esutul adipos ctre ficat i deci o biosintez
crescut a lipidelor n ficat.
Valori sczute hipolipemie:
-infecii acute i cronice;
-anemie;
-necroza hepatic;
-inaniie;
-hipertiroidism.
Buletin de analiz
Prob de snge bovin
Eet = 0,600
EP = 0.208
CP =

0,208
0,600

x 1000 =

208
0,6

= 346,6 mg lipide/100 ml ser