LUCRAREA 3.

- PIBT
Testarea calcifierii in vitro.

In vederea stabilirii capacitatii unor biomateriale de a calcifia in organism, dupa

implantare, intr-o prima faza se investigheaza comportamentul acestora prin bai
alternante de clorura de calciu si fosfat de sodiu.
Retetele pentru prepararea solutiilor de testare si modul de lucru sunt descrise in
sectiunea I. In acest fluide se pot incuba materialele ale caror potentiale de calcifiere sunt
investigate. Detaliile acestei metode sunt prezentate in sectiunea II. Procedura de testare a
capacitatii de formare a apatitei.
Probele polimerice se imerseaza timp de 48 de ore in apa bidistilata (ddw) in scopul
atingerii gradului maxim de gonflare inainte de incubarea in solutiile de testare a
calcifierii.
I.

Prepararea solutiilor

1. Materii prime

Clorura de calciu CaCl2

Fosfat de sodiu Na2HPO4
Apa bidistilata

2. Procedura de preparare a SBF

Pe toata durata prepararii solutiilor, aceastea trebuie sa fie incolora si limpede, iar pe
suprafata sticlei sa nu existe precipitate. In cazul in care apare o precipitare, prepararea
solutiei trebuie oprita si reluata.
Solutia de CaCl2 (200mL) se prepara avand o concentratie de 0,5 M. Solutia de
Na2HPO4 (200mL) se prepara avand o concentratie de 0,3 M.Pentru a prepara 200 mL din
fiecare solutie se folosesc pahare Berzelius de sticla foarte curat si care nu prezinta
zgarieturi pe pereti, prevazute cu un agitator magnetic.
In paharul Berzelius se dizolva reactivii sub agitare.
Masa moleculara a CaCl2 este 110,99 g/mol, iar masa moleculara a Na 2HPO4 este
141,96 g/mol.
Observatii:
CaCl2 are o mare influenta asupra precipitarii apatitei. In general acesta se
prezinta sub forma granulara si este recomandat sa fie dizolvat cate putin.
Cantarirea reactivilor hidroscopici se va face cat mai repede, pentru a evita
absorbtia apei din atmosfera.

II.

Procedura de testare a capacitatii de formare a apatitei

Esentioanele destinate testarii capacitatii de calcifiere se incubeaza pe rand in solutiile de

CaCl2 si Na2HPO4 (in triplicat). Timpul de incubare este de 15 minute pentru fiecare
solutie.
III.

Analiza probelor dupa incubare in SBF

Aceasta analiza este etapa in urma careia se concluzioneaza asupra capacitatii de

calcifiere in vitro a materialelor testate.
Analiza cuprinde un set de investigatii prin care se verifica daca a avut loc formare de
faza minerala fosfo-calcica in timpul incubarii in baile alternante.
Alegerea metodelor de apreciere a calcifierii este de maxima importanta, deoarece trebuie
verificata masura in care metoda respectiva este adaptata materialului pe care il
caracterizam.
In general, aprecierea calcifierii se face prin metodele descrise in tabelul urmator:
Metoda
FTIR cu ATR
(spectrometrie in
infrarosu cu
transformata Fourier,
cu dispozitiv de
reflexie totala
atenuata)

Tipul informatiei
Identifica aparitia
grupelor fosfat pe
suprafata materialului

Observatii
1. Este relevanta pentru materiale
care nu contin in structura lor
grupe fosfat.
2. Materialul trebuie spalat eficient
si cu mare atentie dupa
terminarea incubarii in SBF,
pentru a nu prezenta faza
minerala nelegata pe suprafata
sa, dar si pentru a nu distruge
mineralul format.
3. Analiza materialului se face
dupa
uscare;
manevrarea
esantioanelor se face cu atentie,
evitand
contaminarea
si
zgarierea suprafetei. (De ce?)
4. Analiza este una calitativa.
Microscopie
Analize morfoCele
doua
metode
sunt
electronica de baleiaj structurale
complementare si ofera informatii
(SEM) si de transmisie
despre morfologia si distributia fazei
minerale formate in urma incubarii
in SBF.
Coloratie Von Kossa
Prezenta sarurilor de Relevanta numai pentru anumite
calciu
materiale, care nu contin saruri de
calciu in compozitie inainte de
testare.

III.1. Coloratia Von Kossa este o tehnica colorimetrica preluata din histologie. Aceasta
coloratie permite evidentierea depozitelor de calciu din tesuturi (argint metalic - culoare
neagra).
Metoda: Materialul se hidrateaza in apa distilata. Dupa hidratare se incubeaza in solutie
de azotat de argint 1%, pentru 30 minute, prin expunere la lumina puternica.
Se spala cu apa distilata.
Aparitia unor depozite de culoare brun-neagra indica prezenta sarurilor de calciu. Se
foloseste ca martor xenogrefa bovina nedecalcifiata.
1% solutie apoasa de azotat de argint:
Azotat de argint ------------------------- 1 g
Apa distilata ---------------------- 100 ml