Protocol de colorare coloidala

1 SCOP
Solutia de colorare coloidala este un colorant foarte sensibil, utilizat pentru
colorarea proteinelor din gelurile de SDS-PAGE.

2 DOMENIUL DE APLICARE
Colorantul coloidal este foarte sensibil, putand detecta ~30ng de proteina in
gel de SDS-PAGE. Gelurile colorate cu acest colorant au un background foarte
scazut.

3 DOCUMENTE DE REFERINTA
Kang et al. (2002). Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant
Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis Bull. Korean
Chem. Soc. 2002, vol. 23, No. 11 1511-1512.
Neuhoff et al. (1988). Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including
isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie
Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 1988 Jun;9(6):255-62.
4 CONDITII PREALABILE
4.1 Se pregateste aria de lucru cf. SOP
4.2 Aparatura necesara:
-

Platforma agitatoare

Cuptor cu microunde

4.3 Materiale necesare:

-

Cutie pentru colorare

Pipeta de 10ml

Cilindru de 50ml

4.4 Reactivi necesari:

-

Gel de SDS-PAGE in care au migrat probele

Apa deionizata

Soluie de colorare coloidala (10% sulfat de amoniu, 0,1%

Coomassie Blue, 3% acid orto-fosforic)

Etanol

5 PROCEDURA
Se indeparteaza SDS-ul din gel prin 2-3 spalari a cate 3-5min fiecare. Se
coloreaza cu o solutie alcatuita din 40ml solutie de colorare coloidala si 10ml etanol.
Se incubeaza cel putin 2 ore la RT. Se pot utiliza si microundele: 850W, ~1min (timp
variabil). Decolorarea se realizeaza cu a.d.

6 RAPORTAREA
-

Caiet de lucru

7 CRITERII DE VALIDARE/ACCEPTARE-RESPINGERE
Lipsa benzilor de proteina in gel denota faptul ca proteina este in cantaitate
de sub 30ng. O alta cauza ar putea fi si lipsa/insuficienta etanolului.

8 SOLUIE DE COLORARE COLOIDALA (10% sulfat de amoniu, 0,1% Coomassie

Blue, 3% acid orto-fosforic):
A.d.
~650 ml
Sulfat de amoniu
100g
Coomassie Blue G250
20 ml din solutie 5% in apa
Acid orto-fosforic
30 ml
Se dizolv reactivii in ordinea din lista. Se aduce cu a.d. la un volum de 800ml. Se
pstreaz la temp. camerei.
Pentru colorare : 40 ml soluie de colorare + 10 ml etanol (20% final).

Transferul proteinelor pe membrana de nitroceluloza sau PVDF

1 SCOP

Acest protocol descrie realizarea transferului proteinelor pe membrana de

nitroceluloza sau PVDF in vederea utilizarii membranei pentru western blot.

2 CONDITII PREALABILE

2.1 Se pregateste aria de lucru cf. SOP

2.2 Aparatura necesara:
-

aparat de electroforeza folosit pentru SDS-PAGE

hartie de nitroceluloza (cu pori de dimensiune 0.45) sau PVDF

filtre Whatman 3MM

2.3 Reactivi necesari;

-

tampon pentru electroforeza Laemmli ( 50mM Tris-HCl / 0.196 M

glicina pH 8.3) peste care se adauga metanol 20 %.

Tampon de transfer (0.025 M Tris-HCl / 20 % metanol, pH 8.3 )

3 PROCEDURA
Daca se foloseste membrana de PVDF, aceasta se tine in metanol timp de aprox. 5
min. Atat membrana cat si filtrele Watman se echilibreaza in tampon de transfer
timp de 15-30 min inainte de utilizare.
ATENTIE! Membrana de PVDF nu trebuie sa lasata sa se usuce in timpul utilizarii ei.

Modul de asezare:
Anod (+); Filtru Watman; membrana; gel de poliacrilamida; Filtru Watman;
Catod (-)

Fiecare strat se aseaza cu grija fara pentru a elimina riscul formarii bulelor de aer
intre ele (in special intre membrana si gelul de poliacrilamida). Tot ansamblul
trebuie imbibat in tamponul de transfer pentru a asigura o buna circulatie a
curentului electric.
Conditii de transfer: 15-30 min la 10-15 V

4 DETECTIA
Se realizeaza fie prin colorare temporara cu 0,2% rosu Ponceau in 3% TCA (acid
tricloracetic), fie se urmeaza protocolul pentru western blot.