06Tehnologia ADN recombinat _etape de lucru

2.1. Etapele de lucru pentru obinerea i selecia moleculelor recombinate de ADN

Deschiderea vehiculului
Scindarea vehiculului pentru a introduce pasagerul se face cu ajutorul enzimelor de restricie ntrun singur loc, cu o secven particular de nucleotide. Prin scindarea vectorului, acesta este convertit ntr-o
molecul de ADN liniar avnd dou capete capabile de interaciune cu gena (pasagerul). Dac scindarea
vehiculului i izolarea pasagerului s-au fcut cu aceeai enzima de restricie, cele dou molecule de ADN
vor avea capete adezive sau coezive monocatenare. Existena capetelor adezive determin lipirea capetelor
vehiculului de capetele pasagerului i formarea unei molecule de ADN hibrid sau recombinant. Aceasta
este o metod direct pentru generarea capetelor adezive. De exemplu, vectorul - plasrnidic pSC 101,
poart un situs de restricie pentru enzima Eco RI, astfel c digestia cu aceast enzima transform ADN-ul
circular al plasmidei ntr-o molecul liniar cu capete adezive monocatenare. ADN-ul dintr-o alt surs (de
exemplu, Drosophila) poate fi tratat cu enzima Eco RI pentru a produce o populaie de fragmente
purttoare ale aceleai secvene adezive la nivelul capetelor acestor fragmente. Prin amestecarea celor
dou populaii de fragmente, ADN-urile din cele dou surse (bacterie i Drosophila) se pot combina pentru
a forma duplexuri ntre capetele lor adezive. Fragmentele unite pot apoi s fie legate permanent de enzima
ADN-ligaz pentru a forma molecule de ADN recombinant sau plasmide himere
Dup scindarea vectorului este necesar defosforilarea acestuia pentru a mpiedica recircularizarea
lui.
Formarea capetelor adezive la vehicul sau/i pasager
Unele enzime de restricie genereaz capete boante la moleculele de ADN ale vehiculului sau ale
pasagerului, care nu se pot lipi specific. In aceste cazuri legarea pasagerului de vehicul se poate face
numai dac se construiesc artificial capete adezive. Pentru formarea capetelor adezive la pasager i la
vehicul se folosesc mai frecvent dou metode:
a) prima metod utilizeaz enzima numit terminal-transferaza, (transferaza terminal) pentru a
genera capete adezive la segmentele de ADN. Aceast enzima obinut din timusul de bovine catalizeaz
adiia "cozilor" nucleotidice la capetele 3' ale catenelor de ADN.
b) a doua metod faciliteaz donarea fragmentelor de ADN care au avut iniial capete boante,
obinute cu enzima de restricie care genereaz astfel de capete. Metoda cost n sinteza chimic a unor
secvene de nucleotide specifice (linkeri sintetici) care conin situsuri de restricie i apoi adugarea
acestora la moleculele de ADN ce aparin vectorului i pasagerului. Linkerii sintetici ai ADN-ului sunt

06Tehnologia ADN recombinat _etape de lucru

foarte utili, pentru c permit crearea situsurilor de restricie care sunt apoi clivate cu enzima potrivit
pentru a genera fragmente cu capete adezive.
Legarea pasagerului de vehicul
Formarea capetelor adezive la vehicul i pasager au avut ca scop doar potrivirea corect i
specific a capetelor celor dou molecule. Pentru ca noua molecul de ADN construit din vehicul i
pasager s devin o unitate stabil (fa de condiiile fiziologice din celul) este necesar legarea capetelor
celor dou molecule prin legturi covalente cu ajutorul ADN-ligazelor. Aceast enzima adugat
amestecului de vehicul + pasager determin formarea unei molecule de ADN hibrid sau recombinant care
rezult din mbinarea artificial a dou segmente de ADN aparinnd la dou specii diferite. Noua
molecul prezint proprieti genetice nentlnite n natur.
Exprimarea eficient a pasagerului n celulele receptoare (transcrierea i traducerea pasagerului)
poate fi realizat numai dac acesta a fost plasat ntr-o poziie corect n vehicul fa de elementele
genetice ale unui operon.
Introducerea i exprimarea ADN-ului recombinant n celule
Dup ce a fost realizat molecula de ADN recombinant, aceasta trebuie introdus n celulele
receptoare pentru multiplicare (pentru a deveni funcional). Dac se folosete ca vehicul o plasmid,
bacteriofagul A., gazda va fi o tulpin bacterian (de obicei E. coli- K 12), iar cnd vehiculul este virusul
SV 40, ADN-ul hibrid va fi inclus n celule umane sau animale n cultur (CV- 1P). ntr-o cultur de
bacterii receptoare sau ntr-o cultur de celule animale, numai unele celule vor putea include i accepta
molecule de ADN recombinant. Celulele care se gsesc ntr-o stare fiziologic particular i accept ADN
strin (ADN recombinant) se numesc celule n stare de competen. Aceast stare depinde de unii
factori, cum sunt: faza ciclului de diviziune celular, specia bacterian, etapa fiziologic de cretere,
mediul de cultur etc.
Clonarea ADN-ului recombinant
Clonarea genelor implic introducerea fragmentului de ADN dorit ntr-un vector adecvat i
replicarea moleculei de ADN recombinant ntr-un organism gazd convenabil. Randamentul transformrii
bacteriilor cu ADN recombinant chiar n prezena ionilor de calciu este relativ sczut (o molecul de ADN
din circa 105 molecule de ADN reuesc s produc transformarea). De aceea este foarte important s poat
fi izolat i o singur colonie care provine dintr-o celul transformat. Pentru identificarea coloniei
(clonei) de celule care conine gena de interes inclus n ADN-ul recombinant este nevoie ca vehiculul i
uneori pasagerul s posede markeri genetici specifici. Astfel, vectorii plasmidici conin anumii factori de

06Tehnologia ADN recombinat _etape de lucru

rezisten la unele antibiotice (Ampr i Tetr). Ca urmare, adaosul unui anumit antibiotic la mediile de
cultur va permite supravieuirea doar a bacteriilor transformate. Pe aceast baz se pot seleciona i clona
celulele transformate i odat cu ele moleculele de ADN recombinant.
Pasagerul poate i el servi la identificarea i clonarea ADN-ului recombinant. Astfel, prin
introducerea genei P-galactozidazei ca pasager ntr-un vehicul se va obine o molecul de ADN
recombinant care va fi acceptat de unele celule receptoare. Coloniile generate de ctre celulele
transformate (care au ADN recombinant), coninnd enzima P-galactozidaz devin albastre, spre deosebire
de celelalte colonii care nu conin enzima i care sunt albe.
Detecia genei clonate i a produsului su de sintez
Dup ce s-a fcut izolarea i selectarea celulelor transformate (clonelor) este necesar s se verifice
n ce msur n molecula de ADN recombinant se gsete pasagerul (gena) dorit. Rareori, pasagerul
posed markeri uor detectabili i de aceea identificarea lui este mai dificil. Pentru identificarea
pasagerului exist mai multe metode :
a) metoda Southern blotting. Cnd ADN-ul este transferat pe filtre de nitroceluloz, procedeul se numete
Southern blotting, iar cnd este transferat ARN-ul se numete Northern blotting. Cu tehnica Western
blotting se realizeaz transferul proteinelor de pe un gel SDS (Sodium Dodecyl Sulfate-detergent anionic
utilizat n mediul de reacie pentru a solubiliza proteinele) i apoi vizualizarea proteinelor specifice cu
anticorpi specifici.
b) analiza secvenei nucleotidelor pasagerului excizat din vehicul. Cea de-a doua metod este mai
laborioas i mai exact permind compararea riguroas a secvenei nucleotidelor pasagerului excizat din
vector cu cea a secvenei nucleotidelor pasagerului nainte de inserie. Excizia pasagerului din vehicul se
face pe o cale invers celei parcurse la inserie cu ajutorul acelorai enzime de restricie. Dup excizia
pasagerului urmeaz analiza secvenei nucleotidelor sale i dac cele dou secvene se dovedesc a fi
identice nu exist nici un dubiu c gena clonat este prezent n celulele transformate.
Reuita tehnologiei ADN-ului recombinant se poate aprecia prin identificarea n cultur a produsului de
sintez a pasagerului (genei). Pentru identificarea i dozarea lui se utilizeaz metoda radioimunoanalizei
(RIA) care este de o foarte mare sensibilitate.