LP 9: Reguli de prelevare a produselor patologice pentru diagnosticul virusologic. Cultivarea virusurilor. Obiective: 1. Definirea virusurilor - particularitile de cultivare a acestora.

2. Prezentarea regulilor de prelevare a produselor patologice. 3. Izolarea virusurilor n culturi de celule, pe ou embrionate sau pe animale de laborator (etape, urmrirea replicrii/prezentei virusurilor, cuantificarea incarcaturii virale) 1. Virusuri = particule infecioase formate dintr-un singur tip de acid nucleic (ARN/ADN), metabolic inerte, lipsite de orice mecanisme necesare producerii i stocrii de energie.
Parazite intracelulare absolute

nu cresc nu se divid

=
Cultiv numai n celule receptive capabile s le replice

2. Reguli de prelevare a produselor patologice Alegerea produsului patologic n funcie de sindromul investigat putem examina : aspirate (exsudate, secreii, excrete) lichid de spltura nazala sau/i faringiena materii fecale secretii prelevate cu tamponul de pe mucoase i din leziuni cutanate fragmente de esuturi snge Alegerea metodei de recoltare i a momentului prelevrii probele pentru examene virologice trebuie examinate ct mai precoce n faza acut a bolii (primele 2-3 zile de boal) Asigurarea condiiilor optime de transport i conservare: meninerea viabilitii virusurilor mpiedicarea dezvoltrii altor microorganisme

Necesitatea mediilor de transport (la care se adaug antibiotice) Refrigerarea probelor (cu unele excepii) 3. IZOLAREA I IDENTIFICAREA VIRUSURILOR Sisteme de diagnostic: - culturi de organ sau culturi de celule; - cultivarea pe embrioni, n dezvoltare; - izolarea pe animale de laborator susceptibile; I. Izolarea virusurilor n culturi de celule

Tipuri de culturi de celule: Culturi primare

obinute din esuturi adulte supravieuiesc 5-6 cicluri de subcultivare

Linii de celule diploide

obinute din esuturi embrionare au morfologie i cariotip normale pot fi subcultivate 40-50 de generaii provin din tumori canceroase au morfologie alterat pot fi subcultivate indefinit

Linii permanente Etape: Pregtirea suspensiei virale

Inocularea filmului celular

Incubarea

Depistarea i cuantificarea virusului replicat: a. efectul citopatic rotunjirea i desprinderea celulelor de pe suport, apariia de sinciii cuantificarea virusurilor prin metoda plajelor uniti formatoare de plaje b. apariia n supernatant a unor proteine codificate de virus (e.g., hemaglutinine) c. adsorbia eritrocitelor pe membrana modificat a celulelor care au replicat virus d. incluziuni virale = acumulri de virioni sau componente virale n aria celular de replicare i asamblare a unor virusuri (citoplasm, nucleu) ; ex.: formaiuni rotunde sau ovalare, bazofile sau acidofile, IC sau/i IN. e. interferena viral = replicarea virusurilor care cultiv fr efect citopatic este depistat indirect prin incapacitatea celulelor infectate de a replica un virus cunoscut citopatogen. f. transformarea celulelor normale n celule canceroase printr-un virus oncogen.

II. Izolarea pe ou embrionate n dezvoltare Indicat pentru izolarea virusurilor gripale, paragripale, herpetice, poxvirusuri.

Etape: Inocularea embrionilor (n vrst de 6-14 zile)

Pe membrana corioalantoid n cavitatea amniotic (adaptare) n cavitatea alantoid (LA produs final pentru indentificare) pasaje repetate

Incubare la 35 C, 3-5 zile

Depistarea virusului replicat: moartea embrionului (viabilitatea embrionilor a fost verificat anterior la ovoscop) apariia de pustule pe membrana corioalantoid (MCA) acumularea de virus (hemaglutinine) n lichidul amniotic / alantoidian RH (evideniere i titrare de antigen hemaglutinant) Cuantificarea virusului replicat: - titrarea antigenului viral (H) n fluidul amniotic/alantoidian - numrul de pustule formate pe MCA Identificarea virusului = prin reacia de inhibare a hemaglutinrii (RIH) sau, in cazul unei tulpini noi: ME (ex. SARS un nou coronavirus) III. Izolarea pe animale de laborator de mici dimensiuni (oarece alb, hamsteri, etc sau gazde unice: maimue, cimpanzei); rar utilizate (vezi dezavantaje) Produsul patologic recoltat in funcie de sindromul clinic, prelucrat, se inoculeaz prin diferite metode (de regul la fel ca poarta natural de intrare): ic, sc, im, etc Urmrirea replicrii virusului: Moartea animalului Reproducerea bolii la animal (ex.: paralizii, tremor determinat de enterovirusuri) Evidenierea de leziuni histopatologice caracteristice la nivelul organelor int; in lichidele sau pp recoltate de la animal se evideniaz prezena virusului prin reacii Ag-Ac, ME (pentru virusurile nou izolate, cercetare, etc) Cuantificarea virusului replicat msurarea dozei infectante sau letale 50% pentru animale (DI50 / DL50)= reciproca diluiei de suspensie viral care determin efectul urmrit (infecie/moarte) la 50% din animalele inoculate. Identificarea = prin reacii Ag-Ac (RN, RIH) Dezavantaje: - Costuri ridicate - Timp ndelungat pentru rezultatul final - Infecii virale latente cu propriile virusuri - Reactiviti diferite - Producerea de Ac care mpiedic expresia clinic