Rezumatul lucrrii

Studiul urmrete obinerea de biomas liofilizat din tulpinile Lactobacillus paracasei IL2, Lactobacillus plantarum IL3 pe baza productivitii lor (P). Mediul optim s-a ales prin utilizarea Bioscreen C MBR i a softului EZExperiment. S-au calculat viteza maxim de cretere, timpul de dublare i productivitatea celular pentru fiecare dintre cele dou tulpini. S-au testat diferite surse de azot i raporturile dintre ele. A rezultat un maximum al productivitii i al sintezei de exopolizaharide n sistem batch, prin utilizarea a 10 g/litru pepton, 4 g/litru extract de drojdie pentru ambele tulpini. Pentru Lactobacillus paracasei IL2 rezult o productivitate de 0,98 h-1gl-1 i 600 mg exopolizaharide/litru, iar pentru Lactobacillus plantarum IL3 a rezultat o productivitate de 0,75 h-1gl-1 i 250 mg exopolizaharide/litru. Compoziia chimic a polizaharidului celor dou tulpini testate este format n principal din glucoz, cu un coninut mediu de 27,65% glucoz anhidr i un gradul de polimerizare mediu de 43,7%. Scopul acestui studiu l reprezint cultivarea n sistem batch a dou tulpini de bacterii lactice Lactobacillus paracasei IL2 i Lactobacillus plantarum IL3, aflate n colecia USAMV Bucureti, Facultatea de Biotehnologii, pentru obinerea de biomas i exopolizaharide. Sursa de carbon utilizat o reprezint glucoz, parametrii fermentaiei fiind 370C, pH 7 i 75 rpm. Mediul de cultur (exceptnd glucoz) s-a stabilit prin utilizarea Bioscreen C, iar cu ajutorul softului EZExperiment sa calculat productivitatea, viteza de cretere i timpul de dublare n timp real a tulpinilor. Pentru tulpinile Lactobacillus paracasei IL2 i Lactobacillus plantarum IL3 s-a stabilit mediul optim de cultivare utiliznd Bioscreen C, pe baza productivitii. Sursa de carbon folosit a fost glucoza n concentraie de 10%, n prezena creia se obine un maximum al cantitii de exopolizaharide.

CUPRINS Introducere. ...4 Capitolul 1 Date de literatur privind probioticele....6 1.1 Istoria probioticelor..........6 1.2 Proprietile terapeutice ale bacteriilor probiotic.8 1.3 Biologia probioticelor...8 1.3.1 Bacteriile lactice acide...8 1.3.2 Genul Lactobacillus...9 1.3.3 Genul Bifidobacterium..9 1.3.4 Genul Streptococus....10 1.3.5 Criterii de selectie .....10 Capitolul 2 Activitatea probioticelor...12 2.1 Generaliti...12 2.2 Selectarea tulpinilor de probitoice....14 2.3 Probioticele i imunitatea..14 2.4 Imunodularea nonspecifica...16 Capitolul 3 - Perspective legate de rolul microbiotei intestinale umane i modularea sa de ctre pre- i probiotice..............17 3.1 Ecologia microbian a tractului gastrointestinal uman......17 3.2 mbuntirea alimentaiei prin: probioticelolor,prebioticelor i sinbiotice.......19 3.2.1 mbuntirea alimentaiei cu ajutorul probioticelor...19 3.2.2 Probioticele i sistemul imunitar.....20 3.2.3 Metode tiinifice pentru dobndirea funciilor benefice ale bacteriilor..21 3.2.4 Limite datorate probioticelor...........21 3.2.5 mbuntirea alimentaiei cu ajutorul prebioticelor........21 3.2.6 mbuntirea alimentaiei cu ajutorul sinbioticelor.....22

Capitolul 4 Bacteriile lactice.......................................................................................24 4.1 Bacteriile lactice acide ca probiotice .............25 4.2 Importanta bacteriilor lactice acide i impactul lor asupra sntii umane...26 4.3 Bacteriilelactice acide i alte efecte asupra sistemului imunitar.....26 Capitolul 5 Obinerea de biomas i exopolizaharide din Lactobacillus paracasei IL2 i Lactobacillus plantarum IL3..............................29 5.1 Scopul Lucrarii........29 5.2 Materii prime i metode..........30 5.3 Determinri efectuate..................................................................................................30 Capitolul 6 Rezultate i discuii..........................................................................................................32 CONCLUZII ...............................................40 Bibliografie.........41

INTRODUCERE
Definiia bacteriilor probiotice evolueaz constant. ncercri de a dispune de o descriere clar a detaliilor lor biologice i al efectelor lor asupra sntii gazdei sunt oprimate de existena unui numr foarte mare de specii i genuri existente n aceast categorie. n timp ce mai muli autori au sugerat amendamente ctre probiotice,un punct de start destul de bun a fost oferit de ctre Fuller: un supliment de hrnire format din bacterii vii ce afecteaz benefic gazda animal ,mbuntind echilibrul microbian din intestine. Multe beneficii diferite au fost atribuite consumului de probiotice att de ctre oameni ct i de animale,cele mai importante animale de producie fiind bovinele i ginile,n care ele sunt denumite des drept Direct Fed Mircrobials (DFM). Beneficiile includ o toleran la lactoz mai ridicat , imunitate crescut la oameni, alimentare mai eficient i o rat mai sczut la animale de a crete patogeni,n afara consensului de lung durat conform cruia probioticele contribuie la o mbunire a activitii intestinale n toate gazdele. Recent, informaiile despre probiotice au prsit n sfrit trmul anecdotal i i ctig statutul bazat pe teste aleatorii controlate de efecte de placebo. Cercetrile s-au axat pe direcia biologic pentru controlul i eradicarea patogenilor provenii din alimente. Oamenii de tiin au dezvoltat produse antimicrobiene natural pentru biocontrolul patogenilor i au exploatat bacteriile acidolactice pentru excluderea competitive a acestor patogeni i livrarea de vaccinuri precum i de compui bioactivi (Grasson,2002). Bacteriile lactice din genul Lactobacillus sunt utilizate frecvent n fermentaiile alimentare datorit abilitii lor de a mbunti caracteristicile organoleptice ale alimentelor. Sunt folosite i pentru capacitatea de conservare a unor materii prime perisabile ca laptele, carnea i vegetalele. Aceste bacterii sunt capabile s produc, n mod normal, cantiti de exopolizaharide de aproximativ 150 200 mg/l. Cantitile maxime de polizaharide sunt produse n bioreactoare, n prezena unei surse de carbon cu o concentraie optim. Controlul riguros al temperaturii, pH i al turaiei agitatorului reprezint o condiie obligatorie pentru sinteza unei cantiti maxime de exopolizaharide. Diferite glucide, ca glucoz, fructoza, maltoza, rafinoza, sucroza, galactoza sau lactoza sunt utilizate cel mai frecvent la cultivarea n sistem batch a bacteriilor lactice pentru a sintetiza exopolizaharide. Concentraia lor n mediu poate ajunge i pn la 50 g/litru. Sursa de azot i sruri minerale este i ea un factor important, deoarece tulpinile lactice necesit prezena n mediul de 4

cultur a peptonei sau a extractului de drojdie. Cultivarea n bioreactoare de laborator, sistem batch, a artat c o parte din costurile mari cu aceste substane pot fi nlocuite prin suplimentarea mediului cu extract de porumb. Agitarea este o condiie obligatorie datorit omogenizrii mediului din bioreactor. Pentru a pstra tulpina cultivat ntr-o faz exponenial de cretere pentru o perioad maxim, ea trebuie fcut constant i nu trebuie s depeasc 100 rpm. Controlul pH trebuie s fie riguros, deoarece tulpinile sunt foarte sensibile i orice depire a limitelor inhib multiplicarea i, implicit, sinteza de exopolizaharide. Astfel, este nevoie ca orice bioreactor utilizat s aib capacitatea de a controla automat pH din interiorul vasului de biosintez, printr-un sistem integrat n programul de baz al bioreactorului. n general, tulpinile de bacterii lactice produc heteropolizaharide. Exist tulpini, ca Streptococcus thermophilus, care produc exclusiv heteropolizaharide. Acestea sunt formate din lanuri de glucoz, galactoz i manoz i uneori N acetil glucozamin. Homopolizaharidele conin glucoz i sunt cunoscute ca dextranul, mutanul, alternanul i glucanii. Homopolizaharidele care conin fructoz sunt fructani (de tipul levanului i inulinei). Aceste homopolizaharide au grade diferite de polimerizare, n funcie de tulpinile bacteriene sintetizatoare. Scopul acestui studiu l reprezint cultivarea n sistem batch a dou tulpini de bacterii lactice Lactobacillus paracasei IL2 i Lactobacillus plantarum IL3, aflate n colecia USAMV Bucureti, Facultatea de Biotehnologii, pentru obinerea de biomas i exopolizaharide. Obietivele acestui studiu sunt acelea de a urmri obinerea de biomas liofilizat din tulpinile Lactobacillus paracasei IL2, Lactobacillus plantarum IL3 pe baza productivitii lor. n primul capitol sunt prezentate date de literatur privind problematica probioticelor. n capitolul doi este prezentat activitatea probioticelor asupra organismului uman. n capitolul trei sunt prezentate perspective legate de rolul microbiotei intestinale umane i modularea sa de ctre pre- i probiotice. n capitolul patru sunt descrise bacteriile lactice si rolul lor. n capitolul cinci este detailat modul de obinere de biomas i exopolizaharide din Lactobacillus paracasei IL2 i Lactobacillus plantarum IL3. n ultimul capitol sunt prezentate rezultate si discuii asupra lucrrii.
Lucrarea se ncheie cu concluziile experimentelor i cu referinele bibliografice.

CAPITOLUL 1 DATE DE LITERATUR PRIVIND PROBLEMATICA PROBIOTICELOR

1.1 Istoria probioticelor Termenul de probiotic a fost considerat de origine greac i a fost tradus pentru via for life fiind n contrast cu termenul de antibiotic (Hamilton-Miller, Gibson i Bruck, 2003; Vasiljevic i Shah, 2008). Prima utilizare a cuvntului probiotic se datoreaz lui Kollath n 1953, acesta la folosit pentru a descrie reechilibrarea sntii pacienilor subnutrii cu ajutorul a diferite suplimente organice i anorganice. Un an mai trziu, Vergin (1954) spune c instabilitatea microbian a organismului uman cauzat de tratamentul cu antibiotice poate fi reechilibrat printr-o diet bogat n probiotice. Kolb n 1955 recunoate efectul nociv al terapiei cu antibiotice i propune prevenirea acestuia cu probiotice. Lily i Stillwell n 1965 definesc probioticele ca substane secretate de un microorganism pentru a stimula creterea altui microorganism. Sperti (1971) respectiv Fuji i Cook (1973) folosesc termenul pentru a descrie extracte tisulare ce stimuleaz creterea microbian sau care mbuntesc rspunsul imun al gazdei fr a inhiba creterea n vitro a culturii. n anul 1974, Parker a fost primul care sa apropiat cel mai mult de semnificaia actual a termenului. El a definit probioticele ca organisme i substane care contribuie la balana microbian intestinal. Cea mai utilizat definiie a fost dat de Fuller n anul 1992. Acesta mbuntete definiia lui Parker ajungndu-se la formularea supliment nutritiv cu microorganisme vii care influeneaz benefic organismul animal prin mbuntirea balanei microbiene intestinale. Definiia revizuit de Fuller atrage atenia asupra necesitii de a fi prezente bacterii probiotice viabile i introduce aspectul efect benefic mai mult pentru organismul animal dect pentru cel 6

uman. Muli autori urmnd acest trend prezint propriile lor versiuni n ceea ce privete definiia probioticelor. Urmrind recomandrile FAO/WHO, grupul de lucru ce se ocup cu evaluarea bacteriilor probiotice n alimente (2002), descriu probioticele ca microorganisme vii care atunci cnd sunt administrate la momentul adecvat confer beneficii pentru sntate asupra organismului gazd. Ca urmare a acestei definiii o mare varietate de specii de microorganisme pot fi considerate potenial probiotice. Cele mai importante specii de bacterii probiotice sunt reprezentate de bacteriile lactice. Oamenii au consumat produse probiotice dinaintea timpurilor pre-biblice,adesea sub forma produselor de lapte fermentate. Totui o asociere ntre aceste produse i sntatea uman nu a fost contientizat dect dup 1900. Mechnikoff a suferat c sntatea i longevitatea bulgarilor poate fi urmrit ctre dietele lor. Acest nceput umil a format n domeniul probioticelor,un bulevard activ de anchete tiinifice precum i o industrie comercial activ. Studiul iniial al lui Metchnikoff a declanat un studiu n activitatea probioticelor. Totui,deabia la sfritul celui de-al doilea rzboi mondial i nceputul erei antibioticelor,cercetrile n domeniul probioticelor au nceput, catalizate de ctre indicaii precum c ar putea preveni diareea asociat cu utilizarea de antibiotice. Cercetriile asupra probioticelor au crescut totui n urmtoarele cteva decenii. Pn n anii 1980 cerecettorii de pe tot globul i-au concentrat eforturile ntr-o ncercare de a elucida activatatea i mecanismul probioticelor la bovine i alte animale de producie, n timp ce i-au propus s mreasc creterea ct i sntatea general a acestor animale. n ciuda acestor eforturi, rezultatele de laborator nu au reuit s ofere rezultate consistente i n anii 1990 a sczut numrul de cercetri n acest domeniu. Vnzrile comericale ale probioticelor pentru utilizare n producia industrial au rmas totui destul de ridicate.Cu descoperirea BSE (Encefalopatia spongiform bovin i interzicerea folosirii de antibiotice n hrana animalelor n Europa, cercetrile probiotce pentru animalele de producie au fost rencepute ntr-un efort de a modera efectele care aceast interzicere urma s le aib. ntre timp , cercettorii ce au investigat efectele probioticelor asupra sntii umane au obinut rezultate mai concrete. n ciuda faptului c o nelegere clar a mecanismului din spatele activitii probioticelor rmne ambiguu,exist un numr de articole care conin rezultate clare i importante din punct de vedere statistic n acest domeniu

1.2 Proprietile terapeutice ale bacteriilor probiotice n ciuda istoriei lor lungi,contientizarea avantajelor probioticelor de ctre public a crescut dramatic abia n ultimii ani. Aceasta se datoreaz unui numr de factori,care include o grij deosebit asupra potenialului de generare a unor tulpini de bacterii rezistente la antibiotice din cauza utilizrii pe scar larg a bactericidelor, i deasemenea datorit rspndirii ideii c sntatea unui om poate fi, nu numai meninut,ci i mbuntit de o nutriie adecvat. Combinai,aceti factori au stimulat apariia unui val de cercetare n probiotice n ultimul deceniu, rezultnd n studii din ce n ce mai aprofundate. ntr-adevr,dupa ce Elie Mechnikov a tiprit pentru prima dat lucrarea sa ce sugera o corelaie pozitiv ntre longevitatea uman i consumul de lapte fermentat, informaiile despre probiotce prsesc trmul anecdotelor dup ce teste aleatoare controlate de efectul de placebo susin efectul benefic al activitii probioticelor. Concomitent,mai mult este aflat despre efectul lor n vivo. n timp ce multe studii rmne de realizat nainte ca o nelegere detailat a probioticelor poate fi dobndita,exista dovezi concrete c probioticele, cnd sunt folosite n condiii propice, pot avea ntr-adevr efecte profilactice sau de prevenire a unui numr mare de boli umane i animale. Aceasta lucrare studiaz succint istoria probioticelor i discut studiile recente cu un accent special pus pe bacteriile lactice probiotice. n sfrit, se discut despre dificultile de motenire a studiilor lor i despre sugestii pentru standarde n lucrrile viitoare.

1.3 Biologia probioticelor

1.3.1 Bacteriile lactice acide De regul probioticele provin din categoria bacteriilor lactice acide, mai ales din genul Lactobacillus i Bifidobacerium. Acestea sunt bacterii gram positive,catalaz negative,nonaerobe dar aerotolerante, nu produc spori, nu respira i sunt sub form de coci i bacili,producnd acid lactic ca produs principal al fermentaiei carbohidrailor. Metaboliii sunt considerai a fi foarte importani datorit efectelor lor benefice. Acetia includ acizi organici ( n special acid lactic ),bacteriocine i sruri de peroxid hidrogenat.

1.3.2 Genul Lactobacillus: Lactobacilii sunt bacilli i cocobacili gram pozitivi,nonsporulanti. Au un coninut sczut de G+C (sub 50%), deobicei intre 32-51%. Formele de Lactobacillus acidophilus sunt cei mai ntlnite componente n diet. Prin studii generale s-a aflat c speciile originale conin 6 grupuri omoloage de ADN; L.crispatus, L.gallimarium, L. gasseri, L. amylovarus i L. johnsonii. Dei aceste specii sunt bine definite,adesea este greu de alocat specii nou iZolate ctre oricare dintre aceste grupuri. L. acidophilus e un bacil gram pozitiv cu capete rotunjite ce poate s se prezinte ca celule singulare,n perechi,sau n lanuri scurte. Creterea optim apare la 35-40 grade Celsius i la un pH de 5.5-6.0. Sunt distribuite de-a lungul tractului gastrointestinal uman dar i al altor gazde,iar factorii principali ce-i afecteaz sunt pH-ul , prezenta oxigenului,nivelurile de de substrat,prezena secreiilor intestinale, i interaciunile cu alte bacterii. Aparine taxonomiei Firmicutes, clasa Bacilli, ordinul Lactobacillales, familiei Lactobacillaceae iar cele mai apropiate genuri sunt Paralactobacillus i Pediococcus. Unul din cele mai numeroase genuri, ce cuprinde 106 specii. Lactobacillus acidophilus, L. salivarius, L. casei, L. plantarum, L. fermentum, L. reuteri i L. brevis au fost cele mai frecvente specii de Lactobacillus izolate din intestinul uman. Lactobacilii sunt omniprezeni n natur, gsindu-se n medii bogate n glucide.

1.3.3 Genul Bifidobacterium Ca i Lactobacilii, Bifidobacteriile sunt extrem de importante n tracturile gastrointestinale i genito-urinare ale oamenilor i altor mamifere.Prezena de-a lungul vieii gazdei,vrstei i dietei sunt factori importani n distribuia exact a Bifidobacteriilor. Sunt speciile dominante n microflora bebeluilor,dar numrul lor descrete odat cu vrsta pn cnd stagneaz la aproximativ 25% din totalul florei intestinale a unui adult,ocupnd locul trei dup Bacteroide i Eubacteria. Bifidobacteriile au fost descoperite la nceputul aninlor 1900, cnd Tissier le-a descris ca microorganisme cu forme de bacilli,neproductoare de gaz,anaerobe cu morfologie bifid. n mod curent sunt caracterizate ca fiind gram positive, nesporulante, cu lipsa de motilitate,catalaz-negative i anaerobe.Se prezint n forme variate incluznd bacili n form de Y,bacili scuri i ondulai i 9

bacilli n form de bata. Spre deosebire de Lactobacili,Bifidobacteriile au un coninut ridicat de G+C (54-67%) i sunt grupate deci n genul actinmocetelor gram positive. Cele gsite la oameni pot folosi glucoz,galactoza.lactoza i adesea fructoza ca sursa de carbon. Condiiile de crete optim sunt la pH de 6-7 i temperature de 37-41 grade C Acestea au fost izolate i vizualizate prima dat de ctre Tissier (1900) din materiile fecale ale nou-nscuilor. Ele sunt lactobacili imobili, Gram +. Celulele au form de bastonae cu capetele ngroate sau ramificate. Reprezentanii genului sunt anaerobi, i realizeaz o fermentaie heterolactic fr gaz, cu producerea de acid acetic i acid lactic L(+) n raport molar de 3:2. Datorit faptului c sunt mai pretenioase, aceste bacterii sunt adesea dificil de izolat i crescut n condiii de laborator. Taxonomia bifidobacteriilor s-a schimbat continuu de cnd acestea au fost izolate pentru prima dat. Iniial s-a considerat c acestea aparin genurilor Bacillus, Bacteroides, Nocardia, Lactobacillus i Corynebacterium, nainte de a fi considerate un gen separat, n 1974. Coninutul de citozin-guanin este mai mare de 50 mol%. Familia bifidobacteriilor este format din 5 genuri: Bifidobacterium, Propionibacterium, Microbacterium, Corynebacterium i Brevibacterium. n prezent exist 32 de specii ce aparin genului Bifidobacterium, 12 dintre ele au fost izolate din surse umane (carii dentare, materii fecale i vagin), 15 din tractul intestinal al animalelor sau din rumen, 3 din albine iar celelalte 2 rmase din lapte fermentat i ape reziduale. Speciile de Bifidobacterium gsite la om sunt: B. adolescentis, B. angulatum, B. bifidum, B. breve, B. catenulatum, B. dentium, B. infantis, B. longum, i B. pseudocatenulatum. B. breve, B. infantis, B. longum se regsesc i la sugari n timp ce B. adolescentis i B. longum se regsesc la aduli

1.3.4 Genul Streptococus Este alctuit din coci lactici, Gram +, nesporogeni, grupai n perechi sau lanuri. Din punct de vedere fiziologic fermenteaz un numr redus de glucide i anume lactoza, zaharoza, glucoza i uneori galactoza cu formare de acid lactic L (+) i este caracterizat prin termotoleran, cu 10

temperaturi maxime de cretere de 5052C. Specia cu importante caliti n ceea ce privete beneficiile pentru organismul uman este Streptococcus thermophilus.

1.3.5 Criterii de selecie

Toate probioticele sunt spre consumul uman fie direct prin suplimente alimentare fie indirect prin hrana animalelor. Ca oricare altele ce sunt destinate consumului uman,criteriile de selecie pentru probiotice sunt stricte. n timp ce probioticele trebuie prin definiie s pozede activiti benefice pentru consummator,trebuie deasemenea s supravetuieasca la cele mai nocive condiii implicate n procesul de digestiei

Aceasta presupune capacitate lor de a supravetui n mediul de aciditate ridicat,de pn la 1.0,precum i secreiei de bila concentrate n intestinele subiri proximale. Capacitatea de a adera la mucoasa intestinal uman este de ajutor pentru colonizarea temporar a tractului gastro-intestinal.,dei cercettorii nu sunt de accord cu faptul ca adeziunea poate fi considerat un criteriu de selecie,deoarece administrarea continua poate provoca uneori o populaie probiotic adecvat pentru rezultate positive. Pe lng aceste criterii biologice, probioticele folosi pentru consumul public trebuie s fie realizabile i din punct de vedere commercial. Deci, trebuie s poat fi produse n mas,s rmn viabile n timpul depozitarii i s nu afecteze gusutl substratului. n sfrit,din motive evidente,probioticele nu trebuie s vine patogene pentru gazd. Din acest motiv, muli cercettori susin utilizarea culturiloe indigene tractulu gastro intestinal.

11

CAPITOLUL 2 - ACTIVITATEA PROBIOTICELOR

2.1 Generaliti
Colonizarea apare n primele sptmni dup natere i duce la interaciunii cruciale cu sistemul imunitar ct i tractul gastro intestinal. La animalele sntaose, primiele microorganisme colonizatoare provin cel mai adesea de la flora maternal. n timp ce dezvoltarea continu, microflora indigen devine specific att speciei ct i zonei ocupate n tract. Prin conexiunea cu stratul de mucus sau adeziunea la suprafa sau la celulele epiteliale,aceast populaie reprezint prima linie de aprare mpotriva bacteriilor patogene i a altor elemente duntoare ingerate n timpul dietei. La natere, exista o schimbare fundamental deoarece intestinele de la digerarea lichidului amniotic ncep s digere hran. Aceasta stimuleaz eliberarea de hormoni trofici, care ajuta att la dezvoltarea rolurilor de digestie ct i de protecie a tractulului. n timpul dezvoltrii,poroteinele mucosale i enzime de digestie precum i colonizarea cu bacterii intestinale reprezint primele caractere de protecie dezvoltate. Mediul acid creat de secreia HCL reprezint o caraceristic antimicrobian eficient, i se dezvolt n primele sptmni de via n timp ce mucusul format din celule n form de pocal acoper suprafaa epitelial a tractului, prevenind ataarea antigenilor luminali Ataarea la antigeni a fost recunoscut drept un pas fundamental n virulenta alimentar de la nceputul anilor `80, cnd Jones i Rutter au demonstrate ca Eschericia Coli nu era capabil de patogenez fr ea. Populaiile bacteriene normale ajut n prevenirea supracreterii patagoneilor i deasemenea ajut la prevenirea atarii patogenilor la lumen prin excludere competitive, i aceast activitate se pare c are un rol cheie n protecia probiotic. Bacteriile intestinale deasemenea au i alte activiti benefice pentru gaza. Un exemplu este gsit n rumegtoarele adulte n care digestia componentelor dietetice fibroase este realizat n mare de ctre activitile fermentative ale bacteriilor localizate n rumen. Dup cum s-a menionat,fiecare parte a tractului este colonizat de ctre specii de bacterii tipice, care s-au dezvoltat simbiotic cu gazda i sunt gsite n numere variate de-a lungul tractului digestive. Gura conine un numr ridicat de bacterii att facultative ct i strict anaerobe, n timp ce intestinele superioare (stomacul,duodenul i jejunul) sunt rar populate. Concentraiile de bacterii cresc de la ileum pn la sfritul tractului 12

digestiv, cea mai deas populaie fiind gsit n colon. Pn la 35-50% din coninutul colonului uman este reprezentat de ctre 500 specii de bacterii gsite n mod obinuit n intestinal gros uman, cel mai des specii reprezentant 5 genuri: Bacteroides, Eubacterium, Bifidobacterium, Peptostreptococus i Fusobacterium. Probioticele au fost acreditate cu o gam larg de activiti n tractul digestiv. Cel mai des ntlnit character este cel al excluziunii competitive, n care bacteriile patogene i probiotice sunt n competiie pentru un numr limitat de nutrieni i pentru spaiu pe mucoasa intestinelor. n acest caz de administrare a probioticelor de success,probioticele sunt avantajate s se ataeze de intestine, deci prevenind speciile patogene de a prsi sistemul digestive i de a intra n snge. Totui, acesta nu este singurul mecanism. Din 1950, probioticele au fost asociate cu abilitatea de a preveni sau trata bolile intestinale. Manifestarea acestei abiliti este vzut n tratamentul problemelor variate ca : boala Chrohn, gastro-enteritele, intoleran la lactoz, diareea, rezultate din surse variate. O abilitate de a lucra ntro gam aa larg de simptome, ar sugera existena mai multor activiti ale probioticelor, fapt dovedit deja. Digestia mbuntit a lactozei vzut cnd este consumat iaurt cu bacaterii vii (opus lactozei din lapte sau iaurt n care bacteriile au fost omorte de temperatur) se crede a fi datorat digestiei lumenale a lactozei de ctre bacterii. Lactoza digerat este eliberat n intestinele subiri unde acizii biliari lizeaz aceste bacterii. Reducerea diareei datorat probioticelor se presupune c funcioneaz prin mai multe ci discrete sau complementare. Ba mai mult, probioticele pot trata sau preveni diareea asociat unui numr mare de cauze. Diareea asociat antibioticelor apare n pan la 20% din pacieni. Rezultate relevante statistic au sugerat ca anumite probiotice pot ameliora sau preveni boala. Exemple include utlizarea probioticelor ca : Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri i Sccharomyces boulardii pentru tratamentul diareei acute. Bifidobacteria i Clostridium butyricum au fost sugerate pentru folosire n prevenirea diareei acute cauzat de rotavirus la copii. Unele probiotice sunt cunoscute s secrete molecule antimicrobienee, cunoscute drept bacteriocine, care deasemenea au capacitatea de a preveni bacteriile patogene s se ataeze la mucoasa epitelial. Multe probiotice se pare c au activate sistemul imunitar, iniiind o activitate n zone ale sistemului imunitar asociat mucoasei. Pe lng aceast, cercetariile preliminarii indic c probioticele pot avea capacitatea de a se lega de contaminanii alimentari din tract, deci prevenindu-i de la absorbie. Gratz si colaboratorii au demonstrat capacitatea Lactobacillus rhamnosus, L. rhamnosus LC-705 i Propionibacterium freudenreichii supbsp shermanii de a se lega de alfa toxine 13

B1 n vitro.Totui aceste rezultatea sunt nc neconfirmate n vivo,unde legarea alfa toxinelor poate fi redus. 2.2 Selectarea tulpinilor de probiotice Criteriile de selecie ale tulpinilor de bacterii probiotice utilizate n aplicaiile comerciale sunt variate iar pentru a realiza cu succes o terapie cu lactobacili trebuie ndeplinite urmtoarele condiii: -cultura trebuie s fie de origine uman; -s nu fie patogen -s prezinte potenial de colonizare n tractul gastrointestinal, respectiv s se gseasc ntr-o concentraie substanial (107109 ufc/mL de produs). Criteriile generale pentru selecia tulpinilor de probiotice sunt prezentate n Tabel 2.1

2.3 Probioticele i imunitatea

Pe lng rolul essential n digestia i absorbia nutrienilor, intestinele trebuie s protejeze gazda de multitudinea de patogeni consumai cu hran. La acest capt, mucoasa intestinal lucreaz n conjunctie cu alte componente ale sistemului gastro intestinal precum saliva, sucul gastric, micarea peristaltic, mucusul, proteoliza intestinal, flora intestinal i membranele celulare epiteliale . Microflora intestinal normal este extreme de important n funciile imune. Absena sa poate rezulta ntr-un transport de antigeni de-a lungul mucoasei intestinale Microflora intestinal este deasemenea responsabil de rspunsurile imunitare la nivel local sau sistemic.

14

Tabel 2.1 - Criteriile generale pentru selecia tulpinilor de probiotice Tabel 2.1 General criteria for selecting probiotic stems Aspecte generale Criterii cu privire la siguran Proprieti Origine Patogenitate i infeciozitate Factori de virulen toxicitate, activitate metabolic, Proprieti intrinseci, adic rezisten la antibiotice Tulpini stabile genetic Capacitate de supravieuire n timpul prelucrrii i depozitrii Bune proprieti senzoriale Rezistente la fagi Producie la scar larg Rezisten la acid gastric i sucuri gastrice Rezisten la concentraii de bil Aderen la suprafaa mucoasei Efecte benefice confirmate i foarte bine documentate Creterea rspunsului imunitar Activitate antagonic fa de agenii patogeni gastrointestinali, Helicobacter pylori, Candida albicans Metabolizarea colesterolului Proprieti antimutagenice i anticarcinogenice Metabolizarea lactozei

Criterii tehnologice

Criterii funcionale

Criterii fiziologice dorite

Concentraia mare de antigeni din intestine necesita o protecie imunitar avansat. Deci, suprafarta membranelor mucoase este protejat de un sIstem local adaptabil. esutul limfoid asociat intestinelor este ce mai mare mas de esut limfoid din corpul uman i include pete Peyer precum i foliculi distribuii n interiorul mucoasei i n epiteliul intestinal. Ceea ce se definete drept un rspuns imunitar e o combinaie complex i evoluat de diferii factori, incluznd limfocitele T intraepiteliale, care sunt n principal implicate n supresia antigenilor prin citotoxicitate, activate de 15

ctre celule B, care secret anticorpi pathogen specifici, i celule ajuttoare numeroase precum macrofagele. Celule lamina propria sunt deasemenea active n intestine, lucrnd cel mai adesea c ajuttori i inductori, coninnd multe limfocite B. S-a demonstrate ca probioticele mbuntesc rspunsurile imune umorale,promovnd potenialul imunitar al intestinelor.Studiile au artat c probioticele sunt capabile s moduleze att sistemele imune specifice ct i cele nespecifice.

2.4 Imunomodularea nonspecifica

Probioticele, incluznd bacteriile lactice provoac mecansime de aprare nscute. Aceasta adesea implica interaciuni cu diferite bacterii indigene intestinelor. Acesta este cazul stablizarii microflorei intestinale,care limiteaz accesul patogenilor la intestine. n mod deosebit, probioticele deasemenea stimuleaz gazda la rezisten non speifica la patogeni microbieni. Aceasta ajuta n eliminarea unui numr mare de antigeni. Experimentele n vitro au indicat c mai multe tipuri de Lactobacili induc cu success eliberarea de cytokine proinflamatorii, ce sunt implicate n imunitate nespecific. L. casei i L. bulgaricus induc macrofagi i activeaz fagocitoza, la oareci. L. acidophilus a indus cu success fagocitoza, un pas iniial n rspunsul imunitar, la oameni. Aceste rezultate sunt colcusive n eliberarea agenilor toxici precum intermediari ai oxigenului reactiv i enzime litice Multor probiotice le sunt atribuite activiti antiinflamatorii. Studii asupra activitii bacteriilor P. acidipropionnici i P. freudenreichii, au demonstrat abilitatea lor de a distruge celule de carcinom colorectal prin apoptoza, indicnd preliminar utilitatatea lor n tratarea i prevenirea cancerului de colon.

16

CAPITOLUL 3 PERSPECTIVE LEGATE DE ROLUL MICROBIOTEI INTESTINALE UMANE I MODULAREA ACESTEIA DE CTRE PROBIOTICE I PREBIOTICE
Una din zonele cele mai importante ale nutriiei este reprezentat de rolul intestinelor n sntate. n mod specific asta implic interacii ntre microbiota rezident i ingredientele dietare are susin activitatea sa. n mod curent, se accepta c microflora intestinal conine componente patogene, benigne ct i benefice. Unele boli induse microbian ca gastroenterita acut i colita pseudomembranoasa au definiii etiologici. Speculaii asupra rolului componentelor microbiotei n n boli c sindromul intestinelor iritabile, cancerul intestinal, colite ulcerante etc. sunt bine definite, dar multe studii sunt convingtoare totui. Este evident c compoziia microflorei intestinale poate fi modificat prin diet. Datorit statutului lor de promovatori ai sntii, bifidobacteriile i lactobacilii sunt cele mai comune inte. Probioticele implica utilizarea microorganismelor vii n alimente; prebioticele sunt carbohidrai metabolizai selectiv de componeni dezirabili ai florei gazdei; sinbioticele combina pe primele dou. Intervenia n alimentaie a microbiotei intestinale umane e realizabil i s-a dovedit eficace n testele iniiale. Bonusurile legate de sntate a asemenor experimente ofer potenialul de a controla o mare parte din bolile intestinale, profilactic.Totui este esenial ca cele mai bune metodologii s fie aplicate n aceast zon a tiinei. Aceasta va implica cu siguran o aplicaie genomic n cercetare i este deja n stadiul de urmrire molecular a schimbrilor microbiotei la alimentaie n teste controlate la oameni.

3.1 Ecologia microbian a tractului gastrointestinal uman

Tractul gastrointestinal uman este realizat dintr-un consoriu complex de microorganisme care colonizeaz intestinele de-a lungul su. La natere, tractul gastrointestinal nu conine germeni, colonizarea iniial avnd loc dup natere sau cu puin timp dup aceasta. Primele colonii precum cocii gram + facultativi, enterobacteriile i lactobacilii deschid rapid porile i pentru specii anaerobe i, n cazul bebeluilor hrnii cu lapte matern,la o microflora dominat de bifidobacetii. La nrcare, diversitatea microflorei se mrete i dup aproximativ doi ani, compoziia sa este echivalent cu cea a unui adult.(Conway,1995)

17

Stomacul este gazda pentru un numr destul de mic de microorganisme, n numere de 10x10x10 la coninutul de uniti formatoare de colonii UFC/g (Gibson i Beaumont,1996). n intestinal subire, numeral pentru bacterii i diversitate sunt limitate de ctre un timp de tranzit rapid i de secreii digestive precum acizii bliari. n partea inferior a intestinelor subiiri, micarea coninutului intestinal este ncetinit i proporii mari de populaii microbiene sunt observate (aproximativ 10 la a16a UFC/ml). Microflora colonial este extrem de complex, fiind format din pn la 500 de specii diferite (Gibson & Beaumont,1996). Populaia microbian de climax poate ajunge pn la 10 la a12a UFC/g de lumen coninut. (Conway,1995) Microflora este dominat strict de ctre bacterii anaerobe, care fermenteaz straturi endogene sau exogene (Macfarlane & McBain,1999). Acizii grai cu lan scurt,n special acetaii,propionatii,butiraii,lactaii,contribuie asupra metabolismului energetic a mucoasei intestinale mari i asupra creterii celulare coloniale,i sunt metabolizai sistemic de esuturi gazda precum ficatul,muchii i creierul. Capacitile fermentative a microflorei coloniale contribuie la funcia digestive a intestinului gros, acionnd asupra unor cmpusi de origine alimentar i asupra secreiilor gazdei,permind recuperarea nutrienilor care altfel ar fi fost pierdui de ctre gazd ( Macfarlane & McBain,1999). Microflora colonial este implicat n motilitatea intestinelor,n ciclul enterohepatic a acizilor biliari i posibil n metabolismul colesterolului,rezultnd n producia sterolilol fecali neutri ( Rafter,1995). Diversitatea speciilor i gama interaciunilor microbiene conduc la un nivel nalt de homeostaz i autoreglare n microflora colonial (Veilleux & Rowland,1981). Stabilitatea microflorei limitea efectiv capacitatea microorganismelor invadatoare, incluznd patogenii, pentru a coloniza mucoasa intestinal, dnd natere la ce a fost denumit rezistena de colonizare (Henges,1992). Microbiota colonial a fost legat de apariia unor boli precum boala intestinelor inflamate,gastroenterite i cancerul de colon (Gibson & Macfarlane,1994). Compui precarcinogeni i xenobiotici ingerai cu mncarea sunt acionai de activitatea enzimatic a microflorei coloniale (Rowland,1995). Asemenea reacii pot rezulta n producere de carcinogeni sau la detoxifierea lor . n mod similar , H2S-ul produs de bacteriile reductoare de sulfat n intestinele umane este extreme de toxic i poate provoca colite ulcerante ( Gibson & Beaumont,1996). n mod similar SCFA-ul produs de bacterii se pare c apr colonul mpotriva cancerului ( Rowland,1995). Sistemul imunitar intestinal, la un subiect sntos,exist ntr-o stare de homeostaza cu microflora. Aceasta poate reflecta rolul benefic al microflorei intestinale i evoluia microorganismelor indinge n gazda lor uman ( Conway,1995).

18

3.2 mbuntirea alimentaiei cu ajutorul : probioticelolor, prebioticelor i sinbioticelor

Recunoaterea aspectelor benefice ale acestor tipuri de microorganisme a ncurjat modularea microbiotei umane spre o compoziie mai benefica precum i un metabolism mai eficient. Conceptul de modulare intestinal pentru o sntate mbuntit a gazdei dateaz la nceputul secolului XX, dar doar recent oameni de tiin de renume au nceput studii i investigaii asupra acestuia. Trei strategii au ieit la suprafaa: acestea sunt (1) mbuntirea microflorei intestinale prin utilizarea de microorgansime exogene (probiotice); (2) avansarea selectiv a creterii i activitilor benefiece ale speciilor indingene gazdei (prebiotice); (3) sinbiotice,care sunt o combinaie din primele dou. (Gibson & Roberforoid,1995) 3.2.1 mbuntirea alimentaiei cu ajutorul probioticelor Probioticele sunt suplimente alimentare vii care au un efect benefic asupra echilibrului intestinal al gazdei (Fuller,1989). Eforturi recente s-au concentrat n identificarea bacteriilor probiotice i asupra caracterizrii beneficiilor lor. n general se considera c probioticele trebuie s posede anumite proprieti; trebuie s supraveuiasc trecerii zonelor superioare ale tractului gastrointestinal i s persiste n colon; trebuie s nu aib efecte adverse, fie ele, fie componentele lor; trebuie s fie antagonce organismelor mutagene sau patogene din intestine i trebuie s fie genetic stabile; pentru o introducere de succes a conceptului de probiotice n piaa alimentar, microorganismele alese trebuie s fie viabile pentru procesarea industrial n produse finale. (Ziemer & Gibson,1998). Descoperirile legate de genetic tipurilor de probiotice (deobicei din genul Lactobacillus spp. sau drojdii) au fcut posibil determinarea unor mecansime implicate n funcia probioticelor, precum producerea de produse antimicrobiene, aderarea la mucoasa i cile lor metabolice. Aceasta ncurajeaz posibilitile de modiciare a genurilor existente pentru a mri rata de supraveuire precum i eficacitatea lor n tractul gastronintestinal uman. Totui,exista lipsuri n nelegerea modului de funcionarea al probioticelor cu privina la mecansimele responsabile de rezultatele n vivo. Beneficiile dpentru sntatea asociate probioticelor sunt listate n urmtorul tabel:

19

Tabel 3.1 - Efectele diferitelor specii de probiotice Tabel 3.1 The effects of diferent probiotic species Efectul descoperit Modularea sistemului imunitar Specia de probitc Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. delbrueckii, L. Echilibrarea microbiotei intestinale Reducerea activitii enzimelor fecale Efecte antitumorale rhamnosus L. acidophilus, L. casei, Bifidobacterium bifidum L. acidophilus, L. casei, L. gasseri, L. delbrueckii L. acidophilus, L. casei, L. gasseri, L. delbrueckii, L. plantarum, B. infantis, B. adolescentis, B. bifidum, B. Prevenirea diareei cltorului longum Saccharomyces spp., mixture of L.

acidophilus, B. bifidum, Prevenirea diareei rotavirus Streptococcus thermophilus, L. bulgaricus L. rhamnosus, B. bifidum

3.2.2 Probioticele i sistemul imunitar. Cele mai convingtoarea rezultatea asupra eficacitii probioticelor vin din zona intoleranei i alergiei alimentare: acestea includ n special intoleran la proteina din laptele de vac i intolereana la lactoz. Probioticele pot modula inflamaiile alergice prin: Alterearea imunogenicitii alergenilor prin activitatea proteolitic Normalizarea compoziiei microbiotei intestinale Reducerea secreiilor mediatorilor inflamatori din intestine Reversabilitatea permeabilitii intestinale crescute Reversabilitatea absorbiei crescute de macromolecule Creterea rspunsului mucosal al imunoglobulinei A la antigeni enterali Modificarea schimbrilor sistemice legate de inflamaiile alergice 20

Ameliorarea simptomelor clinice ai alergenilor alimentari

3.2.3 Metode tiinifice pentru dobndirea funciilor benefice ale bacteriilor probiotice. n ciuda cercetrile intensivce n acest domeniu, progresul au fost limitat de o varietate de cauze si efecte. Studiile individuale conin informaii asupra unui set specific de probiotice, dar cum bacteriile au o natur heterogen i difer n funcie de gen, specie sau lan, este dificil de fcut o concluzia general asupra probioticelor ca o unitate. 3.2.4 Limitrile datorate probioticelor. Marile limitri ale probioticelor sunt supraveuirea n depozitarea i supresia tractului gastrointestinal. Datorit climaxului microbian al ecosistemului din colon,trebuie s fie prezente n numere cel puin echivalente cu 7-8 log10 CFU/ml n coninutul lumenului (Ducluzeu & Bebsada,1982). n mod similar, dozri repetate sunt necesare pentru a menine un numr biologic signifiant al probioticelor (Korpela & Saxelin,1999). n mod clar, un mod de difereniere trebuie aplicat intre genurile care au o populaie stabil ridicat n microflora intestinal prin dozrile orale zilnice i membrii indigeni ai microbiotei. 3.2.5 mbuntirea alimentaiei cu ajutorul prebioticelor Prebioticul = ingredientul alimentar nedigerabil care influeneaz benefic gazda prin stimularea selectiv a creterii i/sau activitii uneia sau unui grup limitat de bacterii n colon. Prima definiie a prebioticelor a fost dat de Gibson i Roberfroid (1995): ingrediente alimentare nedigerabile care influeneaz benefic organismul gazd prin stimularea selectiv a creterii i /sau activitii uneia sau a unui numr limitat de bacterii n colon. Prebioticul este o substan care modific compoziia microflorei n colon n aa fel nct cteva dintre bacteriile cu efect benefic asupra sntii (n special, dar nu exclusiv, lactobacili i bifidobacterii) devin predominante. Efectul benefic este imediat prin stimularea selectiv a creterii i/sau activitii uneia sau a unui numr limitat de bacterii n colon. 21

Aceste ingrediente alimentare definite ca prebiotice trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii: - s nu fie susceptibile la hidroliz sau absorbie n tractul gastrointestinal; - s reprezinte un substrat selectiv pentru o bacterie sau un numr limitat de bacterii n colon; - s modifice microbiota colonului spre o compoziie benefic pentru sntate; - s induc sistematic efecte benefice pentru sntatea uman. Unele prebiotice pot fi extrase din surse vegetale (plante medicinale), dar cele mai multe sunt sintetizate folosind metode chimice i enzimatice. Probioticele sunt componente alimentare non-viabile ( deobicei oligozaharide) care scap de digestia enzimelor mamaliene din zonele superioare ale tractului gastrointestinal, ajung la colon ntro stare intact i sunt hidrolizata de membrii beneficiari ai microbiotei indigene (Gibson & Roberfroid,1995). Fermentaia selectiv a prebioticelor de ctre aceste microorganisme trebuie s rezulte ntr-o compoziie mai sntoas a microflorei intestinale i s induc efecte sistemice ale lumenului,benefice gazdei.Prebioticul ideal i cel mai eficient ar fi capabil deasemenea s reduc sau induc n supresie numere i activiti ale diverilor patogeni cunoscui. Oligozaharidele care au fost propuse drept prebiotice include: lactuloza, galacto-oligozaharidele, fructooligozaharidele,malto-oligozaharidele,xilo-oligozaharidele i oligozaharidele din soia. Potenialul prebiotic provine din ferementatia lor selectiva de ctre Bifidobacterium spp i, mai puin de ctre Lactobacillus spp. n microflora colonului. 3.2.6 mbuntirea alimentaiei cu ajutorul sinbioticelor Conceptul de sinbiotice combin eficacitatea lanurilor de probiotice cu componeni specifici ai prebioticelor ntr-un singur prdous. inta este deci, mrirea ansei de supraveuire a probioticelor n timpul trecerii prin partea superioar a tractului intestinal i pentru a produce o implantatre mai eficient n microflora colonului,mpreun cu un efect stimulant asupra activitilor de cretere ale att probitocielor ct i lanurilor de bacterii indigene (Roberfroid,1998) O problem n ncercrile clinice cu sinbiotice este determinarea crui componet ale sinbioticului care are vreun efect. Exist mai multe efecte potenial benefice asupra sntiei sau nutriiei din partea unor specii de bacteria ale acidului lactic.Printre acestea se numr: valoarea nutritiv mbuntit, controlul 22

infeciilor intestinale, digestia mbuntit a lactozei,controlul unor tipuri de cancer precum i controlul nivelelor de colesterol.Unele efecete potenial benefice pot rezulta din creterea i aciunea bacteriilor din timpul produciei de alimente cu culture. Altele pot rezulta din creterea i aciunea anumitor specii de bacterii lactice n tractul intestinal ca urmare a ingestiei de alimente ce le conin. n selectarea unei culture care s produc un beneficiu specific este necesar s se considere nu numai variat mare dintre speciile de bacteria ale acidului lactic dar i de posibilitatea existenei mai multor tipuri i n interiorul aceleai specii. Producia de alimente fermentate este bazat pe utilizarea de culture starter, ca de exemplu bacteria lactice care iniiaz rapid acidierea materiei prime. Recent, noi culturi starter de bacterii ale acidului lactic, cu o importan industrial ridicat au fost descoperite.Acestea pot contribui la siguran microbian sau pot oferi una sau mai multe avantaje organoleptice,tehnlogice sau nutriionale. Exemple sunt bacteriile acidului lactic care produc substane antimicrobiene,zaha polimeraze, ndulcitori,compui aromatic, vitamine , sau enzime folositoare, sau care au proprieti probiotice. n general bacteriile acidului lactic sunt deobicei asociate cu produse lactate fermentate i cu utilizarea culturilor starter din lactate,devenind treptat o ntreaga industrie a acestui secol.

CAPITOLUL 4 BACTERIILE LACTICE N BIOCONTROL I FERMENTAIE

23

Bacteriile lactice se clasifica n dou categorii: a) b) Adevrate - G (+), facultativ anaerobe, capabile s produc acid lactic n cantitate mare. False (pseudofermenti lactici) - G (-), aerobe i facultativ anaerobe. Au fost studiate efectele temperaturii i pH-ului asupra activitii proteolitice a bacteriilor acido-lactice. Lactobacilii i streptococii termofilici au prezentat o proteoliza mai avansat la 15 i 45C i streptococii mezofilici au artat numai o slab activitate la temperaturile luate n studiu. Variaiile pH-ului au avut, de asemenea, o influen puternic asupra hidrolizei cazeinei; acest efect a fost mai evident la streptococi dect la lactobacili. Cele utilizate n industria alimentar sunt cele din prima categorie i cuprind urmtoarele genuri: Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus. Bacteriile acidului lactic sunt bacteria gram positive, deobicei non-sporulante n form de bastonae sau coci. Le lipsesc catalaze i sunt strict fermentative,producnd fie un amestec de acid lactic,dioxid de carbon,acid acetic i/sau etanol (heterofermentatie) sau aproape n totalitate acid lactic (homofermentatie) ca produs final principal(Rogosa,1974). Bacteriille lactice au fost divizate n dou grupe n funcie de produsul final obinut din metabolismul glucozei; cele ce produc acid lactic c singur produs de fermentaie sunt desemnate drept homofermentative.Modelul homofermnetativ este observat cnd glucoza e metabolizat dar nu neaprat cnd zaharurile pentozice sunt metabolizate,pentru unele,bacteriile homolactice pot produce acizi acetic utiliznd pentozele. Deasemenea caracterul homofermentativ al homolacticelor poate fi schimbat pentru unele lanuri prin alterearea condiiilor de cultural precum concentraia de glucoz,pH-ul i limitarea nutrienilor. Homolacticele sunt capabile s extrag o cantitate dubl de energie dintr-o cantitate data de glucoz,la fel ca i heterolacticele. Aceste bacterii lactice care produc cantiti molare egale de lactate,dioxid de carbon i etanol din hexoze sunt heterofermentative. Toi membrii din genul Pediococcus, Streptococcus, Lactococcus i Vagococcus sunt homofermentatori,precum i o parte din cei din genul Lactobacillus,n timp ce toate cele din Leuconostoc sp., precum i unii Lactobacilli sunt heterofermentatori. Bacteriile heterolactice sunt mai importante dect cele homolactice n producerea de component pentru gust i arome ca acetaldehida i diacetilul (Sharpe, 1979;Jay,1986).

Dup echipamentul enzimatic, se pot distinge, trei tipuri de bacterii: 24

bacterii lactice obligatoriu homofermentative (conin aldolaza, dar nu au glucozo - 6 fosfat dehidrogenaza, 6 - fosfogluconat dehidrogenaza); bacterii lactice obligatoriu heterofermentative (nu conin aldolaza, au n schimb hexozodehidrogenaze); bacterii lactice facultativ homofermentative (care conin att hexozodehidrogenaze, ct i aldolaza), care fermenteaz hexozele cu formare de acid lactic, pe calea glicolizei. Prezena bacteriilor lactice n microflora intestinal poate fi benefica: cresc competiia pentru nutrieni, produc peptide antimicrobiene i constrng supravieuirea i creterea bacteriilor duntoare (n special, cele patogene); controleaz intestinul i scad colesterolului (ex. Bifidobacteriile).

4.1 Bacteriile lactice acide ca probiotice

n discuia importanei speciilor de Lactobacillus la alimentele fermentate ,nevoia de a fi considerate ca probiotice a fost definit ca un adevrat supliment alimentar, care e benefic gazdei animale prin mbuntirea balanului intestinal microbian ( Steinkrause,1995). Lactobacillus sp. a fost utilizat ca organism probiotic. n acest caz, L. acidophilus a fost utilizat pentru c se credea a fi lactobacillus cel mai important din intestine. Totui, o gam larg de lactobacilli a fost folosit n preparatele probiotice. Acestea include : L. delbreuckii subsp. Bulgaricus, L. casei, L. brevis, L. celobiosus, L. lactic, L. fermentum, L. plantarum i L. reuteri (Steikrause, 1995; Vinderola i co. , 2002). Metchnikoff (1908) a descries efectul benefic al bacteriilor lactice acide asupra sntii umane acum mai mult de un secol. Dei, numeroase studii au susinut afirmaiile lui Metchnikoff, a fost o disciplin tiinific greu de identificat,precum a fost i de demonstrate modul de aciune al probioticelor ( Matila-Sandhom i co,1999). Flora bacterian preexistenta a tractului digestive este complex i greu definit ceea ce face ca modul de aciune al probioticelor s fie greu de demonstrat n interiorul ecosistemului intestinal. (Tannock,1998; Kleessen i co.,2000). Prezena microflorei microbiene este necesar pentru funcia normal a sistemului digestiv.Eliminarea sau perturbarea sever a florei duce la diaree sau constipaie,deci este de dorit meninerea unei flore bacteriene sntoase (Tannock,1998).n absena unor modele precise ale modului de aciune, un numr de criterii practice pentru selectarea lanurilor de probiotice a fost formulat ( Collins i 25

colab.,1998;Salminen i colab,2000).Creterea mare n incidena alergiilor la populaia lumii industrializate este nc n mare parte neexplicat. Una din multele ipotze este cea a igienei, care explica creterea acestei expuneri ctre aseptic. (Martinez i Holt,199;Van den Biggelaelar i colab..2000). Dac aceastea este ntr-adevr o parte din problema ,vom fi nevoii s dezvoltm viitoarele alimente fermentate sau produse probiotice n aa maniera nct s conin microorganisme sigure care s contraatace aceasta distorsiune nedorit a sistemului imunitar.

4.2 Importanta bacteriilor lactice acide i impactul lor asupra sntii umane
De interes primar este rolul bacteriilor lactice acide n tratarea oamenilor ce sufer de tumori sau sunt subieci cu imunitate compromis. Dovezile c bacteriile lactice acide pot stimuli sistemul imunitar sunt remarcabile i fascinante i deschid mult ntrebri despre mecanismele i utilizarea lor efectiv. Dac potenialul lor ar fi pus n practic,atunci ar exista multe component de terapie convenional.Aceasta poate include eficacitatea n costuri datorit uurinei de realizare a produselor derivate din bacteriile lactice acide,care deasemenea se pare c au o toxicitate sczut n comparaie cu alte tratamente. (Woods,1992). 4.3 Bacteriile lactice acide i alte efecte asupra sistemului imunitar Bacteriile lactice acide sunt prezente n intestinele majoritii animalelor. Rolul benefic jucat de ctre aceste microorganisme la oameni i animale,incluznd efectul asupra sistemului imunitar a fost studiat extensiv (Perdigon i colab., 2001). Bacteriile lactice acide sunt prezente n majoritatea alimentelor i sunt folosite frecvent ca probiotice pentru mbunirea funciilor biologice ale gazdei. Prin diferite mecanisme, ele trimit semnale ctre celule imun active. Deci cunoaterea florei intestinale normale,contribuia bacteriilor lactice acide i rolul lor n numeroase funcii n tractul digestive,prcum i modul de funcionare a sistemului imunitar al mucoasei este necesar.n selecia bacteriilor lactice acide prin capacitatea lor stimulatorie pentru imunitate,este necesar s se cunoasc nu numai efectul lor asupra sitemului imunitar al mucoasei,dar i utilizrile specifice pentru care utilizrile orale ale acestora sunt dispuse. (Perdigon i colab.,2001) Tabel 4.1 - Produse alimentare, buturi fermentate i bacteriile lactice acide asociate lor. Tabel 4.1 - Food products, fermented drinks and the lactic bacterias associated with them. 26

Tipul de produs fermentat Produse lactate Brnzeturi tari fr guri Brnzeturi cu guri mici

Bacteria lactic acid L. lactic subsp. Lactis, L. lactis subsp. cremoris L. lactic subsp. Lactis var diacetylactis, , L. lactis subsp. Cremoris,Leuc. Mesenteroides subsp. cremoris

Tipuri de brnzeturi Elveiene/Italiene

L. delbrueckii subsp lactis, Lb. helveticus, Lb. casei, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, S. thermophilus

Unt i lapte btut

L. lactis subsp lactis, L. lactic subsp. Lactis var diacetylactis,L. lactis subsp cremoris, Leuc mesenteroides subsp, cremoris

Iaurt

L.

delbrueckii

subsp.

bulgaricus,

S.

thermophilus Lapte probiotic fermentat Kefir Crnuri fermentate Crnai fermentai (Europa) Crnai fermentai (SUA) Produse fermentate din peste Tipul de produs fermentat Legume fermentate Leuc. Mesenteroides, Lb. plantarum, Varza murat Castraveii murai P. acidilactici Leuc. Mesenteroides, P. cerevisae, Lb. brevis, Lb. plantarum Lb. casei, L. acidophilus, Lb. rhamnosus, Lb. Johnsonii, B. lactis, B. bifidum, B. breve Lb. kefir, Lb. kefiranofacies, Lb. brevis

Lb. sakei, Lb. curvatus P. acidalactici, P. pentosaceus Lb. alimentarius, C. piscicola Bacteria lactic acid

27

Msline fermentate

Leuc.

Mesenteroides,

Lb.

pentosus,

Lb.

plantarum, P. acidiactici, P. pentosaceus, Lb. plantarum,Lb. fermentum Sos de soia fermentat Cereale fermentate Coca srat T. halophilus

Lb.

sanfraniscensis, Lb.

Lb.

farcimnis, panis,

Lb. Lb.

fermentum, Lb. brevis, Lb. plantarum, Lb. amylovorus, reuteri,Lb. alimentarius, W.cibaria Buturi alcoolice Vin (fermentaie malolactica Vin din orez O. oeni Lb. sakei

B: Bifidobacterium, C: Carnobacterium, L: Lactococcus, Lb: Lactobacillus, Leuc: Leuconostoc, O: Oenococcus, P: Pediococcus, S: Streptococcus, T: Tetragenococcus, W: Weissella

CAPITOLUL 5 - OBINEREA DE BIOMAS I EXOPOLIZAHARIDE DIN LACTOBACILLUS PARACASEI IL2 i LACTOBACILLUS PLANTARUM IL3

5.1 Scopul Lucrri

Studiul urmrete obinerea de biomas liofilizat din tulpinile Lactobacillus paracasei IL2, Lactobacillus plantarum IL3 pe baza productivitii lor (P). Mediul optim s-a ales prin utilizarea Bioscreen C MBR i a softului EZExperiment. S-au calculat viteza maxim de cretere, timpul de dublare i productivitatea celular pentru fiecare dintre cele dou tulpini. S-au testat diferite surse de azot i raporturile dintre ele. A rezultat un maximum al productivitii i al sintezei de exopolizaharide n sistem batch, prin utilizarea a 10 g/litru pepton, 4 g/litru extract de drojdie pentru ambele tulpini. Pentru Lactobacillus paracasei IL2 rezult o productivitate de 0,98 h-1gl-1 i 600 mg exopolizaharide/litru, iar pentru Lactobacillus plantarum IL3 a rezultat o productivitate de 0,75 h-1gl-1 i 250 mg exopolizaharide/litru. Compoziia chimic a polizaharidului celor dou 28

tulpini testate este format n principal din glucoz, cu un coninut mediu de 27,65% glucoz anhidr i un gradul de polimerizare mediu de 43,7%. Scopul acestui studiu l reprezint cultivarea n sistem batch a dou tulpini de bacterii lactice Lactobacillus paracasei IL2 i Lactobacillus plantarum IL3, aflate n colecia USAMV Bucureti, Facultatea de Biotehnologii, pentru obinerea de biomas i exopolizaharide. Sursa de carbon utilizat o reprezint glucoz, parametrii fermentaiei fiind 370C, pH 7 i 75 rpm. Mediul de cultur (exceptnd glucoz) s-a stabilit prin utilizarea Bioscreen C, iar cu ajutorul softului EZExperiment sa calculat productivitatea, viteza de cretere i timpul de dublare n timp real a tulpinilor.

5.2 Materii prime i metode

Material biologic. Dou tulpini de bacterii lactice din genul Lactobacillus (Lactobacillus paracasei IL2 i Lactobacillus plantarum IL3) au fost utilizate la realizarea studiilor. Cele 2 tulpini din colecia Facultii de Biotehnologii sunt pstrate la -820C, n glicerol 20%. Revitalizarea tulpinilor s-a fcut prin dou cultivri succesive pe mediu MRS. Condiii de cultivare. n prima etap a studiului s-a determinat, pentru fiecare tulpin, mediul de cultur optim, prin calcularea productivitii celulare, utiliznd Bioscreen C i softul EZExperiment. Mediile de cultur testate conin sucroz (150 g/litru), iar ca surse de sruri minerale (g/litru): KH2PO4 5g, MgSO4 0.25g, MnSO4 0.2g. n funcie de sursa de azot se utilizeaz urmtoarele variante: Mediul MLBv1 (g/litru): 10 g pepton, 4 g extract de drojdie; Mediu MLBv2 (g/litru): 15 g pepton, 5 g extract de drojdie; Mediu MLBv3: 10 g pepton, 4 g extract de mal; Mediu MLBv4: 10 g pepton, 4 g extract de mal, 4 g extract de drojdie. Testele s-au fcut n paralel cu mediul MRS. Testele au avut loc la pH 7 i 370C Odat stabilit formula de mediu optim, tulpinile s-au cultivat n sistem batch, la 370 C, pH 7, ntr-un bioreactor New Brunswick BioFlo 310, dotat cu softul Biomass+ v1.92, pentru

29

determinarea cantitii de biomas n timp real (g/litru). S-au recoltat probe pentru determinarea cantitii de exopolizaharide n sistem batch.

5.3 Determinri efectuate

Izolarea i determinarea cantitii de exopolizaharide. Fiecare prob a fost inut 10 minute la 1000C ntr-o etuv Memmert, dup care a fost rcit pe baie de ghea. Precipitarea proteinelor s-a fcut prin adugare de 15% acid tricloracetic. Celulele microorganismului i proteinele s-au ndeprtat prin centrifugare la 5.000 rpm, timp de 10 minute ntr-o centrifug Hettich Eba 32R cu rcire. Exopolizaharidele sintetizate au fost precipitate din supernatantul rezultat prin adugare de dou volume de etanol 100%. Amestecul s-a lsat peste noapte la 40C i polizaharidul a fost separat prin centrifugare cu aceeai centrifug la 13.000 rpm, timp de 15 minute. [2] Determinarea cantitii de sucroz. S-a realizat prin utilizarea testului UV de determinare a sucrozei/D-glucozei de la R-Biopharma. Determinarea parametrilor cinetici. Determinarea valorii vitezei specifice maxime de cretere celular max. S-a calculat valoarea lui din ecuaia pentru intervalul de timp dintre dou probe ale unei cultivri. Valoarea maxim gsit reprezint viteza specific maxim max, pentru cultivarea respectiv. Determinarea timpului de dublare a concentraiei celulare (TD): s-a calculat
ln 2

dup formul: TD =

. Determinarea productivitii celulare: Productivitatea celular reprezint

masa de celule uscate obinute pe unitatea de volum de cultur, n unitatea de timp: P = DX , n sistem batch P = X (P = productivitatea celular, gl-1h-1, D = rata de diluie, h-1, X = concentraia celular, gl-1, = viteza de cretere celular). [6] Determinarea compoziiei exopolizaharidelor prin cromatografie n strat subire (CSS): s-au folosit plci cromatografice cu coninut de silicagel G, Merck, grosimea stratului 0,25 mm. Developant: apa/ metanol/ acid acetic glacial/ 1,2-dicloretan (10/15/25/50, v/v/v/v). Pentru dozarea monomerilor s-a utilizat metoda fenol-sulfuric, exprimarea fcndu-se n % de glucoz. Vscozitatea i gradul de polimerizare: pentru efectuarea determinrii se utilizeaz un vscozimetru capilar potrivit (Ubbelhode), a crui constant (k1) este cunoscut.

30

CAPITOLUL 6 REZULTATE I DISCUII

Prima etap a studiului a fost reprezentat de stabilirea mediului de cultur pentru cultivarea la nivel de laborator, utiliznd Bioscreen C. Testele s-au realizat n paralel pentru cele dou tulpini IL2 i IL3.

31

Figura 6.1 Curba de cretere a tulpinii Lactobacillus rhamnosus IL2, utiliznd Bioscreen C Figure 6.1 The growth curve for stem Lactobacillus rhamnosus IL2,using Bioscreen C

Tabelul 6.1 - Evoluia medie a funciilor X(t) i (t) n cazul cultivrii Lactobacillus paracasei IL2 pe mediul MRS Tabel 6.1 The medium evolution of function x(t) and (t) in case of cultivation with Lactobacillus paracasei IL2 MRS environment Nr. Probe Timp (ore) X, gl-1 lnX lnX ln(X-1) , h-1 1 4 1,67 0,51 2 8 2,08 0,73 0,22 0,055 3 12 2,18 0,77 0,04 0,01 4 16 2,22 0,79 0,05 0,0125 5 20 2,24 0,8 0,01 0,0025 6 24 2,26 0,81 0,01 0,0025

mediu = 0,016 h-1; max = 0,055 h-1; TD =

1

ln 2

0,69 = 0,055 =12,5 ore; P = 0,055 h-1 2,08 g/l = 0,12 h-

gl-1

Tabelul 6.2 - Evoluia medie a funciilor X(t) i (t) n cazul cultivrii Lactobacillus paracasei IL2 pe mediul MLBv1 32

Tabel 6.2 The medium evolution of function x(t) and (t) in case of cultivation with on Lactobacillus paracasei IL2 MLBv1 environment Nr. Probe Timp (ore) X, gl-1 lnX lnX ln(X-1) , h-1 1 4 1,4 0,33 2 8 1,8 0,58 0,25 0,062 3 12 2 0,69 0,11 0,0275 4 16 2 0,69 0 0 5 20 2 0,69 0 0 6 24 2,1 0,74 0,05 0,0125

mediu = 0,02 h-1; max = 0,062 h-1; TD =

1

ln 2

0,69 = 0,062 = 11,12 ore; P = 0,062 h-1 1,8 g/l = 0,11 h-

gl-1 Dintre mediile de cultur folosite, s-a ales varianta MLBv1 care determin obinerea unor

valori ale D.O. ct mai apropiate de cele rezultate n cazul MRS (Figura 6.1). Pentru varianta MLBv1 i MRS s-au calculat parametrii cinetici (Tabelul 6.1 i Tabelul 6.2). Se observ c mediul MRS determin obinerea unei viteze de cretere (max) cu aproximativ 21% mai mic dect MLBv1 i un timp de dublare cu 1,38 ore mai mare. Diferenele n cazul celorlalte variante de medii de cultur sunt i mai mari. Productivitatea (P) pentru varianta MLBv1 este de 0.11 h -1gl-1, adic cu aproximativ 8% mai mic dect n cazul MRS. De mensionat este faptul c pentru aceste variante nu exist un control al pH mediului de cultur, acesta nefiind corectat pe parcursul celor 24 de ore. De aceea, diferenele de productivitate nu pot fi considerate a fi semnificative, ele se ncadreaz n variaiile normale ale oricrei fermentaii. n acest caz diferenele dintre mediul de cultur l reprezint viteza de cretere i timpul de dublare, ce indic o mai bun evoluie a tulpinii n mediul MLBv1.

33

Figura 6.2 Curba de cretere a tulpinii Lactobacillus plantarum IL3, utiliznd Bioscreen C Figure 6.2 The growth curve for stem Lactobacillus plantarum IL3 using Bioscreen C

Tabelul 6.3 Evoluia medie a funciilor X(t) i (t) n cazul cultivrii Lactobacillus plantarum IL3 pe mediul MRS Tabel 6.3 The medium evolution of function x(t) and (t) in case of cultivation with Lactobacillus plantarum IL3 on MRS environment 3 4 5 6 12 16 20 24 1,92 2,04 2,1 2,13 0,65 0,71 0,74 0,75 0,28 0,06 0,03 0,01 0,07 0,015 0,0075 0,0025 0,69 ln 2 mediu = 0,034 h-1; max = 0,075 h-1; TD = = 0,075 = 9,2 ore; P = 0,075 h-1 1,46 g/l = 0,1 h-1gl1

Nr. Probe Timp (ore) X, gl-1 lnX lnX ln(X-1) , h-1

1 4 1,08 0,07 -

2 8 1,46 0,37 0,3 0,075

34

Tabelul 6.4 Evoluia medie a funciilor X(t) i (t) n cazul cultivrii Lactobacillus plantarum IL3 pe mediul MLBv1 Tabel 6.4 The medium evolution of function x(t) and (t) in case of cultivation with Lactobacillus plantarum IL3 on MLBv1 environment Nr. Probe Timp (ore) X, gl-1 lnX lnX ln(X-1) , h-1 1 4 1,3 0,26 2 8 1,6 0,47 0,21 0,05 3 12 1,77 0,57 0,1 0,025 4 16 1,86 0,62 0,05 0,01 5 20 1,9 0,64 0,02 0,005 6 24 1,95 0,66 0,02 0,005

mediu = 0,019 h-1; max = 0,05 h-1; TD =

ln 2

0,69 = 0,05 = 13,8 ore; P = 0,05 h-1 1,6 g/l = 0,08 h-1gl-1

Pentru tulpina Lactobacillus plantarum IL3, la fel ca i pentru tulpina IL2, s-a ales varianta MLBv1 care determin obinerea unor valori ale D.O. mai mari dect cele rezultate n cazul MRS (Figura 6.2). Pentru MLBv1 i MRS s-au calculat parametrii cinetici, rezultatele fiind prezentate n Tabelul 6.3 i Tabelul 6.4. Se observ c mediul MLBv1 determin o vitez de cretere (max) de 0.08 h-1, cu 20% mai mic dect n cazul MRS, i cu aproximativ aceeai procent dect cea a tulpinii IL2. Diferenele sunt mici pentru cele dou variante de medii de cultur, mai ales pentru c nu exist un control al pH, absolut necesar pentru cultivarea n medii de tip industrial. n schimb, parametrul care face n acest caz diferena este viteza de cretere (max) care pentru varianta MLBv1, tulpina IL3 este este cu 33% mai mare dect n cazul mediului clasic MRS. Astfel viteza de cretere (max) pentru IL2, este cu 20% mai mic dect pentru tulpina IL2. Astfel, varianta MLBv1 este formula de mediu aleas pentru cultivarea tulpinilor Lactobacillus paracasei IL2 i Lactobacillus plantarum IL3 la nivel de bioreactor, n sistem batch, pentru obinerea de exopolizaharide.

35

Figura 6.3 Acumularea de biomas pentru tulpina Lactobacillus paracasei IL2 n sistem batch Figure 6.3 Biomass acumulation for stem Lactobacillus paracasei IL2 in batch system

Tabelul 6.5 Evoluia medie a funciilor X(t) i (t) n cazul cultivrii Lactobacillus paracasei IL2 pe mediul MLBv1, n sistem batch Tabel 6.5 The medium evolution of functions x(t) and (t) in case of cultivation with Lactobacillus paracasei IL2 on MLBv1 environment,in batch system Nr. Probe Timp (ore) X, gl-1 lnX lnX ln(X-1) , h-1 1 4 1,12 0,11 2 8 3,51 1,25 1,14 0,28 3 12 4,77 1,56 0,31 0,07 4 16 5,77 1,75 0,19 0,04 5 20 7,18 1,97 0,22 0,05 6 24 9,86 2,28 0,31 0,07

mediu = 0.1 h-1; max = 0,28 h-1; TD =

ln 2

0,69 = 0,28 = 2,46 ore; P = 0,28 h-1 3,51 g/l = 0,98 h-1gl-1

36

Figura 6.4. Acumularea de biomas pentru tulpina Lactobacillus plantarum IL3 n sistem batch Figure 6.4 Biomass accumulation for stem Lactobacillus plantarum IL3 in batch system

Tabelul 6.6 Evoluia medie a funciilor X(t) i (t) n cazul cultivrii Lactobacillus plantarum IL3 pe mediul MLBv1, n sistem batch Tabel 6.6 The medium evolution of function x(t) and (t) in case of cultivation with Lactobacillus plantarum IL3 on MLBv1 environment in batch system Nr. Probe Timp (ore) X, gl-1 lnX lnX ln(X-1) , h-1 1 4 1,11 0,1 2 8 3,01 1,1 1 0,25 3 12 5,36 1,67 0,57 0,14 4 16 7,59 2,02 0,35 0,09 5 20 9,12 2,21 0,19 0,05 6 24 10,08 2,31 0,1 0,03

mediu = 0,11 h-1; max = 0,25 h-1; TD =

ln 2

0,69 = 0,25 = 2,76 ore; P = 0,25 h-1 3,01 g/l = 0,75 h-1gl-1

n cazul cultivrii n sistem batch, rezult o faz de lag de maximum dou ore pentru ambele tulpini. Tulpina Lactobacillus plantarum IL3 prezint o faz de cretere expontial mai mic cu 2 pn la 3 ore fat de tulpina Lactobacillus paracasei IL2, n condiii similare (Figura 6.3, Figura 37

6.4). n schimb, s-a obinut pe Lactobacillus paracasei IL2, o cretere a productivitii cu aproximativ 23% fat de cea a tulpinii Lactobacillus plantarum IL3 (Tabelul 6,5). Viteza maxim de cretere, pentru cele dou tulpini este egal n aceleai condiii de fermentaie (Tabelul 6.6). Pe parcursul fermentaiilor, s-a determinat i consumul sursei de carbon (glucoz). Aceasta este corelat n mod direct cu sinteza de biomas i exopolizaharide. n general, acumularea de biomas se oprete la 24 de ore (tulpina Lactobacillus plantarum IL3) , iar sinteza de exopolizaharide are loc spre sfritul fazei exponeniale de cretere (Lactobacillus plantarum IL3) sau n faza staionara pentru tulpina Lactobacillus paracasei IL2. n determinrile efectuate, cantitatea suei de carbon reziduale pentru cele dou tulpini, este n medie de 2,5 g/litru mediu de cultur, adic are loc un consum de 97,5%. n comparaie cu testele efectuate la nivel de laborator [ literatura Cluj,2009], n sistem batch rezult un plus de aproximativ 25% al cantitii de exopolizaharide ob 250 mg/litru. Prin identificarea compoziiei monomerilor prin CSS s-a obinut pe plac cromatografica apariia unor spoturi de culoare gri - violet, care corespund zaharurilor monomere. Acestea au fost identificate a fi corespunztoare glucozei. Astfel se poate considera c tulpinile produc o homopolizaharid. Coninutul de polizaharid, exprimnd rezultatul n procente de glucoz anhidr a fost de 26,36%, pentru tulpina IL2 i de 28,94% pentru tulpina IL3. Gradul de polimerizare obinut a fost de 50,7%, pentru tulpina IL2 i de 36,7 pentru tulpina IL3. n final biomasa s-a separat prin centrifugare i s-a splat de dou ori cu soluie de NaCl 0.5%. Ulterior s-a liofilizat ntr-un liofilizator Alpha 1-2D i a rezultat o pulbere alb, cu miros caracteristic. Supernatantul obinut n urma separrii biomasei, s-a concentrat ntr-un rotavapor Buchi. Exopolizaharidele s-au precipitat cu etanol, dup care precipitatul s-a liofilizat cu acelai liofilizator. Pstrarea biomasei i a exopolizaharidelor liofilizate, n ambele cazuri, se face la frigider, n tuburi din polipropilen nchise. inute. Cea mai productiv tulpin este Lactobacillus paracasei IL2, cu un maximum de 600 mg/litru. Pentru Lactobacillus plantarum IL3 rezult un maximum de

38

CONCLUZII
Din experimentele realizate n cadrul prezentei lucrri de licen, intitulat Obinerea de biomas i exopolizaharide din Lactobacillus Paracasei IL2 i Lactobacillus Plantarum IL3, se desprind urmtoarele concluzii: Pentru tulpinile Lactobacillus paracasei IL2 i Lactobacillus plantarum IL3 s-a Sursa de carbon folosit n prezena creia se obine un maximum al cantitii de S-a obinut un maximum de 600 mg exopolizaharide/litru pentru tulpina Lactobacillus Pentru Lactobacillus paracasei IL2 rezult o productivitate de 0,98 h-1gl-1, cu aproximativ

stabilit mediul optim de cultivare utiliznd Bioscreen C, pe baza productivitii. exopolizaharide a fost glucoza n concentraie de 10%, paracasei IL2 i 250 mg exopolizaharide/litru pentru Lactobacillus plantarum IL3. 88% mai mare fa de cultivarea la nivel de laborator. n schimb, pentru Lactobacillus plantarum IL3 a rezultat o productivitate de 0,75 h-1gl-1, n plus cu 90% fa de testele efectuate la nivel de laborator. Compoziia chimic a polizaharidului celor dou tulpini testate este format n principal din glucoz, cu un coninut mediu de 27,65% glucoz anhidr i un gradul de polimerizare mediu de 43,7%. 39

Bibliografie
1. Vamanu, E., Vamanu, A., Smarandache, D., Popa,O., Bbeanu,N., Nit, S., Marin,F., Danciu, Gh., (2009), The influence of carbon source and of the conditions for fermentation on the production of exopolysaccharides, Bulletin USAMV Cluj-Napoca, Seria Animal Science and Biotechnologies, 66, 1 2, 413 418, ISSN 1843 5262. 2. Vamanu,A., Vamanu, E., Popa, O., Cmpeanu Gh,, Drugulescu M., (2007), Biotechnological studies on the production of exopolysaccharides by lactic bacteria n batch system, Roumanian Biotechnological Letters, vol. 12, no. 2, 3194 3156. 3. Ruas-Madiedo,P.,(2005), Invited Review: Methods for the Screening, Isolation, and Characterization of Exopolysaccharides Produced by Lactic Acid Bacteria, J. Dairy Sci., 88, 843856. 4. Alan, D., Welman, S., Ian, S., Maddox, M.,(2003) Exopolysaccharides from lactic acid bacteria: perspectives and challenges, TRENDS n Biotechnology, 21, 269-274. 5. Vernazza, C., Bodun, A.,Gibson, R., (2004),Human Colonic Microbiology and the Role of Dietary Intervention: Introduction to Prebiotics, 1-28 6. Konstantinos, C., Mountzouris, T., Gibson, R., (2002) ,Colonization of the gastrointestinal tract, 1-15 7. Harish, K.,Varghese, T., (2006), Probiotics in humans evidence based review, Calicut Medical Journal;4(4):e3 40

8. Asmahan Azhari Ali, (2010), Beneficial role of lactic acid bacteria in Food Preservation and Human Health: A review, Research Journal of Microbiology 5(12): 1213-1221, ISSN 1816-4935 9. Steer, T.,Carpenter, H.,Tuohy K.,Gibson, G., (2000), Perspectives on the role of the human gut microbiota and its modulation by pro- and prebiotics. Nutrition Research Reviews ,13, 229-254 10. Marteau, P.,Boutron-Ruault, M.C., (2002). Nutritional advantages of probiotics and prebiotics, Br. J. Nutr.,87: S153-S157 11. Salminen, S., Wright, A.V. ,(1993). Lactic Acid Bacteria. Marcel Dekker,New York 12. Erickson, K.L., Hubbard, N.e., (2000). Probiotic immunmodulation in health and disease. J. Nutr.,130:403S-409S. 13. Shah, N.P., (2000). Probiotic bacteria: selective enumeration and survival in dairy foods. J. Dairy Sci., 83: 894-907. 14. Cebra, JJ.,(1999), Influences of microbiota on intestinal immune system development. Am J Clin Nutr; 69:104651. 15. Guarner, F., Malagelada, JR.,(2003), Gut flora in health and disease. Lancet; 361:5129. 16. Cebra, JJ.,(1999), Influences of microbiota on intestinal immune system development. Am J Clin Nutr; 69 :104651. 17. Isolauri, E., Sutas, Y., Kankaanpaa, P., Arvilommi, H., Salminen, S.,(2001), Probiotics: effects on immunity. Am J Clin Nutr.; 73:444S-450S

41