SUBIECTE

EXAMEN
2015 - 2016
1. Etapele elaborrii tehnologiilor de biosintez;
ETAPELE ELABORRII TEHNOLOGIILOR DE BIOSINTEZ
- cuprinde mai multe faze
- Laborator
- Micropilot
- Staii pilot
- Producie industrial
1. Faza de laborator cuprinde 2 etape
Etapa I
a. Izolarea, selectarea i testarea microorganismului productor prin tehnici specifice pentru
fiecare microorganism. Metode folosite pentru izolarea i testarea microorganismului:
- Tehnica diluiilor
Microorganismele sunt preluate din diferite habitate si sunt cultivate pe medii:
- solide
- lichide
Iniial se urmrete realizarea unei culturi pure prin tehnici microbiologice specifice
(epuizarea ansei, diluii succesive), apoi se stabilete o metod de triere (screening).
Microorganismul este cultivat pe plci Petri pe medii de agar-agar. In cazul in care se urmrete
selectarea unor microorganisme productoare a unui anumit tip
de enzim se realizeaz se fac teste de identificare:
- calitative
- cantitative
De ex. Pt. a dezvolta anumite tipuri de enzime, prin includerea substratului specific pentru
enzima dorit:
- amidon/amilaze
- cazein/proteaze
- celuloz/celulaze
Enzimele difuzeaz n gelul de agar-agar.
Dac nu se poate aplica un test calitativ, coloniile izolate se cultiv pe medii specifice iar
extractul (lichidul) de biosintez este:
- prelevat
- prelucrat in scopul dozarii compusului prin metode:
spectrofotometrice
fluorimetrice
tritrimetrice
polarimetrice
In urma acestei etape se rein numai cteva tulpini care au dat cele mai bune rezultate.
b. ntreinerea culturilor productoare
Dup faza de izolare i selecie, tulpinile productoare se supun unor teste de caracterizare dup
criterii :
- morfologice
- biochimice
- fiziologice
1

- imunologice
- toxicologice
Tulpina astfel caracterizat se nregistreaz ntr-o colecie de microorganisme, sub un numr de
identificare.
Selecia unui mutant nalt productor prin ucrri de selecie:
- Natural
- Artificial (mutagenez)
Conservarea microorganismelor de interes, att tulpinile parentale, ct i tulpinile modificate
genetic (mutante sau recombinate) se face metode speciale, la temperaturi sczute:
- Liofilizarea
- Conservarea n azot lichid
Cultura stoc
- Cultura de la care se pornete procesul de biosintez
- Tulpinile din colecie utilizate n lucrrile de biosintez
- Metodele de ntreinere a culturilor sunt specifice fiecrui microorganism
- Condiii de pstrare
- La frigider
- Pe geloz nutritiv
- n tub nclinat
- punctul de plecare pentru prepararea unei culturi inocul de laborator
Cultura inocul
- constituie
- cultur microbian n curs de multiplicare
- materialul de nsmnare a mediului de biosintez n etapa urmtoare
- condiii de dezvoltare
- format pe un substrat nutritiv corespunztor
- pH
- Temperatur
- Agitare
- Aerare
- Transvazarea inoculului
- n mediul de biosintez
- Condiii aseptice
- Dup o perioad de dezvoltare bine stabilit i definit prin
- Vrst
- Cantitate
- Aspect microscopic
- Aparatur
- Plci Petri
- Tuburi test
- Flacoane Ehrlenmeyer
- Faza de laborator
Etapa a II-a
- Stabilirea parametrilor optimi de cultivare
- Mediul de cultur
- pH
- Temperatur
- Agitare
- Aerare
2

Aparatur
- Flacoane Ehrlenmeyer
- Agitatoare rotative
2. Faza de micropilot
- stabilirea condiiilor de cultivare
- pH
- temperatur
- consum de O dizolvat
- turaie
- debit de aer
- aparatur
- bioreactor de laborator - 10 L
3. Faza de staie pilot
- A - stabilirea parametrilor
- de cultur
- biosintez
- aparatur
- instalaii de capacitate medie
- bioreactoare 100 1000 L
- B - stabilirea condiiilor de lucru la nivel semiindustrial
- aparatur
- bioreactoare 5000 10.000 L
- sterilizarea
- precede operaiile de nsmnare vitamina C
- aparaturii
- mediului
- mediul de cultur
- sterilizat
- rcit la temperatura optim de cultivare
- cultur intermediar
- treapt intermediar de cultivare
- apare atunci cnd raportul de inoculare
- cantitatea de inocul/cantitatea de mediu de fermentaie
- nu permite pregtirea culturii inocul n laborator
- moduri de cultivare
- A - culturi de suprafa
- B - submers
- mediu lichid
- agitat
- aerat
- adoptat
- n funcie de fiziologia productorului
- rentabilitate
4. Producia industrial
- iniial - faz experimental industrial
- apoi obinerea industrial a medicamentelor
- bioreactoare 10.000 100.000 L

Cultivarea microorganismelor n instalaii industriale specializate, performante determin

asigurarea de condiii optime de:
Cretere
Dezvoltare
Biosintez a metaboliilor dorii
Acumularea preferenial a unui anumit metabolit necesit creterea i dezvoltarea
microorganismelor:
Condus
Reglat
2. Tipuri de bioprocese;
-

condiiile proceselor de biosintez pot fi

- oxibiotice (aerobe)
- anoxibiotice (anaerobe) fermentative
termenul de fermentaie s-a extins i la procesele oxibiotice
procesele de biosintez bioproces
criterii de clasificare a bioproceselor
- felul culturii
- de suprafa
- submers
- tipul de operare
- omogen/ heterogen
- discontinuu/continuu
- modul de transformare al componentelor nutritive ale mediului
- simple
- simultane
- consecutive

Bioprocese n culturi de suprafa

- suport
- solid
- semisolid
- culturi solide: microorganismele se dezvolt
- pe suprafaa
- n interiorul mediului
- culturi semisolide - microorganismele se dezvolt n toat masa mediului
Bioprocese n culturi submerse
Instalaii pentru
asigurarea amestecrii perfecte a componentelor mediului de biosintez:
- solide
- lichide
- gazoase
alimentarea adecvat cu aer
- aparatur de msur i control
Utilaje speciale bioreactoare
4

Avantaje
- se preteaz la automatizri
- economie de spaiu
- o bun amestecare i aerare a mediului - condiii optime pentru microorganisme
- randamente ridicate
cel mai utilizat pentru
- aminoacizi
- proteine
- enzime
sisteme industriale
- discontinui (arje)
- continui
- productivitate mare
- aparte de capaciti mici pstreaz mai bine parametrii optimi

tipul de operare
- sistemele omogene
- compoziia mediului este uniform pe tot parcursul bioprocesului
- sistem este monofazic
- microorganismele sistemului au aceeai stare fiziologic (stadiu de dezvoltare)
- sistemele heterogene
- compoziia mediului de fermentaie are gradiente de celule sau de substrat
- sisteme
- monofazice
- multifazice (lichid/lichid; lichid/gaz)
- microorganismele
- expuse la diferite condiii de mediu
- diferite stri fiziologice (diferite stadii de dezvoltare)
tipul de operare
- bioprocese nchise
- celulele microbiene meninute n totalitate n sistem
- nu pot atinge o stare staionar
- bioprocese deschise
- celulele trec continuu n efluent
- celulele prsesc sistemul n rata n care se formeaz
- rezult c se gsesc n stare staionar
tipul de operare
- sistem continuu de operare
- deschis
- omogen
- cu un stadiu
- cu mai multe stadii
- heterogen
- cu un stadiu
- cu mai multe stadii
- mixt
5

nchis
- omogen
- heterogen
- mixt

modul de transformare al componentelor nutritive ale mediului

- procese simple
- componentele nutritive se transform stoechiometric n produse de reacie
- fr acumulare de intermediari n mediu
- procese simultane
- componentele nutritive se transform n diferite proporii stoechiometrice
- fr acumulare de intermediari n mediu
- procese consecutive
- componentele nutritive se transform cu acumulare de intermediari
- procese desfurate n etape
- componentele nutritive se transform n intermediari i apoi n produi de reacie
3. Microorganisme utilizate n biotehnologiile de tip fermentativ;
Microorganisme utilizate n biotehnologie
- microorganismele
- diversitate
- morfologic
- activitate biologic
- poziie sistematic
- caractere comune
- dimensiuni microscopice
- organizare micelar (n general)
- structur intern relativ simpl
- grup format din
- bacterii
- drojdii
- fungi
- alge microscopice
- protozoare
Bacteriile
-

organizare celular
- de tip procariot
- unicelular
perete celular rigid
- ac. mureinic
- ac. teichoic
- ac. diaminopimelic
multiplicare prin diviziune direct
mare variabilitate explicat prin fenomene
- de recombinri genetice
- mutaii

Levurile (drojdiile)
-

fungi microscopici
unicelulari
organizare celular de tip eucariot
dimensiuni mari
aspect
- monoforme
- sferice
- ovale
- alungite
- dimorfe
- polimorfe
perete celular
- gros
- format din
- polizaharide
- glucani
- manani
nucleu
- bine definit
- nconjurat de o membran nuclear tipic
reproducerea
- asexuat
- nmugurire
- diviziune
- sexuat
- prin conjugarea a dou celule sexuale
puine ca numr (350 de specii)
importante datorit numeroaselor utilizri practice, industriale
Fungii filamentoi

microorganisme eucariote
metabolism de tip chimioorganotrof
corp hife - miceliu
- filamente
- tubulare
- microscopice
- lungi
- subiri
perete celular
- semirigid
- chitin asociat cu celuloz
reproducerea
- spori asexuai
- formai prin derivare din celule vegetative
- sporangiospori
- conidiospori
- spori sexuai

rezultai din ncruciarea ntre 2 celule polarizate sexual

ascospori

4. Metabolisme ale microorganismelor folosite n biotehnologii farmaceutice;

Metabolismul microbian=totalitatea reaciilor biologice implicate n activitatea biologic prin
intermediul crora energia, elementele de mediu nutritiv sunt utilizate pentru biosinteze,
cretere i alte activiti celulare;
Ci metabolice
- catabolism
- reacii exergonice (elibereaz energie)
- furnizeaz energie - ATP
- anabolism
- reacii endergonice (consum de energie)
- sintez de noi constitueni prin folosirea energiei stocate din primul proces
Bioelemente
- majore
- concentraii mari
- 104 M
- C, O, H, N, S, P, K, Mg, Ca
- Minore
- Cantiti foarte mici
- Zn, Mn, Mo, Co, Cu, W
Tipuri de metabolism dup natura sursei de energie
- Microorganisme fototrofe energia radiant
- Microorganisme chimiotrofe energia din reacii chimice oxidative la ntuneric
Capacitatea de a biosintetiza metabolii eseniali
- Autotrofe
- Au capacitatea de a sintetiza toi constituenii celulari
- pornind de la surse anorganice simple
- de C CO2,
- de azot - NH3
- Heterotrofe
- incapabile de a sintetiza metaboliii eseniali
- necesar adugarea lor n mediu ca
- substane organice
- anorganice
- necesar
- o surs de C
- hidrai de C
- acizi organici
- o surs de N
- aminoacizi
- proteine
- sruri anorganice de amoniu
- biotehnologie heterotrofe
- factori de cretere
- Andr Lwoff
- Substane necesare pentru dezvoltarea microorganismelor
8

substane pe care un organism este incapabil s le sintetizeze

n absena crora multiplicarea este imposibil
- aminoacizi naturali care intr n compoziia proteinelor
- bazele purinice
- bazele pirimidinice
- vitaminele hidrosolubile B

METABOLISMUL ENERGETIC LA MICROORGANISME

Energia obinut din reaciile metabolismului energetic este necesar activitii biologice :
- Transport prin membrane
- Respiraie
- Biosintez
Energia microorganismelor heterotrofe provine din degradarea unor substane organice
adugate n mediul de cultur ca surs de carbon.
3 faze de eliberare a energiei n procesul de catabolism:
- macromoleculele organice sunt descompuse la unitile lor cu eliberarea a 1% din
energia nglobat
- proteinele aminoacizi
- grsimile glicerol i ac. grai
- glucidele monozaharide
- moleculele rezultate din prima faz sunt degradate pn la produi mai mici + CO2
+ H2O cu eliberarea a 1/3 din energia lor total
- intermediari ai cilor metabolice
- a 3-a faz este diferit pentru diferitele tipuri de microorganisme:
a. microorganisme care pot descompune integral substanele nutritive pn la CO2 i H2O pe
calea acizilor tricarboxilici
b. microorganisme care realizeaz numai o descompunere parial a substratului nutritiv cu
formare de produi intermediari servind ca acceptori, donori de electroni- se obin astfel diveri
produi (fermentaie)
Compuii glucidici reprezint sursa cea mai cunoscut de energie
- degradare pe calea Ebden-Meyerhof-Parnas cu
- formarea a 2 molecule de ac. piruvic
- eliberarea a 2 molecule de ATP
- ac. piruvic
- transformat n acetil-coenzim care intr n ciclul lui Krebs
- se elibereaz 4 perechi de electroni care pot intra n lanul respirator
Bacterii lanul respirator este asociat cu
membrana plasmatic
mezozomi
eucariote sediul respiraiei n mitocondrii, energia
nmagazinat n ATP
folosit la nevoie

n funcie de acceptorul final de electroni

oxigenul respiraia aerob (oxibiotic)
un compus organic respiraia anaerob (anoxibiotic)
fermentaia compuii organici funcioneaz ca donor i acceptor e
n funcie de comportarea fa de Oxigenul molecular

10

microorganisme strict (obligatoriu) aerobe

oxigenul este acceptor final de H
au nevoie permanent de oxigenul atmosferic
dispun de citocromi
enzime
peroxidaze
catalaz
superoxid dismuataza
microorganisme strict (obligatoriu) anaerobe
nu se pot dezvolta n prezena oxigenului molecular
nu au echipamentul enzimatic al celor aerobe
microorganisme aerobe facultativ anaerobe
cele mai numeroase
i orienteaz metabolismul spre respiraie (fermentaie) n funcie de
prezena (absena) Oxigenului
microorganisme microaerofile
au nevoie de o cantitate de Oxigen mai mic dect din aerul atmosferic
metaboliii formai produii obinui prin biosintez
metabolii primari
formai n faza de cretere exponenial
rezultat al metabolismului oxidativ (fermentativ)
alcooli primari (simpli)
acizi
aldehide
CO2
H
CH4
Metabolii secundari
Substane chimice complexe
La nceputul fazei staionare de cretere
Uneori produse n cantiti foarte mari
Nu au funcie metabolic evident
Antibiotice
Enzime
Vitamine
Sintetizai
pe seama constituenilor cu mas molecular mic
pentru a ndeprta din mediu compuii mici care le-ar periclita viaa
Datorai
existenei unor inductori
epuizrii unor represori

5. Medii de cultur;
Medii de cultur

Suporturi nutritive sterilizate

Permit dezvoltarea unui microorganism n afara niei sale ecologice naturale
Importante pentru
Reproductibilitate
Eficien

Criterii de clasificare
Consistena
Lichide
Solide
Semisolide
Compoziie
1.Naturale
Contin elemente nutritive de origine:
Vegetale
Animale
Pot conine
Subproduse agroalimentare
- rot de floarea soarelui
- Fin de porumb
- Tre de gru
- Extract de porumb
Completate cu mici cantiti de sruri minerale
Avantaje
Mai ieftine
Dezavantaje
Nu permite
- Standardizarea
- Reproducerea procesului cu un randament constant
2.Sintetice
Reproductibile la scar industrial
Numai compui
cu structur chimic cunoscut
care pot fi dozai
Dupa tipul de respiraie al microorganismelor
aerobe
anaerobe
Dupa scopul i frecvena
de uz curent
medii speciale pentru studiile de izolare la nivel de laborator
elective
selective
de mbogire
11

 de conservare
de identificare
Dupa faza de biosintez la care este folosit
laborator
pilot
industrial
Dupa destinaia final
pentru cultura inocul
cultura de regim (medii de fermentaie, de biosintez)
Trebuie s conin
surs de carbon - carbohidrai
sursa principal de energie
regleaz necesarul de O i H
glucoz
amidon
fructoz
zaharoz
surs de azot
organic
aminoacizi
proteine
uree
anorganic
amoniac
sulfat de amoniu
surs de fosfor
acid fosforic
fosfat de amoniu
fosfat acid de potasiu
oligoelemente
potasiu
clorur de potasiu
fosfat acid de potasiu
magneziu
sulfat de magneziu
fier
clorur feric
factori de cretere
aminoacizi
proteine
vitamine
coenzime
precursori
poriuni structurale ale moleculei produsului biosintetizat
sursa de carbon
Exist o valoare a concentraiei elementelor necesare dezvoltrii nerestrictive
definit de Peppler, Harrison, 1970

12

6. Dinamica multiplicrii bacteriilor;

Comun 6+7
Creterea i multiplicarea microorganismelor
Procesul de cretere se desfoar prin sinteza specific echilibrat a constituenilor celulari
pornind de la substane nutritive simple aflate n mediu, controlat genetic si depinde de
substane nutritive
natura
concentraia
asigurarea cu energie
mrirea volumului celular prin
sinteza de substane organice
mrirea coninutului n ap
creterea se ntrerupe la momentul producerii diviziunii celulare
raport ntre volumul celulei/suprafaa celulei
suprafaa crete cu o raie ptratic
volumul crete cu o raie cubic
raportul atinge un punct critic diviziunea celular
multiplicarea celulelor
pluricelulare mrirea taliei individului
unicelulare creterea numrului de indivizi
viteza de multiplicare
durata unei generaii 2030 min.
tipic pentru fiecare specie
variaz n funcie de condiiile de mediu
Dinamica multiplicrii bacteriilor
procesul multiplicrii populaiei bacteriene cuprinde mai multe faze
1.faza de laten (lag)
ntre
momentul introducerii germenului n mediul de cultur (inoculare)
momentul n care celulele acestuia ncep s se multiplice
nr. bacteriilor din inocul
rmn neschimbate
scad temporar
cultura nu este vizibil la microscop
bacteriile acumuleaz n celul
metabolii eseniali
sisteme enzimatice necesare creterii
perioad de adaptare la noile condiii de cultivare (de via)
mediu nutritiv
temperatur
pH
aeraie
timp
cteva ore
mai scurt cu ct noul mediu este mai apropiat de cel vechi
13

transvazarea inoculului
prima situaie
inoculul provine dintr-o cultur aflat n curs de multiplicare
mediu nutritiv cu aceeai compoziie
i pstreaz ritmul rapid de dezvoltare
cazul
transvazrii inoculului n intermediar
pentru obinerea unor cantiti mai mari de inocul
a doua situaie
inoculul provine dintr-o cultur aflat n curs de multiplicare
mediu nutritiv cu alt compoziie
perioad de adaptare
cretere neevident de la nceput
2.faza de multiplicare exponenial (cretere logaritmic)
precedat de o perioad scurt (cca. 2h)
accelerare a ritmului de cretere
multiplicarea se produce cu o vitez progresiv mrit
diviziunile sunt sincronizate
nr. celulelor
se dubleaz brusc
la intervale de timp regulate
progresie geometric
cretere exponenial
scurt timp 2-3 ore
tendina de multiplicare rapid scade progresiv
epuizarea substanelor nutritive
acumularea de produse de catabolism cu efect inhibitor
celulele de tip embrionar
dimensiuni mai mari
citoplasma
mai omogen
nu conine materiale de rezerv
afinitate pentru coloranii bazici
coninut ridicat de ARN
cele mai potrivite pentru lucrri de genetic
perioada de post-lag
spre sfritul fazei de multiplicare logaritmic
ncetinirea
desincronizarea creterii populaiei
acum sunt amorsate biosintezele n culturi continui
3.faza staionar maxim
numrul celulelor viabile
maxim
rmne constant (ore cteva zile)
nsoit de
epuizarea substanelor nutritive
acumularea unor produi toxici
celulele nu se mai multiplic
14

4.faza de declin
scderea progresiv a numrului celulelor viabile
celule
btrne
cu fenomene de involuie
n unele cazuri fenomene de autoliz
Metode de apreciere a creterii unui microorganism
determinarea substanelor uscate a masei celulare
determinarea concentraiei sursei de carbon din mediu
determinarea nr. total de celule, cu ajutorul celulelor de numrat
determinarea gradului de turbiditate a suspensiei bacteriene n funcie de timp
7. Dinamica multiplicrii la fungi;

cresc sub form de colonii

miceliu 10-15 m
se poate pleca de la
inocul de spori
fragment micelian
mai multe faze
1.faza iniial de lag
cteva ore
germinarea sporilor (inoculare cu suspensie de spori)
regenerarea hifelor rupte i lezate (inocul vegetativ)

2.faza de cretere liniar

Daca in faza de lag nu se observa nimic pe mediul de cultura, in faza de cretere liniar:
pe suprafaa mediului apare o colonie circular
crete liniar cu timpul
forma unei reele fine de hife
3.faza de nvechire
ncetinirea vitezei de cretere, datorita efectului duntor al produilor de
metabolism
mai repede n cazul mediilor mai bogate n substane nutritive
8. Influena factorilor de mediu asupra creterii microorganismelor - Influena concentraiei
substratului;
Influena factorilor de mediu asupra creterii microorganismelor
factori de mediu
conc. substratului
calitatea i cantitatea inoculului
temperatura
pH-ul mediului de biosintez
agitarea
concentraia oxigenului dizolvat
15

Influena concentraiei substratului asupra cineticii dezvoltrii microbiene

Mrirea conc. de substrat din mediu determin creterea nr. celule microbiene pn la o
limit
Fenomen subordonat aciunii inhibitorilor
Inhibitorii acioneaz prin:
Modificarea potenialului chimic al
Substratului
Intermediarilor metabolici
Produsului finit
Modificarea permeabilitii peretelui celular cu reducerea transportului substanelor
nutritive
Modificarea activitii enzimelor metabolice
Disocierea agregatelor metabolice
Modificarea parametrilor funcionali:
Capacitatea de reproducere
Mobilitatea
Biosinteza unor metabolii
Mecanismele inhibiiei
Reacie chimic cu una sau mai multe componente celulare
Adsorbia (complexarea) de enzime (coenzime)
Intervenia n secvene ale reaciilor biochimice
Intervenia n disocierea complexelor enzimatice
Modificarea parametrilor fizico-chimici ai mediului de biosintez:
pH
trie ionic
constanta dielectric
capacitatea de solvatare
intervenia n funciile celulare de control
concentraia optim de substrat n momentul iniial i pe parcurs
concentraia inhibitoare a glucozei 10-15%, dulcea, siropuri
9. Influena factorilor de mediu asupra creterii microorganismelor - dimensiunilor
inoculului;
Influena dimensiunilor inoculului asupra proceselor biotehnologice
calitatea i cantitatea inoculului
cantitate mare
declanarea unei rapide dezvoltri
reducerea riscului de contaminare
3-10% din volumul total al culturii
raport optim de inoculare
definirea strii fiziologice
vrst
aspect microscopic
efectele mrimii i vrstei inoculului
bacterii
Mrimea inocului influeneaz stadiile ulterioare ale culturii
16

inocul mare se micoreaz faza de lag

datorit formrii i acumulrii unor metabolii intermediari eseniali - difuzeaz
rapid
cantitate prea mare
autoinhibiie
datorat sensibilitii celulelor bacteriene fa de unii produi metabolici
intermediari
cantitate prea mic
faza de lag poate fi prelungit la infinit
dezvoltare anormal a microorganismului
iniierea dezvoltrii unui inocul
concentraie critic de metale grele
Bacillus subtilis Mn
levuri
mrimea inocului influeneaz faza de lag i stadiile ulterioare ale culturii
fungii
necesar standardizarea inoculului vegetativ pentru acest grup de microorganisme
inocul sub form de suspensie de spori ritm rapid de dezvoltare
autoinhibiie (autostimulare) a germinrii sporilor substane produse n
timpul germinrii
fazele ulterioare
cantitatea inoculului influeneaz
miceliul
mrime
form
randamentul n metabolii
raportul de inoculare judicios
dezvoltarea masei miceliene
consum mare de carbohidrai
cultur ineficient
10. Influena factorilor de mediu asupra creterii microorganismelor - temperaturii;
Efectele temperaturii asupra creterii microorganismelor
diferena ntre temperatura mediului nconjurtor i din interiorul celulei nul
variaiile temperaturii
randamentul de transformare a substratului
cerinele nutritive
compoziia biomasei
viteza de cretere microbian
domeniul de temperatur n care ating viteza maxim de cretere
criofile (10C)
mezofile
microorganisme industriale
25 30C
termofile
mecanismul de aciune afecteaz
procesele metabolice
compoziia biomasei n
proteine
17

lipide
ARN

11. Influena factorilor de mediu asupra creterii microorganismelor - pH-ului;

Efectele pH-ului asupra creterii microorganismelor
Cteva direcii de influenare
Domeniul optim de pH:
Drojdii 4-5 ---- 2; 8.
Valori mici ale pH (3-4) risc sczut de contaminare
Efectul pH asupra randamentului de conversie a substratului
Domeniu foarte strict de pH
Ac. Citric
1,7-2
< ------ ac. citric
> ------ ac. oxalic, gluconic
deviaii ale pH de la valoarea optim
efecte nedorite
datorate
consumarea unui nutrient
producerea unui acid de ctre microorganism
corectarea abaterii
adugarea unor substane chimice
pH sub cel optim
NaOH
KOH
Amoniac gazos
Amoniac soluie
Ioni de Na, K
pH peste cel optim
HCl
Ac. sulfuric
Ac. azotic
ion Clorur
sruri greu solubile
corecia poate determina coroziune
pH-ul determin efecte de disociere a acizilor i bazelor
acioneaz la nivelul suprafeelor celulei
modific proprietile
de aderare la diverse materiale
de floculare
12. Influena factorilor de mediu asupra creterii microorganismelor - concentraia de oxigen
dizolvat;
culturile aerobe
oxigenul necesar-oarecare exces
transferul de oxigen din faza gazoas n faza lichid are loc cu viteze mari
n biosinteza n laborator (baloane agitate) aeraia depinde de
18

 viteza de rotaie (translaie) a agitatorului

mrimea baloanelor
volumul de mediu de cultur din balon
creterea turbulenei prin icane
eficiena aerrii concentraia de oxigen dizolvat determinat prin
metode sulfit-msurarea vitezei maxime de transfer a oxigenului din aer n
mediu
metoda polarografic -determinarea concentraiei oxigenului dizolvat n
mediu
utilizarea electrodului cu membran
msurarea oxigenului dizolvat
determinarea raiei consumului de oxigen
folosirea analizorului paramagnetice de oxigen
analizeaz i compar compoziia aerului
ce iese din bioreactor
ce intr n bioreactor
conducerea unui proces
cunoaterea
modului de variaie n timp a necesarului de oxigen
rata consumului de oxigen
sporete rapid la o valoare maxim din primele stadii
este momentul atingerii concentraiilor ridicate de
celule
apoi scade
necesarul de oxigen mediul de biosintez utilizat
Penicillium oxigen dublu glucoz (zaharoz simplu)
Factori care influeneaz transferul de oxigen:
Agenii tensioactivi micoreaz coeficientul de transfer
Concentraia de microorganisme
concentraii mari vscozitatea crete eficiena sistemului de
aerare scade
Sistemul de agitare agitare eficient dispersie bun a bulelor
Echipament de aerare conducte perforate bioreactoare de volum mare
Suprapresiunea favorizeaz mrirea conc. de oxigen 0,5 1 atm.
Micoreaz riscul de infecie
13. Prelucrarea mediilor de biosintez generaliti;
nainte de a fi purificate, substanele organice obinute pe cale biotehnologic sunt izolate din
lichidul de cultur (dac sunt extracelulare) sau din biomas (dac sunt intracelulare) ntr-o
form parial purificat aplicnd metode de separare general valabile pentru toate produsele de
biosintez.
Prelucrarea primar a mediilor de biosintez cuprinde o serie de operaii cum ar fi:
filtrarea, centrifugarea, decantarea, concentrarea fazei lichide, dezagregarea celulelor,
extracia, uscarea, atomizarea, precum i procese mai specifice de tipul precipitrii cu solveni
sau cu sruri anorganice, purificrii i concentrrii prin ultrafiltrare.
Echipamentele industriale implicate sunt complexe i specifice. Schema de flux variaz de la un
preparat la altul, n funcie de tehnologie.
19

Separarea produselor din lichidul rezultat din fermentaie, constituie o problem dificil,
indiferent de procedeul aplicat. Dificultile provin din faptul c produsele biologic active
obinute n general prin biosintez sunt substane termolabile, ceea ce impune evitarea
degradrii sau modificrii chimice a acestora. Pentru a alege cea mai adecvat metod de
separare a produselor biosintetizate, este necesar s se cunoasc proprietile fizico chimice a
acestora i anume:
Solubilitatea :
o n ap sau n soluii diluate de sruri ;
o n solveni polari (metanol, etanol, aceton) ;
o n solveni slab polari (cloroform, hidrocarburi) ;
Stabilitatea n soluie :
o n funcie de pH ;
o efectul temperaturii ;
o efectul soluiilor tampon ;
o efectul solvenilor organici ;
Stabilitatea n stare solid n funcie de temperatur precum i efectul umiditii asupra
produsului ;
Proprieti fizice :
o dializabilitate prin membrane ;
o adsorbia pe suprafee solide ;
o migrarea n cmp electric ;
o sedimentarea n ultracentrifuge ;
Proprieti chimice :
o stabilitatea fa de diverse enzime ;
o stabilitatea la aciunea unor ageni chimici.
Pentru separarea produsului din mediile de biosintez se aplic n general urmtoarele metode:
extracia cu solveni organici; separarea pe schimbtori de ioni; cromatografie; adsorbia.
In industria de biosintez exist ns metode de prelucrare integral a mediului de
cultur prin aplicarea diferitelor metode de uscare, produsul rezultat fiind utilizat ca atare.
Acest mod de prelucrare a mediilor de biosintez este mult aplicat n tehnologia aditivilor
furajeri (coninnd aminoacizi, enzime, vitamine).
Prelucrarea primar
Filtrarea
Centrifugarea
Decantarea
Concentrarea fazei lichide
Dezagregarea celulelor
Extracia
Uscarea
Atomizarea
Precipitarea
cu solveni organici
cu sruri anorganice
ultrafiltrare pentru
purificri
concentrri
echipamente complexe i specifice
dificulti ale separrii produselor din lichid
produse termolabile
20

dificulti eliminate prin cunoaterea proprietilor fizico-chimice ale produselor

solubilitatea n
ap (soluii diluate de sruri)
solveni polari (metanol, etanol, aceton)
solveni slab polari (cloroform, hidrocarburi)
stabilitatea n soluie n funcie de efectul
pH
temperatur
soluii tampon
solvenilor organici
stabilitatea n stare solid n funcie de temperatur i efectul umiditii
proprieti fizice
gradul de dializ
adsorbia pe substane solide
migrarea n cmp electric
sedimentarea n ultracentrifuge
proprieti chimice
stabilitatea fa de enzime
stabilitatea la aciunea unor ageni chimici
metode de separare din biomas
extracia cu solveni organici
separarea pe schimbtori de ioni
cromatografie
adsorbie
operaiile cele mai utilizate n biotehnologia medicamentelor
filtrarea
concentrarea
dezagregarea celular
atomizarea
14. Prelucrarea mediilor de biosintez filtrarea mediilor de biosintez;

21

probleme datorate
compoziia chimic a mediului
materialul biologic
adjuvani de filtrare
formeaz paturi microscopice cu micorarea dimensiunilor porilor
mresc vitezei de filtrare
reduc consumul de materiale
mai multe scheme
aplicarea pe materialul filtrant (pnz, hrtie) a unui strat subire de material
adjuvant
amestecarea adjuvantului cu suspensia de filtrat
raclarea permanent a stratului adjuvant cu ajutorul unor cuite pentru
meninerea stratului la o valoare constant (cazul filtrelor rotative)
se folosete foarte mult filtrarea sterilizant
prefiltrare grosier
apoi filtrarea sterilizant
filtre din

acetat de celuloz
azbest
polimeri sintetici

15. Prelucrarea mediilor de biosintez dezagregarea celulelor de microorganisme;

necesar pentru cazul n care substanele biologicactive sunt intracelulare

diverse procedee
fizice mecanice
mori coloidale
mori vibratoare
agent de rcire pentru meninerea sistemului la o anumit temperatur
fizice nemecanice
ngheare lent
oc osmotic
vibraii ultrasonice 20.000 Hz
chimice
pentru distrugerea componentelor lipoproteice din membrane se folosesc
detergeni cationici
detergeni aminici
solveni organici
preparate enzimatice
E. coli bacteriofagi
esut muscular enzime proteolitice
Drojdia de bere autoliz la 30C, 2-3 zile

16. Prelucrarea mediilor de biosintez concentrarea mediilor de biosintez;

Concentrarea mediilor de biosintez
Se are n vedere termolabilitatea produselor
Evaporarea n vacuum la temperaturi sczute (25-50C) liofilizare
Procedee de concentrare atermic
Ultrafiltrarea
Separarea pe baza diferenei de volum molecular cu ajutorul unei membrane
Avantaje
Concentrarea la temperaturi sczute
Micoreaz
fenomenele de autodigerare
pierderile n activitate prin denaturare termic
nu necesit modificri de faz (evaporri, condensri)
nu utilizeaz substane chimice
purific soluiile biologice prin ndeprtarea unor componente cu
volum molecular inferior
Osmoza invers

22

17. Prelucrarea mediilor de biosintez atomizarea;

Uscarea prin atomizare
Util pentru materialele care n faza iniial sunt lichide
Soluii
Suspensii

Paste subiri
Se realizeaz o cea de lichid din particule de 2 200 m
Uscare rapid nct materialul nu se nclzete
Se obine o pulbere nu este necesar mrunirea

ntr-o prim concluzie biotehnologiile farmaceutice industriale sunt alese i optimizate n

funcie de aceti doi mari factori, raportai la criteriul economic (preul de cost):
medii
solide
lichide
semisolide
culturi
de suprafa
submerse
procesele biotehnologice industriale
determin o dezvoltare
abundent
egal
agitare mecanic
aerare corespunztoare

23

18. Folosirea de tehnici de biosintez fermentativ la obinerea industrial a vitaminei C;

19. Descrierea fazelor de obinere industrial a vitaminei C;
20. Bazele biologice ale clonrii moleculare; etapele clonrii;
Bazele biologice ale clonrii moleculare
A clona nseamn a face copii identice; termenul desemna nainte numai procedura de
izolare a unei celule dintr-o populaie mai mare de celule, care apoi se multiplic pentru a genera
multe celule identice.
Prin analogie, clonarea ADN implic separarea unei gene specifice sau a unui segment de
ADN din cromozom, ataarea ei la o molecul mic de ADN numit purttor i apoi replicarea
acestui ADN modificat de mii sau milioane de ori. Rezultatul este o amplificare selectiv a acelei
gene sau a segmentului de ADN.
Ideea principal n clonarea molecular este de a insera un fragment de ADN care va
efectua n mod autonom reproducerea fragmentului de ADN inserat i care se va numi vehicul
sau vector de clonare. Clonarea unui asemenea vector himeric ntr-un organism gazd adecvat
cum ar fi bacteria Escherichia coli sau drojdii, are ca rezultat producerea unor cantiti mari din
segmentul de ADN care a fost inserat. Dac gena clonat este flancat, nsoit de secvene de
control bine precizate i specifice, atunci gazda poate produce cantiti mari de ARN mesager i
proteina specificat de acea gen.
Clonarea unui segment de ADN implic cinci etape i metode generale.
Prima etap presupune utilizarea unei metode de a tia ADN ntr-o poziie specific.
Cu ajutorul endonucleazelor de restrictie. Clivarea n locuri specifice a moleculei de ADN este
un proces extrem de important deoarece este necesar cel puin n dou faze ale clonrii
moleculare:
- pentru izolarea fragmentelor de ADN ce reprezint gene de interes (clivarea ADN
donor);
- pentru pregtirea vectorului de clonare pentru a primi gena de interes (ADN vector).
A doua etap presupune folosirea unei metode de a lega covalent dou fragmente de
ADN; aceasta este realizat de enzime numite ADN ligaze.
A treia etap presupune selecionarea unei molecule mici de ADN capabil de
autoreplicare (numit vector de clonare). Segmentul de ADN de clonat se leag de vectorul de
clonare rezultnd o molecul de ADN numit ADN recombinat, ce conine segmente de ADN
legate covalent provenind din diverse surse.

24

 A patra etap cuprinde o metod de a muta ADN recombinat din eprubet ntr-o celul
gazd care poate furniza complexul enzimatic necesar pentru replicarea ADN recombinat.
n a cincea etap se folosesc metode de a seleciona sau identifica celulele gazd ce
conin ADN recombinat din totalul de celule gazd.
Metodologiile folosite pentru a realiza aceste etape i altele similare sunt denumite
colectiv tehnologia ADN recombinat sau clonare molecular, clonarea genelor, clonarea
ADN.
21. Elementele constitutive ale tehnologiei ADN recombinat;
Tehnologia ADN recombinat se bazeaz, n principal, pe utilizarea unor elemente
descrise n paragrafele urmtoare.
I.

Un set de enzime care intervin n metabolismul acizilor nucleici, n general, i n mod

special n tehnologia ADN recombinat. n particular, dou tipuri de enzime sunt eseniale pentru
obinerea de ADN recombinat: endonucleaze de restricie i ADN ligaze.
II.

Vectorul de clonare (vehiculul) este o structur alctuit din ADN, care are poate fi

acceptat ntr-un organism gazd i care are capacitatea de a se replica autonom. Prin inseria
genelor de interes n vehicul, acesta realizeaz transferul genelor de la un organism la altul.
III.

Gena de interes reprezint un fragment de ADN ce cuprinde secvena de nucleotide

corespunztoare produsului polipeptidic a crui sintez se urmrete. Gena de interes, dup

inseria n vector, este clonat modat cu acesta.
IV.
Receptorul este reprezentat de regul de celule bacteriene care au rolul de a accepta ADN
recombinat, asigurnd exprimarea genelor respectiv sinteza unui produs specific, n cantiti
proporionale cu ritmul de diviziune a celulei.
22. Enzime folosite n tehnica ADN recombinat;
n tehnologia ADN recombinat un rol cu totul deosebit l are un set de enzime care au fcut
obiectul unor decenii de cercetare privind metabolismul acizilor nucleici.
n tabelul sunt prezentate enzimele care intervin n metabolismul acizilor nucleici i care
sunt adevrate instrumente de cercetare n acest domeniu.

25

Enzimele folosite n tehnologia ADN recombinat

Enzima
Endonucleaze de restricie de tip II

Funcia (Activitatea)
Scindeaz ADN n secvene ce conin

ADN-ligaze

baze specifice
Leag dou molecule de ADN sau

ADN-polimeraza I (E.coli)

dou fragmentede ADN

Folosete n procesul de replicare
semiconservativ a ADN

Revers transcriptaza
Polinucleotid kinaza

Face ADN copii pe matri de ARN

Fosforileaz unele lanuri

Transferaza terminal

polinucleotidice
Transfer un homopolimer la gruparea
3-OH final din structura duplexului

Exonucleaza III
Bacteriofag exonucleaza

liniar
Mut nucleotide reziduale din poziia
Mut nucleotide din poziia 5
terminal a ADN bicatenar elibernd

Fosfataza alcalin

catena la poziia 3 final

Mut fosfatul terminal din fiecare
capt 5 sau 3 terminal din amndou

Dintre enzimele prezentate n tabelul nr. 2.I., n mod particular, dou tipuri de enzime
stau la baza metodei generale de a izola i propaga o molecul de ADN recombinat.
n primul rnd, endonucleazele de restricie scindeaz (taie) molecula de ADN cnd
recunosc anumite secvene specifice pentru a genera un set de fragmente de ADN mai mici.
n al doilea rnd fragmentul de ADN de clonat este izolat i legat de alt fragment de ADN
care este vectorul de clonare folosindu-se ADN ligaze.
Vectorul recombinat este apoi introdus ntr-o celul gazd care l cloneaz pe msur ce
celula trece prin numeroase generaii de diviziune celular.

Endonucleazele de restricie
Clonarea unui anumit fragment de ADN presupune identificarea i obinerea sa n stare
pur din genomul unei celule. Aceast operaie este practicabil numai pentru genoamele de mici
26

dimensiuni. ADN donor al genei de interes ca i ADN vector, este clivat astfel nct s se poat
forma extremiti monocatenare omoloage, avnd posibilitatea de a realiza o sinaps molecular
Endonucleaze de restricie recunosc n molecula de ADN o secven anumit de baze i
cliveaz cte o legtur fosfat diesteric de pe ambele catene, ntr-un loc particular al secvenei
recunoscute. Endonucleazele de restricie se gsesc ntr-un numr mare de specii bacteriene.
Funcia biologic a endonucleazelor de restricie este de a recunoate i de a scinda un
ADN strin (de exemplu ADN al unui virus infectant); acest ADN se spune c este restrns.
ADN propriu al celulei nu este clivat n mod obinuit pentru c secvena recunoscut de
endonucleaza de restricie este metilat de o enzim, ADN metilaz specific, fiind astfel
protejat. n celula bacterian endonucleaza de restricie i ADN metilaza corespunztoare este
uneori asimilat cu sistemul de restricie modificare.
Exist trei tipuri de endonucleaze notat cu cifrele romane I, II i III.
Endonucleazele de restricie de tip I i III sunt n general complexe mari cu mai multe
subuniti coninnd ambele activiti: de endonucleaz i de metilaz.
Tipul I de endonucleaze de restricie scindeaz ADN n poziii aleatoare care pot fi la
distan de 1000 de perechi de baze sau mai mult, de la secvena de recunoatere.
Tipul III de endonucleaze de restricie scindeaz ADN la distan de 25 de perechi de
baze de la secvena de recunoatere.
Amndou tipurile se deplaseaz de-a lungul ADN printr-o reacie care necesit energie
din molecule de ATP .
Endonucleazele de restricie de tipul II izolate iniial de Hamilton Smith sunt mai simple,
nu au nevoie de ATP i scindeaz ADN chiar la nivelul ei de recunoatere.
Sunt deci enzime cu ajutorul crora se realizeaz scindarea exact n locuri bine definite
ale moleculelor de ADN bicatenare. Ele sunt instrumentele indispensabile att pentru excizarea
fragmentelor de ADN (gene) din diferite molecule de ADN viral, bacterian sau din celule
eucariote, ct i pentru conversia moleculelor circulare ale vectorilor n molecule liniare.
Unele endonucleaze de restricie scindeaz ambele catene de ADN, astfel nct nu rmne
nici o baze nepereche la fiecare capt ; aceste capete sunt numite capete rotunjite.
Alte endonucleaze de restricie scindeaz neregulat, decalat cele dou catene de ADN,
astfel nct rmn dou pn la patru nucleotide nemperecheate la fiecare capt al catenelor.
Acestea sunt numite capete coezive sau adezive (coninnd nucleotide complementare ) i deci se
pot mperechea ntre ele sau cu alte capete adezive complementare ale unor alte fragmente de
ADN.
27

Mrimea medie a fragmentelor de ADN produse prin clivarea ADN genomic cu

endonucleaze de restricie depinde de frecvena cu care apare un anumit situs de restricie ntr-o
molecul de ADN mai mare; aceast frecven depinde la rndul ei de mrimea secvenei de
recunoatere. Dac pe o molecul de ADN exist mai multe situsuri de recunoatere pentru o
restrictaz, aceasta va genera mai multe fragmente de ADN. Cu ct secvena recunoscut de
enzima de restricie este mai lung, cu att fragmentele de ADN obinute sunt mai lungi.
Dimensiunea medie a fragmentelor produse prin scindarea de ctre endonucleaze de
restricie a unui ADN mare poate fi mrit prin simpla mpiedicare a reaciei s fie complet. O
astfel de reacie incomplet este numit deseori digestie parial
Odat ce o molecul de ADN a fost tiat n fragmente, fragmentul specific c poate fi
separat de celelalte fragmente prin electroforez n gel de agaroz sau HPLC.
ADN ligazele
Dup izolarea fragmentului int de ADN, acesta este inserat ntr-un vehicul de clonare
folosind ADN ligazele.
Reacia de legare este mult facilitat de prezena capetelor adezive complementare care se
leag ntre ele. Eficiena procesului de legare este influenat de tipul endonucleazelor folosite
pentru a genera fragmente de ADN, deoarece endonucleaze diferite conduc la capete adezive
diferite.
nainte de legarea a dou fragmente de ADN este deseori util de a aduga la jonciune
secvena de recunoatere pentru o alt endonucleaz pentru a permite tierea ADN legat, n
acelai loc, mai trziu. Aceasta se face prin inserarea unui fragment ADN sintetic ce conine
secvena de recunoatere cerut ntre dou fragmente de ADN. Acest fragment de ADN sintetic
este numit n general linker. Un fragment sintetic ce conine secvena de recunoatere pentru mai
multe endonucleaze este numit polylinker.
Importana capetelor adezive n unirea eficace a dou fragmente de ADN n maniera dorita a
fost pus n eviden de la primele experimente fcute cu ADN recombinat. nainte ca
endonucleazele s fie accesibile pe scar larg, unii cercettori au descoperit c puteau genera
capete adezive prin aciunea combinat a unor exonucleaze din bacteriofagul i a unei
transferaze terminale. Fragmentelor de unire li se puneau cozi homopolimerice complementare.
Astfel de metode sau similare au fost utilizate n crearea primelor molecule de ADN recombinat
coninnd segmente de ADN provenite de la specii diferite.

28

23. Vectori de clonare utilizai n tehnica ADN recombinat;

Vectorul de clonare (vehiculul) reprezint un element extracromozomial capabil s se
multiplice i s exprime o gen strin ataat de el in vitro, independent de cromozomul celulei
gazd.
Operaia prin care o plasmid (sau un bacteriofag) este convertit ntr-un vector de
clonare genic se numete construcia vectorului. Vectorul trebuie a posede o serie de proprieti
eseniale de care se ine seama n alegerea i construcia lui:

capacitatea de a se replica rapid i ntr-un numr ct mai mare de copii n celula gazd
(30 50 copii/celul);

dimensiune ct mai redus (pentru a facilita ptrunderea n celula gazd);

capacitate ct mai ridicat de acceptare (vehiculare) a unei gene strine;

s nu conin n structura sa gene generatoare de efecte nedorite (de exemplu, gene

inductoare de tumori);

s posede cel puin un marker genic (de exemplu, gena rezistenei la anumite
antibiotice) care s permit selecia celulelor ce conin ADN recombinat;

s prezinte n structura sa un numr limitat de locuri de clivare pentru enzimele de

restricie;

s conin elemente de reglaj ale unui operon procariot tipic, inclusiv o mic poriune
dintr-o gen structural aparinnd operonului respectiv.

n tehnologia ADN recombinat se folosesc mai multe tipuri de vectori de clonare:

plasmide, bacteriofagi, cosmide, i chiar cromozomi.
24. Plasmidele ca vector de clonare;
Plasmidele sunt molecule de ADN circulare ce se replic independent de cromozomul
gazdei. Plasmidele bacteriene naturale variaz n mrime de la 5000 la 400000 perechi de baze.
Plasmidele pot fi introduse n celulele bacteriene printr-un proces numit transformare.
Pentru ca celulele bacteriene s primeasc ADN strin (gena de interes), ele sunt incubate
mpreun cu ADN la 0C ntr-o soluie de clorur de calciu i sunt apoi supuse la un oc termic
trecndu-le rapid la o temperatur cuprins ntre 37-43 C. Se pare c ionii de calciu mresc
permeabilitatea celular.

29

Celulele astfel tratate devin apte de a accepta ADN strin (gena de interes). n
continuare este necesar o metod de a seleciona moleculele care au acceptat ADN al plasmidei
pentru c numai o mic parte din celule se transform [50, 51, 61].
Plasmidele sunt vectori frecvent utilizai n tehnologiile ADN recombinat deoarece
prezint urmtoarele avantaje:

se izoleaz uor i rezist la manipulri;

traverseaz uor prin membrana celulei gazd, avnd dimensiuni relativ reduse;

se replic autonom i rapid, independent de cromozom, ceea ce permite amplificarea

genei (fragmentul de ADN inclus):

prezint gene marker care, exprimate fenotipic, le confer caracteristici ce permit

selecionarea celulelor transformate (cel mai adesea gene de rezisten la antibiotice).

Strategia uzual pentru construirea unei plasmide este de a introduce n plasmid o gen
de care celula gazd are nevoie pentru a se dezvolta n anumite condiii specifice. Dac celulele
sunt crescute n acele condiii, celulele transformate sunt selectate; plasmida astfel construit
este selectabil. Gena introdus, numit uneori marker de selecie este de obicei una ce
confer rezistena la un antibiotic. Astfel, numai cele cteva celule transformate de plasmida
recombinat vor fi rezistente i vor crete deci in prezena antibioticului.
Muli vectori de clonare plasmidici au fost creai prin modificarea unor plasmide naturale.
Plasmidele uzual utilizate pentru clonare au fost modificate n laborator i conin n genele de
rezisten la antibiotice situsuri recunoscute de unele enzime de restricie.
Plasmida pBR322
Cteva din proprietile importante ale unui vector de clonare sunt ilustrate de plasmida
pBR322.
Plasmida cuprinde:
regiunea ori, adic originea replicrii care este necesar pentru a propaga plasmida i
a o menine la un nivel de 10 pn la 20 de copii n fiecare celul;
dou gene ce confer rezisten la diverse antibiotice permind selecionarea
celulelor care conin plasmida sau o versiune recombinat a acesteia;
cteva secvene de recunoatere unice pentru diverse endonucleaze care furnizeaz
situsuri unde plasmida poate fi tiat i ADN strin inserat.

30

Deci plasmida pBR322 conine doi markeri de selecie, gena de rezisten la ampicilin i
gena de rezisten la tetraciclin. Inactivarea uneia dintre acestea, prin inseria unui ADN strin,
ofer posibilitatea unei excelente selecii a celulelor transformate coninnd molecula de ADN
recombinat. n gena de rezisten la ampicilin exist un loc specific de clivare pentru enzima de
restricie Pst I, care poate fi utilizat pentru inseria genelor strine, nsoit de inactivarea acestei
gene. Similar, n gena de rezisten la tetraciclin se poate aciona prin intermediul enzimelor de
restricie Bam HI sau Sal I, pentru a realiza inactivarea inserional (figura nr. 2.4) [50, 74, 96].
Vectorul plasmidei pBR 322 are o mas molecular mic, mrimea total destul de mic
faciliteaz intrarea plasmidei n celule. Eficacitatea transformrii bacteriene descrete pe msur
ce crete mrimea plasmidei, i este dificil de clonat segmente de ADN mai lungi de 15000
perechi de baze atunci cnd se folosesc ca vectori plasmide.
25. Vectori de clonare de natur viral;
Bacteriofagul este un vehicul de clonare care poate fi folosit pantru a clona molecule de
ADN care au mrimi mai mari de 16 000 perechi de baze. A fost numit i bacteriofagul gt (gt =
generalized transduction) .
Acesta are un mecanism foarte eficace pentru a introduce ntr-o bacterie cele 48 500
perechi de baze (48,5 kb) ale ADN propriu. Mecanismul general de clonare de ADN n
bacteriofagul este bazat pe dou proprieti cheie ale genomului :
- n jur de o treime din genomul este neesenial i deci poate fi nlocuit cu ADN strin;
- ADN strin (gena de interes) va fi mpachetat (nserat) n particulele infecioase
numai dac mrimea lui este cuprins ntre 40 000 50 000 de perechi de baze
Au fost dezvoltai vectori bacteriofagi care pot fi uor clivai n trei fragmente, dintre care
dou conin gene eseniale i care mpreun sunt lungi de aproximativ 30 000 perechi de baze.
ADN adiional (gena de interes) trebuie deci s fie inserat ntre ele pentru a produce particule
viabile. Astfel, vectorii permit clonarea de fragmente de ADN de pn la 23000 perechi de
baze. Prin construirea acestor vectori se asigur faptul c toate particulele viabile vor
conine fragmentul de ADN strin.
Odat ce fragmentele de bacteriofag sunt legate de fragmentul de ADN strin de
mrime potrivit, ADN recombinat rezultat poate fi mpachetat n particule de fagi prin
adugarea lor ntr-un extract de celule bacteriene ce conin toate proteinele necesare pentru
31

asamblarea unui fag complet. Acest proces este denumit mpachetare in vitro. Pregtit astfel
vectorul bacteriofag e gata pentru a insera ADN recombinat n Escherichia coli.
Bacteriofagul filamentos M13 RF
Acesta are un ADN circular monocatenar care este aezat ntr-un buzunar al unui helix al
proteinei format din 2700 aminoacizi. Inseria de ADN strin ntr-o zon neesenial a
cromozomului M13 duce la producerea de particule mai lungi ale fagului.
Vectorii de clonare de tip baceriofag M13 nu pot menine n mod stabil nseriile de ADN cu o
mrime mai mare de 1000 de perechi de baze (1kb). Aceti vectori produc direct ADN
monocatenar cu 300 de nucleotide.
26. Cosmidele i cromozomii artificiali de drojdie ca vectori de clonare;
Cosmidele sunt construcii artificiale rezultate din asamblarea unor plasmide de
dimensiuni mari cu unele secvene de ADN din bacteriofagul . Cosmidele sunt deci plasmide
recombinate care combin trsturi utile ale plasmidelor i ale bacteriofagului . Ele sunt
proiectate pentru a permite clonarea unor fragmente de ADN foarte mari (pn la 45.000 perechi
de baze).
Cosmidele sunt molecule de ADN circulare mici (5000 7000 perechi de baze).
Ele conin mai multe secvene importante:
un fragment numit origine plasmidic de replicare (ori)
unul sau mai muli markeri de selecie
cteva situsuri de restricie specifice unde ADN strin (gena de interes) poate fi
inserat
un situs numit cos (o secven de ADN, din bacteriofagul necesar pentru
mpachetare).
Cosmidele nu conin alte gene i pot fi propagate n Escherichia coli ca i plasmidele.
Cnd un fragment mare de ADN strin este clonat pe ele, transformarea bacteriei E. coli cu
aceste construcii de ADN recombinat devine dificil tiind c transformarea este introducerea
plasmidei n celule bacteriene.
Cnd cosmida conine destul ADN inserat pentru a fi npachetat ntr-un fag, sistemele de
mpachetare in vitro permit bacteriofagului s fie vehicul eficace pentru introducerea ADN al
cosmidei n celula bacterian. n interiorul celulei bacteriene, cosmida se propag din nou ca o
plasmid deoarece nu are genele necesare pentru nmulirea particulelor n celule.
Cromozomii artificiali de drojdie ca vectori de clonare

32

Segmentele de ADN care sunt mai mari dect acelea care pot fi vehiculate de cosmide pot
fi clonate n cromozomi artificiali de drojdie (de exemplu cele notate cu YACS).
YACS sunt segmente liniare de ADN care conin toate fragmentele moleculare necesare
procesului de dedublare n drojdie: o origine de dedublare (copiere) cunoscut sub denumirea de
secven de dedublare n mod autonom (ARS = autonomously replicating sequence), un
centromer (segmentul cromozomal ataat de fus n cursul procesului de mitoz i meioz) i
telomeri (terminaiile cromozomilor liniari care permit dedublarea lor).
Moleculele de ADN cu mai multe sute de perechi de baze au fost mbinate cap la cap n
YACS i au putut fi clonate cu mult succes
27. Gena de interes n clonarea molecular;
Gena de interes, deci fragmentul specific de ADN care prezint interes din punctul de
vedere al proteinei specifice pe care o codific, reprezint componenta cheie n tehnologia
clonrii genelor, n tehnologia ADN recombinat.
Genele eucariote au n general o structur complex, iar localizarea lor nu n toate
cazurile cunoscut. Exist totui numeroase strategii pentru obinerea genelor de interes.
Sinteza chimic a genelor
Sinteza chimic a genelor const n oninerea unor fragmente de gene module
constituite din 12-16 nucleotide care apoi sunt legate ntre ele enzimatic, cu ajutorul ADN.
Aceast metod permite sinteza oricrei gene pentru care se cunoate structura.
Determinarea structurii genelor se realizeaz fie direct, prin analiza secvenei bazelor
azotate, fie indirect pe baza echivalenei secvenei aminoacizilor din protein, cu cea a bazelor
azotate din gena corespunztoare, conform codului genetic.
Procedeul indirect a permis stabilirea structurii genelor unor biocompui de mare
importan pentru industria farmaceutic, cum sunt de exemplu somatostatina i insulina uman.
Sunt cunoscute n prezent mai multe metode de sintez chimic a genelor:

metoda fosfodiesterelor,

metoda fosfotriesterilor,

sintez pe suport solid.

Este de menionat c modalitatea de sintetizare chimic de ADN de interes este posibil doar
pentru clonarea genelor care codific proteine mici.

33

Aceast cale de sintez a ADN permite alegerea, ori de cte ori exist mai muli triplei
(codoni) disponibili pentru un anumit aminoacid, a tripletului care e folosit foarte frecvent n
gazda care urmeaz s fie utilizat pentru sinteza proteinei de interes [61, 74].
Izolarea unei gene din cromozomul celular
O gen reprezint o parte foarte mic dintr-un cromozom. De aceea, izolarea unui
fragment de ADN care s conin o gen particular, necesit de regul parcurgerea a dou etape:
construirea unei biblioteci genomice (de ADN) care conine mai multe mii de
fragmente de ADN derivate dintr-un cromozom celular.
identificarea fragmentului de ADN care conine gena de interes folosind proprietatea
care l distinge de toate celelalte fragmente: secvena sa nucleotidic.
28. Receptori gazd pentru clonarea ADN recombinat;
Escherichia coli
Bacteria Escherichia coli a fost primul organism folosit pentru recombinarea ADN i este
nc celula gazd cea mai rspndit.
Prezint o serie de avantaje:
-

metabolismul moleculei de ADN propriu este bine cunoscut;

exist muli vectori de clonare naturali bacteriofagi sau plasmide asociate cu E. coli care
sunt bine cunoscute;

exist tehnici eficiente pentru transferul ADN de la o celul bacterian la alta.

Drojdia Saccharomyces cerevisiae
Printre eucariote, drojdiile sunt organisme foarte potrivite pentru manipulri de inginerie
genetic.
Dintre avantajele pe care le prezint utilizarea drojdiei Saccharomyces cerevisiae ca

gazd pentru clonare se pot enumera:

genomul ei este bine cunoscut, conine numai 14 milioane de perechi de baze;
genomul ei conine de 4 ori mai multe perechi de baze dect E. coli;
este un microorganism uor de meninut i de crescut pe scar larg n laborator.
Obstacolul major pentru clonarea n drojdie a fost prezena unui perete celular dur care
ngreuneaz introducerea unui ADN strin.

34

Aceast problem a fost rezolvat prin metode care cupleaz o degradare enzimatic
parial a peretelui celular cu un tratament cu calciu-polietilen glicol care face peretele celular
suficient de poros pentru ptrunderea ADN.
29. Etapele tehnologiei ADN recombinat;
Tehnologia ADN recombinat implic parcurgerea urmtoarelor etape eseniale:
I.

Obinerea in vitro a unei plasmide himerice

Aceast etap presupune utilizarea unor metode specifice de pregtire att a vectorului
ct i a genei de interes n vederea inserrii genei n vehicul.
Vectorul de clonare este izolat prin metode specifice i apoi clivat ntr-un singur loc cu o
enzim de restricie (aceeai endonucleaz folosit la izolarea genei). Clivarea produce
deschiderea vectorului (plasmidei) care este transformat dintr-o molecul circular ntr-o
molecul linear, avnd dou capete ce pot interaciona cu gena.
Gena de interes este izolat cu ajutorul enzimelor de restricie sau sintetizat prin una din
metodele descrise mai sus.
Vectorul i gena astfel pregtite se asociaz spontam in vitro pe baza complementaritii
capetelor coezive.
Prin intervenia unei ADN ligaze se restabilete continuitatea structural covalent prin
formarea de legturi fosfodiesterice ntre fragmentele de ADN.
Rezultatul este obinerea unei plasmide himere, o structur circular bicatenar n care
este inserat gena de interes.
Eficiena cuplrii genei de vector poate fi mrit prin modificri structurale ale vectorului
i/sau genei, ca de exemplu: defosforilarea vectorului, sinteza de capete coezive pe plasmid
i pe fragmentul ADN de inserat, ataarea de linkeri.
II.

Ptrunderea vectorului n celula gazd

Aceast etap const n introducerea ADN recombinat n celula gazd, urmat de

exprimarea lui independent de cromozomul celular. Procesul poart numele de transformare,
atunci cnd vectorul utilizat este o plasmid.
Problema ptrunderii vectorului este n general rezolvat prin permeabilizarea artificial
a membranei celulei receptoare.
35

n cazul utilizrii E. coli, cultivarea n prezen de CaCl2 precum i ocul termic de scurt
durat (30 secunde la 42C) determin celulele s intre ntr-o stare de competen care
permite acceptarea moleculelor de ADN strin.
n cazul celulelor care posed un perete celular este necesar ca acesta s fie nlturat cu
enzime litice. O alt posibilitate este utilizarea de lipozomi n care se ncorporeaz ADN
strin.
Eficiena transformrii este limitat, ntruct un numr redus de celule devin competente.
III.

Selecia clonei de interes

Exist mai multe metode pentru identificarea coloniei (clonei) de celule care a acceptat
vectorul himeric n urma experienei de transformare.
Una dintre acestea const n utilizarea plasmidelor purttoare de gene care confer
rezisten la antibiotice i a bacteriilor gazd sensibile la antibiotice.
De exemplu, se poate utiliza plasmida coninnd gene pentru rezisten la ampicilin (AR)
i la tetraciclin (TR) cu situsul de restricie aflat n interiorul genei TR.
Dup transformare, cultivnd bacteriile pe un mediu cu ampicilin, vor crete numai
bacteriile care au acceptat plasmida. Cultivarea mai departe a acestor colonii pe un mediu
coninnd tetraciclin va mpiedica creterea celulelor coninnd fragmentul de ADN strin a
crui inserare la nivelul genei TR din plasmid inactiveaz aceast gen.
Prin recuperarea coloniilor sensibile la tetraciclin se constituie o banc.
Etapa urmtoare const n selecionarea dintre diferitele colonii ale bncii a celei care
poart gena de interes. Pentru aceasta exist metode variate.
Astfel, dac gena de interes se exprim n mod normal n celula gazd, se pot utiliza
celule deficiente pentru aceast gen i identifica celulele care redobndesc acest funcie prin
introducerea genei lips. Dac gena nu exist n mod natural n celula gazd, prezena ei poate
fi reperat prin sinteza produsului specific de activitate a genei.
Multe metode sunt ns bazate pe utilizarea sondelor moleculare, ca de exemplu ARNm
codat de gena de interes, marcat radioactiv. Coloniile coninnd segmente de ADN
neidentificate sunt transferate pe filtre speciale (nitroceluloz) care au proprietatea de a fixa
ADN. Celulele sunt lizate in situ, ADN denaturat i filtrele sunt plasate n contact cu o soluie
coninnd ARNm. Dac o colonie conine plasmide asociate genei corespunztoare, ARNm se
36

ataeaz de ADN genei i colonia astfel marcat este vizualizat prin autoradiografie (tehnica
hibridizrii acizilor nucleici).
Alte metode sunt bazate pe selecia genei de clonat nainte de asocierera acesteia cu vehiculul.
30. Obinerea insulinei prin ADN recombinat construit din genele sintetizate chimic;
Pentru catena A a insulinei sunt necesare 63 de nucleotide nlnuite n mod
specific, iar pentru catena B de 90 de nucleotide cuplate (catena A are 21 aminoacizi x
3 nucleotide/aminoacid = 63, catena B 30 aminoacizi x 3nucleotide/aminoacid = 90
nucleotide).
Proiectul a mai prevzut ataarea la capetele lor a unor nucleotide care s
asigure:
cuplarea corect a genelor de vector - adugarea a 12 nucleotide, dintre care
6 asigur jumtate din situsul enzimei de restricie EcoRI, iar celelalte 6 nucleotide
jumtate din situsul enzimei de restricie BamHI.
prezena semnalelor necesare pentru pornirea i oprirea exact a transcrierii
genelor - pornirea este realizat de codonul ATG plasat la nceputul genei ntre situsul
enzimei EcoRI i gena structural; oprirea transcrierii este asigurat de doi codoni
(TAA i TAG) plasai ntre captul genei structurale i situsul enzimei de restricie
BamHI.
Gena A a fost obinut din 12 oligodeoxinucleotide sintetizate chimic prin
metoda fosfotriesterilor, iar gena B a fost obinut din 18 oligodeoxinucleotide diferite
sintetizate prin aceeai metod chimic.
Cele dou gene corespunztoare catenelor A i B ale insulinei mature au fost
apoi inserate independent pe cte un vector de clonare genetic prevzut cu elementele
de control ale operonului lac.
Moleculele de ADN recombinat rezultate au fost utilizate pentru transformarea
celulelor de E. coli. n celulele transformate ADN recombinat se replic.
Sub controlul elementelor de reglaj ale operonului lac se sintetizeaz complexul
-galactozidaza-catena A a insulinei n celulele transformate cu ADN recombinat
coninnd gena A i complexul -galactozidaza-catena B n celulele transformate cu
ADN recombinat coninnd gena B a insulinei.

37

n final, cele dou catene ale insulinei sunt detaate de -galactozidaza cu

ajutorul unui reactiv chimic (BrCN) care acioneaz asupra metioninei situat exact la
locul de jonciune dintre cele dou componente.
Dup purificare, cele dou catene se amestec i, prin simpla oxidare cu aer, ele
se cupleaz prin legturi disulfurice, dnd natere insulinei, care este identic att
structural ct i funcional cu insulina uman.
31. Obinerea insulinei prin ADN recombinat coninnd gena pentru proinsulin;
Acest procedeu are la baz construirea unor plasmide care s conin
secvenele (genele) care codific proinsulina sub forma ADNcomplementar. Acest
ADNc se poate sintetiza in vitro din ARNm pentru proinsulin izolat din celulele beta
din insulele Langerhans ale pancreasului.
ARNm se izoleaz din aceste celule, se purific prin cromatografie pe oligodT-celuloz i este apoi utilizat la sinteza de ADNc cu ajutorul reverstranscriptazei. La
nceputul lanului de ADNc se ataeaz codonul ATG (sintetizat chimic) corespunztor
metioninei. n acest fel are loc marcarea pentru ADNc i se asigur i delimitarea
galactozidazei de proinsulin, ceea ce uureaz procesul de purificare a proinsulinei
prin tratarea cu BrCN.
ADNc astfel pregtit este apoi cuplat cu vectorul plasmidial prevzut cu
elementele de control ale operonului lac coninnd o mic parte din gena structural a
galactozidazei.
ADN recombinat rezultat este utilizat pentru transformarea bacteriilor E. coli.
Celulele transformate produc o protein compus din -galactozidaz i proinsulin.
Aceasta, tratat cu BrCN, elibereaz proinsulina, care apoi este convertit n insulina
matur pe cale enzimatic.
Avantajele insulinei umane obinut prin ADN recombinat fa de insulina
izolat din pancreasul animal sunt:
nu induce afeciuni oculare (retinopatie) i renale (nefropatie),
nu provoac alergii (fa de 5% alergii la insulina animal),
are un grad nalt de puritate, se poate obine n orice cantitate,
producia nu este dependent de abatoare, care sunt aprovizionate
discontinuu, iar

38

 testele clinice au stabilit c insulina uman obinut prin inginerie genetic

este mai activ dect insulina uman.
32. Formulri farmaceutice ale insulinei umane recombinate; preparate farmaceutice cu
insulin i aciune rapid, intermediar sau prelungit;
Formulri ale insulinei sub form de preparate solubile cu aciune rapid
Molecula de insulin are o sarcin negativ net la pH neutru.
Aceast sarcin negativ net a insulinei a fost folosit la dezvoltarea
formulrilor farmaceutice.
La nceput produsele cu insulin solubil au fost formulate n condiii soluii de
pH acid instabile (proces de dezamidare considerabil la nivelul asparaginazei din
poziia 21 a lanul A pierderea activitii biologice pe parcursul unei conservri
prelungite n condiii de pH acid).
Pentru a ameliora stabilitatea chimic - conceperea soluiilor neutre, stabilizate
cu zinc prin folosirea capacitii sale de a se autoasocia uor sub form de dimeri sau
sub form de stri cu un ordin mai mare de autoasociere.
De altfel din punct de vedere fiziologic, insulina este stocat n celulele
beta ale pancreasului sub forma unor hexameri care conin zinc. Ca urmare n
formulrile simple (normale) neutre, insulina este stabilizat chimic prin
adugarea de zinc (~0,4%) i conservani fenolici. Zincul duce la formarea unor
structuri hexamerice distincte (care conin doi atomi de Zn/hexamer) i poate
cupla 6 molecule de conservani fenolici.
Preparatele cu insulin din comer conin i excipieni fenolici (fenol, m-cresol)
ca ageni antimicrobieni. Aceste specii fenolice se cupleaz la locurile specifice de pe
hexamerii Zn-insulinei, producnd o modificare conformaional care mrete
stabilitatea chimic a insulinei n preparatele comerciale (starea R6).
Formulrile moderne ale insulinei mai pot conine
un agent pentru izotonicitate (glicerol sau NaCl) pentru a reduce lezarea
esutului i durerea la injectare i
un tampon fiziologic (fosfat de sodiu) pentru a mpiedica deplasarea pH-ului
n cazul unor formulri sensibile la pH.
Formulrile normale (simple) neutre numite Insulina Regular prezint o
activitate maxim a insulinei dup 2-3 ore, cu o durat maxim de 6-8 ore.
39

Ca i n cazul altor formulri, variaiile intervenite n relaia timp-aciune pot fi

atribuite factorilor urmtori: doza, locul injectrii, temperatura i activitatea fizic a
pacientului.
n pofida strii solubile a insulinei, n aceste formulri s-a observat o ntrziere a
declanrii aciunii. - a fost atribuit timpului necesar hexamerului pentru a disocia n
dimeri i/sau monomeri naintea absorbiei prin membrane biologice.
Au fost elaborai analogi monomerici pentru evitarea proprietii de
autoasociere a insulinei - analog monomeric, prin schimbarea poziiilor ntre ele a
lizinei (Lys 28) i prolinei (Pro 29) din lanul B al insulinei umane = Insulina lispro
care prezint un profil mai rapid al relaiei aciune-timp, avnd o activitate maxim
dup aproximativ o or datorit posibilitii reduse de autoasociere, comparativ cu
insulina uman.
Insulina lispro poate fi stabilizat n cadrul unui complex hexameric dependent
de un conservant care asigur stabilitatea chimic i fizic necesar tuturor
preparatelor de insulin pstrndu-i profilul su rapid aciune-timp.
n afara formulrilor rapide menionate mai nainte, fabricanii au conceput
formulri solubile care s fie utilizate n pompe externe sau implantate. n majoritatea
privinelor, aceste formulri sunt foarte asemntoare cu insulina regular (simpl sau
normal n cea ce privete starea de asociere hexameric, conservantul i zincul); cu
toate acestea n formulrile respective pot fi inclui: ageni de tamponare i/sau
surfactani pentru a reduce agregarea fizic a insulinei care poate determina astuparea
tubului pompei.
Formulri farmaceutice ale insulinei cu aciune intermediar
Insulin NPH i Insulin lente. Ambele formulri permit obinerea unor
profiluri prelungite privind relaia timp-aciune prin faptul c necesit dizolvarea unei
forme precipitate i/sau cristaline a insulinei, etap care limiteaz viteza de
biodisponibilitate a insulinelor cu aciune intermediar i lung.
Insulin NPH.
Iniialele NPH se refer la "Neutral Protamine Hagedorn", nume care vine de la
inventatorul - H.C. Hagedorn. Este o suspensie cristalin neutr care este preparat
prin co-cristalizarea insulinei cu protamina. Protamina - grup de proteine cu caracter
bazic puternic, grup de substane strns nrudite care sunt obinute din sperma de pete.
n general, protamina este caracterizat printr-un numr de aproximativ 30 aminoacizi,
40

dintre care arginina este n proporie de 65-70%. Momentul n care, dup cristalizare,
n soluie nu mai exist protamin sau insulin msurabil este denumit ca fiind
punctul de isophane. De aceea Insulina NPH se mai numete Insulina "Isophane".
Insulina NPH are o declanare a aciunii cuprins ntre 1-2 ore, o activitate
maxim cuprins ntre 6-12 ore i o durat a activitii de 18-24 ore.
Ca i n cazul altor formulri, variaiile observate la relaia timp-aciune sunt
datorate unor factori cum ar fi: doza, locul injectrii, temperatura i activitatea fizic a
pacientului.
Insulina NPH poate fi amestecat uor cu Insulina regular fie ex tempore, de
ctre pacient, fie n formulri preamestecate. Insulina preamestecat, de exemplu
NPH/Regular n raportul 70/30 sau 50/50, ofer pacientului o ameliorare a exactitii
la dozare i, n consecin, o ameliorare a controlului glicemiei.
Au fost soluionate i controversele privind imunogenitatea la protamin prin
folosirea de Insulin Lente sau Insulina Ultralente.
Insulina Lente este o suspensie de zinc-insulin care a fost conceput
pentru o singur injecie zilnic. Ea este un amestec constituit din dou forme
insolubile de insulin, 70% cristale romboedrice de zinc-insulin (componenta
ultralente) i 30% particule de insulin amorf (componenta semilente). Formularea
aceasta este un preparat neutru care conine tampon pe baz de acetat i un exces de
zinc care se leag la suprafaa hexamerului insulinei, reducnd astfel solubilitatea
insulinei i, n felul acesta, se produce o ncetinire a profilului timp-aciune.
Insulina Lente are o declanare a aciunii dup 1-3 ore, activitatea maxim este
ntre 6-12 ore i durata aciunii revine la 18-24 ore. Ca i n cazul altor formulri,
variaiile observate n ceea ce privete profilul timp-aciune sunt datorate unor factori
cum ar fi: doza, locul injectrii, temperatura i activitatea fizic a pacientului.
Capacitatea de amestecare a Insulinei Lente cu Insulina Regular este limitat la
amestecurile ex tempore care sunt utilizate imediat dup preparare din cauza
precipitrii insulinei din produsul Regular datorat probabil cuplrii surplusului de
zinc aflat n preparatul Lente la suprafaa structurii pe hexamerice a insulinei solubile.
Formulri farmaceutice ale insulinei cu aciune prelungit
n mod curent singura insulin cu aciune prelungit disponibil este insulina
Ultralente, care este o suspensie de insulin cristalizat. Formularea conine un agent
de tamponare cu valoare neutr a pH-ului i un surplus de zinc.
41

Insulina Ultralente are o declanare a aciunii la 4-6 ore, o activitate maxim

cuprins ntre 8-20 ore i o durat aciunii situat ntre 24-28 ore. Ca i celelalte
formulri, variaiile profilului timp-aciune sunt datorate unor factori cum ar fi: doza,
locul injectrii, temperatura, activitatea fizic a pacientului. Amestecarea preparatului
de insulin Ultralente cu insulina Regular este limitat la amestecarea ex tempore i
utilizarea imediat.

33. Dezvoltarea unui nou medicament (etapele parcurse i rezultatele studiilor de cercetaredezvoltare);
34. Autorizarea i nregistrarea unui medicament;
35. Staia pilot n industria farmaceutic: definire, roluri, structur, amplasare, studii pilot;
36. Personalul i tehnologia de fabricaie ca element al asigurrii calitii medicamentului
industrial;
37. Materialele i echipamentul de producie ca element al asigurrii calitii
medicamentului industrial;
38. Calificarea echipamentelor;
39. Validarea procedeelor de fabricaie;
40. ntreprinderea: caracteristici generale, clasificare, resurse, amplasare, ciclu de via;
41. Planul de dezvoltare i afacere, concurena, cooperarea, criza i evaluarea
ntreprinderilor;
42. Calitatea farmaceutic i principii generale ale regulilor de bun practic de fabricaie;
43. Rolul sistemului de asigurarea calitii;
44. Responsabiliti specifice directorului de producie i directorului de asigurarea calitii;
45. Responsabiliti comune ale directorului de producie i directorului de asigurarea
calitii;
46. Instruirea personalului implicat n procesul de fabricaie;
47. Evaluri care preced alegerea spaiului pentru construcia unei faciliti de producie;
48. Responsabiliti specifice ale personalului implicat n studiile clinice;
49. Principii generale de proiectare a calitii;
50. Descrierea principiilor evalurii bazate pe ntrebri;
51. Aliaje i metale utilizate la construcia utilajelor folosite n industria farmaceutic;
Generaliti;
52. Fonta ca material de construcie a utilajelor folosite n industria farmaceutic;
53. Oelurile ca material de construcie a utilajelor folosite n industria farmaceutic;
54. Cuprul i aliajele sale, folosite ca material de construcie a utilajelor n industria
farmaceutic;
55. Aluminul ca material de construcie a utilajelor folosite n industria farmaceutic;
56. Emailurile folosite la construcia utilajelor n industria farmaceutic;
57. Tipuri de coroziune; generaliti;
58. Coroziunea chimic;
42

59. Coroziunea electrochimic;

60. Pasivitatea metalelor; inhibitori i pasivatori;
61. Mijloace de protecie mpotriva coroziunii.

43