CURS 5

Cap. 2.
Pregatirea probelor pentru analiza
2.1. Prelucrarea probelor pentru
determinarea compusilor organici
1. Introducere
2. Pregatirea probelor in vederea determinarii
compusilor semivolatili si nevolatili din probe
lichide
2.1. Extractia lichid-lichid

1
Extractia lichid-lichid
H+ OH-
(pH<pKa) pH>pKa
H+ + A- H+ + A-

HA HA HA
Extractie Re-extractie
Proba

Faza donoare Faza organica Faza acceptoare

2
Proceduri de extractie

3
 Solutiile apoase ale surfactanilor, la o
anumita temperatura, numita temperatura punctului de rou (cloud-point
temperature) pot forma sisteme bifazice. n timpul procesului de separare la
punctul de rou (tulbureal) apar agregate vezicule micelare care formeaza aa
numita faza bogat n surfactant. Aceasta faza nglobaza specii nepolare
(analitii nepolari), care se vor concentra.

Faza bogat n surfactani poate fi separat prin centrifugare.

Procesul de separare este reversibil, modificarea temperaturii sistemului

ducand la formarea unei faze omogene.

Temperatura la care are loc separarea fazelor depinde de:

tipul surfactantului
concentraia surfactantului,
cantitatea i tipul aditivilor organici/anorganici
presiune.

4
 Surfactant neionic.

Genopol X-080

Triton-100

Structura acestor entiti

micelare cu un miez nepolar
posed capacitatea de a
interaciona cu specii nepolare
prin interaciuni hidrofobe.
5
Extractia la punctul de roua
Diagrama de faze Genopol X-080
Adaos 5% NaCl
Concentratie Genapol (%)
Din aceast diagrm se
constat c prin
nclzirea soluiilor
surfactanilor neionici
deasupra temperaturii
punctului de rou
soluia micelar se
separ n dou faze.
De asemenea, se mai
constat c pentru
concentraii ntre 1% i
7,5% surfactant i un
adaus de 5% NaCl
TPR = 65oC,
* Pentru surfactanii
neionici adaosul de
sruri cauzeaza o
scadere TPR.
6
Extractia la punctul de roua
Un analit in forma ionica nu interacioneaz
cu agregatele micelare att de puternic ca i form neutr, extragandu-se in acest
caz o cantitate mai mic. Un pH acid favorizeaz extracia.
Soluiile apoase a unor surfactani zwitterionici prezint un comportament
asemanator, formand sisteme bifazice. Comportarea lor este diferit de aceea a
surfactanilor neionici, prezentand o alur invers a diagramei de faza.
Surfactani zwitterionici. C9-APSO4; APSO4

TPR rmne practic constant n

intervalul de pH 4-10, sub valoarea 4
scade dramatic.
Adaosul de sruri duce la cresterea
TPR.

Extracia la punctul de rou se

preteaz a fi util ca o tehnic de
preconcentrare pentru analiza
cromatografic. n plus, extracia
prin aceast tehnic permite
determinarea componenilor 7prin
RP-HPLC fr nici o purificare
prealabil.
Extractia la punctul de roua
Adaugare Adaugare
sare Proba
surfactant

Mentinere la
temperatura potrivita

Centrifugare

Decantare
supernatant

Faza bogata in Tratare faza

surfactant dilutie,
purificare

8
Injectie
cromatograf
Sisteme apoase bifazice
(ABS - Aqueous biphasic systems sau ATPS - aqueous two phase systems )

-Este o alternativa curata a extractiei lichid-lichid traditionale (SO-apa).

ABS este format din solutia apoasa a:

- 2 polimeri solubili in apa;
- un polimer si o sare cosmotropa;
- o sare cosmotropa si una caotropa.
Cele doua faze sunt amestecate fie la concentratii potrivite fie la o temperatura
specifica.
sarea cosmotropa favorizeaza interactiunile intre moleculele de apa si
stabilizeaza interactiunile intramoleculare in macromolecule (proteine). Ionii
acestor saruri prezinta densitate mare de sarcina (ex: SO42-; PO43-; Mg2+; Li+;
Zn2+; Al3+). Sarurile cosmotrope se utilizeaza pentru prevenirea agragarii
proteinelor in preparatele farmaceutice, si in diferitlele etape de extractie si
purificare a proteinelor. Actioneaza asupra stabitatii interactiunilor
intramoleculare a proteinelor native, scotand din competitie acele interactiuni
care duc la formarea agregatelor.
sare caotropa (ex: MgCl2, LiAc, LiClO4, etc) distruge structurarea, provoaca
denaturarea macromoleculelor (proteine, acizi nucleici). Sarurile caotrope
cresc entropia unui sistem influentand interactiunile intramoleculare prin 9
forte necovalente (punti de hidrogen, forte van de Waals).
Exemple de sisteme bifazice: Sisteme apoase bifazice
- solutie apoasa de agar solutie apoasa de amidon sau gelatina
-solutie apoasa de polietilenglicol (PEG) dextran
-solutie apoasa de polietilenglicol (PEG) solutie de fosfat, sulfat sau citrat
-solutie apoasa de polietilenglicol (PEG) solutie apoasa de Na2CO3

PEG Na2CO3 faza superioara este formata din PEG (hidrofob) avand o
densitate mai mica decat faza inferioara hidrofila. Desi, in mod normal, PEG este
mai dens decat apa, acesta ocupa partea superioara, probabil datorita
proprietatilor de ordonare a solventului, care exclud excesul de apa, generand un
mediu cu densitate mai mica.
Avantaje
-Tehnica de extractie a proteinelor, enzimelor si altor biomolecule labile;
-Datorita conditiilor blande un denatureaza si nu distrug biomoleculele labile;
-Stresul in interfata dintre cele doua faze este mult mai mic (400x) decat in cazul
sistemelor SO apa, distrugere a moleculelor extrase este mult redusa;
-Stratul de polimer stabilizeaza moleculele extrase favorizand preconcentrarea;
-Se pot dezvolta sisteme specifice diferitilor analiti prin optimizarea temperaturii,
gradului de polimerizare a PEG, selectarea tipului de sare si a concentratiei;
-Separarea fazelor si repartitia analitilor se realizeaza rapid;
10
Dezavantaje
- Cost ridicat al materialelor necesare puritate ridicata
Extractia lichid-lichid
r = m extrasa/m initiala = (m initiala m ramasa neextrasa)/m initiala

Aq C0aq,
Vaq

OS C1o, Vo
Aq C1aq, Vaq

C2o, Vo
C2aq, Vaq

OS Cno, Vo
Aq Cnaq, Vaq 11
 Continua
Secventiala

SO

Palnie de
separare

a
b
Dispozitiv extractie lichid-lichid continua 12
a) densitate solvent de extractie (>1)
b) densitate solvent de extractie (<1)
 se inchide robinetul
se introduce proba si solventul de extractie
se pune dopul
dop se rastoarna palnia fara scuturare si se deschide
robinetul pentru a se elibera excesul de presiune (atentie
la modul in care se tine palnia si la pozitia tijei)
se scutura usor palnia pentru cateva secunde, se
rastoarna si se ventileaza prin deschiderea robinetului
cand presiunea nu mai creste palnia se scutura viguros
pentru perioade mai lungi de timp, se ventileaza
robinet se pune palnia in suport, se scoate dopul si se lasa sa se
separe cale 2 faze
Palnie de cand fazele s-au separat complet, faza inferioara este
separare eliminata prin tija (deschiderea robinetului)
pozitia relativa a celor 2 faze depinde de densitate
Forma palnie nu se arunca nici un strat pana cand analitul nu este
sferica/globulara izolat
tip para dupa extractie faza ce contine analitul trebuie
cilindrica concentrata prin:
-evaporare la rotavapor sau utilizand dispozitive special
Agitare destinate (KudernaDanish); 13
manuala -trecerea unui curent de gaz inert.
mecanica
extractia lichid-lichid ridica probleme in cazul probelor: apa uzata, sange, urina
prin: -formarea unui strat intermediar intre cele doua faze nemiscibile
datorita impuritatilor insolubile
-formarea emulsiilor aceste probleme pot fi depasite prin:
- adaugare de saruri
ELL-continua - centrifugare
se aplica in cazul in care D este mic - racire/refrigerare
pentru ca se realizeaza extractii - extractie continua
multiple/ echilibre de repartitie
simultane
evitarea emulsiei (aducerea in
contact a celor 2 faze se realizeaza
prin dispersie fina si nu agitare)
suprafata de contact (transfer)
creste datorita dispersiei-eficienta
mare
dispozitive automatizate, eroarea
asociata prelucrarii probei este
redusa mult
aparatul poate realiza fie numai 14
extractia fie extractia si Dispozitiv ELL - continua
concentrarea