2D-DIGE CA STRATEGIE DE IDENTIFICARE A BIOMARKERILOR SERICI

LA PACIENII MEXICANI CU DIABET ZAHARAT DE TIP 2 CU UN INDICE

DE MAS CORPORAL DIFERIT

INTRODUCERE

Obezitatea i diabetul de tip 2 (T2D) sunt cele mai rspndite i grave boli metabolice care
afecteaz oamenii din ntreaga lume. Cu toate acestea, diferenele rasiale i etnice par a fi un factor de
risc pentru dezvoltarea lor. Mexic a fost numit printre cele mai mari populaii cu cea mai mare
prevalen a diabetului zaharat i a obezitii. Scopul acestui studiu a fost de a identifica noi proteine
asociate T2D la pacienii mexicani. Probele de snge au fost colectate de la 62 pacieni mexicani cu
T2D i au fost grupai n funcie de indicele de mas corporal (IMC). Un panou de 10 diabet i
markeri ai serului de obezitate a fost determinat utiliznd MAGPIX.

A fost efectuat un studiu comparativ al proteomicii utiliznd electroforeza in-gel diferenial

bidimensional (2D-DIGE) urmat de spectrometrie de mas (LC-MS / MS). Am detectat 113 pete
acumulate difereniat, n care au fost identificate 64 de proteine unice, proteine care au fost implicate n
cile de metabolizare, transportul molecular i semnalizarea celular. Patru proteine (14-3-3, ApoH,
ZAG i OTO3) care prezint variaii legate de diabet i, de asemenea, schimbri n legtur cu
obezitatea au fost selectate pentru validarea ulterioar prin Western blotting. Rezultatele relev noi
proteine asociate cu diabetul prezent n populaia mexican. Acestea ar putea oferi o perspectiv
suplimentar asupra nelegerii dezvoltrii diabetului n populaia mexican i pot fi, de asemenea,
biomarkeri candidai folositori.

REZULTATELE STUDIULUI

Pacienii cu diabet zaharat au fost grupai n funcie de indicele de mas corporal n patru
grupe: greutatea normal (NW), excesul de greutate (OW), obezitatea I (ObI) i obezitatea II i III
(ObII / III). De asemenea, a fost inclus un grup de control (Ctrl) de voluntari sntoi. Un panou de 10
biomarkeri de diabet pre-definit a fost msurat folosind tehnologia MAGPIX. Datele generate ne ofer
informaii mai valoroase despre condiiile de sntate ale grupului. Leptina i ghrelinul sunt hormoni
care au fost recunoscui ca avnd o influen major asupra echilibrului energetic.
Au fost msurate i alte molecule produse de esut adipos (adipokine) cum ar fi visfatin i rezistin,
legate de diabet i obezitate. Concentraiile de visfatin comparativ cu grupul Ctrl (882,5 pg / ml) au
crescut n raport cu gradul de obezitate (875 pn la 1798,8 pg / ml). Au fost detectate diferene ale
nivelurilor de rezisten, dar nu a existat o relaie clar ntre concentraia lor i gradul de obezitate,
nivelurile mai sczute dect grupul Ctrl au fost gsite n grupul ObI (1162,9 pg / ml) i cele mai nalte
niveluri au fost detectate n grupul ObII / III (1722,8 pg / ml). Inhibitorul activator de plasminogen 1
(PAI-1), un inhibitor important al sistemului fibrinolitic, care este de asemenea o adipokin, a prezentat
un nivel crescut fa de gradul de obezitate de la 8591,6 pg / ml n grupul Ctrl la 12323,1 pg / ml n
ObII / III.

Metoda 2D-Difference Gel Electrophoresis(2D-DIGE)

Eantioanele etichetate au fost utilizate pentru rehidratarea n gel peste noapte la temperatura
camerei utiliznd 24 cm Immobiline DryStrips cu pH 4-7 (ReadyStrip IPG Strip, Bio-Rad) pentru
probele LAP. Fraciunile HAP au fost prelucrate n benzi de gradient liniar de 13 cm n acelai interval
de pH (GE Healthcare). Fiile rehidratate au fost focalizate utiliznd un dispozitiv Ettan IPGphor (GE
Healthcare). n urma focalizrii izoelectrice, fiecare band a fost echilibrat cu un tampon de
echilibrare reductoare timp de 15 min urmat de echilibrarea cu tampon de alchilare timp de 15 min.
Fiile au fost apoi plasate pe vrful gelurilor SDS-PAGE 12% i sigilate cu o soluie de sigilare cu
agaroz. Separarea proteinei n cea de-a doua dimensiune a fost efectuat ntr-un rezervor de
electroforez Ettan Dalt-six (GE-Healthcare) ntr-un gel SDS-poliacrilamid 12%. Gelurile rezultate au
fost scanate utiliznd un sistem Pharos FX (Bio-Rad) la o rezoluie de 100 pm.

DISCUII

Leptina acioneaz ca parte a unei ci de semnalizare care regleaz dimensiunea depozitului de

grsime corporal, acionnd direct sau indirect asupra sistemului nervos central pentru a inhiba aportul
alimentar i / sau pentru a reglementa consumul de energie28. Prin contrast, concentraiile ghrelinului
sunt corelate negativ cu IMC la om i rezistena la insulin29, nivelurile crescute de leptin observate i
scderea nivelurilor de ghrelin pot fi asociate cu depozitele de mas de grsime din grupurile obeze.

Rapoartele au indicat c insulina ar putea induce secreia de leptin i evenimentul de producie,

dei grsimea corporal este factorul determinant al leptinei care circul. S-a raportat, de asemenea, c
nivelurile de ghrelin au crescut, de asemenea, atunci cnd oamenii obezi pierd o greutate corporal i
scad n greutate. Cu toate acestea, mai multe studii la om au artat rezultate contradictorii. Nu numai
mrimea i frecvena meselor au un efect asupra nivelurilor de leptin i ghrelin circulante, dar i
compoziia unei mese este un factor determinant al nivelurilor de leptin i ghrelin la oameni

In acest studiu, s-a prezentat rezultatul etapelor de descoperire i calificare n descoperirea

biomarkerilor i raportul unui total de 113 de pete proteice acumulate difereniat n ser din pacienii
mexicani cu diabet zaharat comparativ cu grupul de control. Schimbrile n abundena acestor proteine
au fost analizate n raport cu IMC i 64 de proteine unice au fost identificate cu succes de MS / MS.
Proteinele identificate au fost clasificate n funcie de procesul lor biologic, prezentnd o distribuie
similar cu cele biomarkere raportate anterior pentru ser i alte biofluide de la pacieni diabetici , cu
excepia proceselor metabolice, care sunt suprareprezentate n studiul prezent. Cnd se compar cele 64
de proteine identificate cu listele HDPP, este important de menionat c n cazul pacienilor mexicani
au fost detectate 37 de proteine deja raportate n populaia european, ceea ce arat validarea studiului
nostru, dar i faptul c aceste proteine nu au nici o legtur cu etnia. Cu toate acestea, 27 de proteine
identificate n aceast lucrare nu au fost raportate anterior i este interesant c majoritatea acestor
proteine aparin procesului metabolic, care poate fi legat de fondul genetic, fiind etnicitate important
n dezvoltarea bolii. Patru dintre aceste proteine (14-3-3, OTP3, ApoH i ZAG) care prezint o tendin
clar legat de boal au fost selectate pentru validare ulterioar.
 CONCLUZII

In concluzie, unele dintre proteinele raportate aici au fost anterior legate de diabet zaharat, dar
aceasta este prima data cand au fost identificate la pacientii mexicani folosind instrumente proteomica.
Rezultatele studiului, ca parte a fazei de descoperire n dezvoltarea biomarkerilor, reprezint punctul de
plecare pentru etapa urmtoare, faza de validare. n cadrul lucrrilor de validare, va fi necesar o
analiz suplimentar ntr-o populaie mai mare pentru a discrimina acele proteine care ar putea fi legate
de ali factori, cum ar fi vrsta, sexul i fundalul genetic. Cu toate acestea, proteinele detectate aici i
care nu sunt incluse n listele HDPP sunt deosebit de importante deoarece ofer noi perspective asupra
dezvoltrii bolii i pot aciona ca biomarkeri proteici specifici pentru populaia mexican, care ar putea
fi legai de predispoziia etnic i ar putea ajuta la dezvoltarea de noi terapii sau instrumente de
diagnostic mai bune.