UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN

VETERINAR BUCURETI

COALA DOCTORAL A FACULTII DE HORTICULTUR

TEZ DE DOCTORAT

Titlul: Obinerea de biosurfactani i

utilizarea lor n protecia mediului i a
culturilor horticole

(REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT)

Conductor tiinific:
Prof. univ.Dr. CMPEANU GHEORGHE

Doctorand:
OLTEANU VIOLETA

BUCURETI
2011
Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului i a culturilor horticole

REZUMATUL
tezei de doctorat cu titlul:

Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului

i a culturilor horticole

Lucrarea se bazeaz pe rezultatele obinute n cadrul stagiului de pregtire a tezei de doctorat

n perioada 2006-2010 i abordeaz o problem de actualitate, i anume obinerea de biosurfactani
de la specii bacteriene izolate din medii contaminate cu hidrocarburi i evidenierea posibilelor
aplicaii ale tulpinilor productoare de biosufactani n protecia culturilor horticole i bioremediere.
Coninutul tezei e structurat n dou pri extinse n ase capitole: Consideraii teoretice asupra
obinerii de biosurfactani i rolul lor n protecia plantelor i n bioremediere, Cercetri proprii
privind izolarea din medii poluate, caracterizarea i identificarea unor noi tulpini bacteriene din
genul Bacillus, Cercetri proprii privind testarea activitii antifungice a tulpinilor bacteriene
selectate, Cercetri proprii privind producerea de biosurfactani de ctre tulpinile bacteriene
selectate, Cercetri proprii privind posibilele aplicaii ale tulpinilor bacteriene productoare de
biosurfactani, Concluzii generale.
n prima parte (Cap. I) sunt sintetizate principalele date bibliografice din literatura de
specialitate cu privire la obinerea de biosurfactani de la diferite specii de microorganisme. S-a pus
accent pe rezultatele obinute de specialitii n domeniu n urma folosirii speciilor bacteriene din
genul Bacillus, care produc compui lipopeptidici cu activitate specific de surfactani. Sunt
prezentate informaii referitoare la clasificarea i proprietile biosurfactanilor, factorii care
influeneaz producerea acestor compui, caracteristicile bacteriilor productoare de lipopeptide din
genul Bacillus, precum i aplicaii ale tulpinilor bacteriene productoare de biosurfactani n
bioremediere i combaterea biologic a agenilor patogeni specifici culturilor horticole. Aceast
parte constituie Stadiul cunoaterii problematicii abordate la nivel naional i internaional
Partea a doua (Cap. 2-6) este structurat n 5 capitole, n care sunt redate sistematic
cercetrile proprii axate pe noi tulpini bacteriene din genul Bacillus i prezentate n ordinea fireasc
a desfurrii experimentelor: izolarea din medii poluate, caracterizarea i identificarea noilor tulpini
din genul Bacillus, testarea activitii antifungice concomitent cu producerea de biosurfactani de

1
Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului i a culturilor horticole

ctre tulpinile bacteriene selectate i evidenierea posibilelor aplicaii ale tulpinilor bacteriene
productoare de biosurfactani. Sunt prezentate o serie de metode i tehnici experimentale variate,
pornind de la tehnici clasice de microbiologie (izolare, cultivare i pstrare a culturilor bacteriene
pure), de biochimie (teste de identificare a tulpinilor bacteriene, teste specifice privind screening-ul
tulpinilor bacteriene potenial productoare de biosurfactani, testarea supernatanilor n vederea
evidenierii compuilor de tip biosurfactant i separarea lor prin cromatografie n strat subire), de
fitopatologie (testarea in vitro a activitii inhibitoare a tulpinilor de microorganisme izolate i a
compuilor lipopeptidici produi) i ajungnd la tehnici moderne de genetic i biologie molecular
bazate pe analiza ADN-ului, pentru caracterizarea noilor izolate bacteriene. n capitolul ase sunt
formulate concluziile, avnd ca baz rezultatele obinute pe parcursul derulrii experimentelor.
Lucrarea este ilustrat cu un numr de 69 figuri (poze, grafice), 26 tabele i se bazeaz pe studiul a
133 lucrri bibliografice.
O parte din experimente s-au realizat prin participarea la proiectul de cercetare-dezvoltare
CNCSIS PN II IDEI-Cercetri privind activitatea unor compui biologici cu aplicaii n protecia
ecosistemelor agricole-Med_Lab (director de proiect conf. dr. Irina Grebenian).
Studiile pentru identificarea microorganismelor i obinerea biosurfactanilor s-au realizat n
Laboratorul de tiinele Mediului al Facultii de mbuntiri Funciare i Ingineria Mediului.
Tehnicile moleculare pentru identificarea tulpinilor bacteriene izolate i identificarea tulpinilor
productoare de iturin A, precum i testele pentru determinarea activitii antifungice a tulpinilor
bacteriene izolate i a lipopeptidelor produse s-au realizat n Laboratorul de Genetic i Inginerie
genetic din cadrul Facultii de Biotehnologii (prof. dr. Petrua Clina Cornea). Tehnica PCR s-a
realizat n Laboratorul de Genetic (cercettor tiinific Matilda Ciuc), din cadrul Institutului de
Dezvoltare i Cercetri Agricole, Fundulea.

INTRODUCERE

Un grup aparte de surfactani, intens studiai, cu aplicaii n ramurile industriale, agricole,

medicale i nu n ultimul rnd n bioremediere, este reprezentat de biosurfactani. Biosurfactanii
sunt grupai ntr-o clas de molecule tensioactive (active la suprafa), diferite din punct de vedere
structural, care sunt sintetizate de microorganisme. Dezvoltarea cercetrilor din domeniul
biosurfactanilor este foarte important, n principal, datorit preocuprii actuale pentru protecia
mediului. Aceste molecule reduc tensiunea superficial i tensiunea la interfa att n soluiile

2
Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului i a culturilor horticole

apoase ct i n amestecul de hidrocarburi, ceea ce arat potenialul lor n bioremediere. Ei intervin

n sporirea solubilitii i asimilrii poluanilor hidrofobi, determinnd folosirea lor n biodegradare,
n sporirea recuperrii ieiului (MEOR - Microbial Enhanced Oil Recovery) i n procesele de
de-emulsifiere. Surfactanii de origine microbian au mai multe avantaje dect surfactanii chimici
datorit capacitii lor de a se biodegrada, toxicitii sczute i datorit faptului c au eficacitate la
valori extreme de temperatur, pH i salinitate (Singh i Cameotra, 2004). Deoarece biosurfactanii
sunt direct biodegradabili i pot fi produi n cantiti mari de ctre microorganisme i astfel nu sunt
dependeni de produii derivai din iei, ei pot nlocui foarte bine surfactanii sintetici tradiionali
(Sarubo i colab., 2006; Singh i Cameotra, 2004; Desai i Banat, 1997). Se poate spune c aceste
substane au o compatibilitate mult mai bun cu mediul dect surfactanii chimici, i pentru c
biosurfactanii nu sunt toxici pentru mediul natural i au o capacitate ridicat de biodegradare, ei
intr n categoria substanelor prietenoase cu mediul. Pot fi utilizai ca emulsifiani,
de-emulsifiani, ageni de nmuiere, ageni de dispersare, ageni de spumare, ingredieni alimentari
activi i detergeni, cu utilizri n diferite sectoare cum ar fi: petrol i petrochimie, chimie organic
i formularea lubrifianilor, industria alimentar i a buturilor, cosmetic i obinerea detergenilor,
industria farmaceutic, industria minier i metalurgic, agrochimie i formularea pesticidelor,
protecia i managementul mediului (recuperarea ieiului, favorizarea eliminrii din solurile
contaminate a unor metale grele, etc.).
Un alt avantaj al surfactanilor microbieni const n capacitatea acestora de a fi sintetizai pe
substraturi din mai multe materii prime ieftine, de exemplu deeuri rezultate din diferite tehnologii
industriale, agricole i din industria alimentar, n felul acesta scznd costul de producie. Chiar
dac interesul pentru biosurfactani este n cretere, aceti compui nu pot concura din punct de
vedere economic cu surfactanii sintetici (Moussa i colab., 2006). Succesul producerii de
biosurfactani depinde de dezvoltarea procedeelor ieftine i de folosirea materiilor prime ieftine care
s justifice 10-30% din costul total al procesului tehnologic (Sarubbo i colab., 2006). n literatura
de specialitate se arat c o gam larg de surse de carbon inclusiv resursele refolosibile din
agricultur sunt potrivite pentru obinerea de biosurfactani, fr efecte nocive din punct de vedere
ecologic i cu cele mai bune proprieti n funcie de domeniile de aplicaie. Produciile optime de
ageni tensioactivi sunt obinute cnd se folosesc ca substrat carbohidraii i uleiurile vegetale.
Biosurfactanii sunt compui amfifilici produi la nivelul suprafeelor celulelor microbiene
sau sunt excretate extracelular, conin jumti hidrofobe i hidrofile i reduc tensiunea superficial
i tensiunile interfee, avnd proprieti de emulsionare. Biosurfactanii pot avea una din urmtoarele

3
Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului i a culturilor horticole

structuri: glicolipide, peptide, acizi grai, fosfolipide, acid mycolic, antibiotice, combinaiile
complexe polizaharide-lipide, lipoproteine, lipopeptide sau nsi suprafaa celulei microbiene. Dei
tipul i cantitatea de surfactani microbieni depinde, n primul rnd de organismul productor, factori
precum sursele de carbon, sursele de azot, microelementele, temperatura, pH-ul, gradul de aerare,
pot de asemenea influena producerea biosurfactanilor de ctre microorganisme (Desai i Banat,
1997). Aceti biosurfactani sunt produi de numeroase specii de bacterii, levuri i fungi filamentoi
care utilizeaz o varietate mare de compui organici ca surs de carbon i energie pentru creterea
lor.
Dei muli biosurfactani sunt considerai metabolii secundari, civa pot avea un rol esenial
n supravieuirea microorganismelor productoare de biosurfactant, favoriznd transportul
nutrienilor, interaciunile microorganism-gazd sau inhibarea creterii unor organisme patogene,
ceea ce explic folosirea acestor substane n agricultur, pentru combaterea unor ageni
fitopatogeni. De asemenea, acetia determin biodisponibilitatea substraturilor insolubile n ap,
legarea de metale grele, intervin n procesul quorum sensing specific microorganismelor i n
formarea biofilmelor (Rodrigues i colab., 2006). Biosurfactanii prezint i activiti
antimicrobiene, cu aciune antibacterian, antifungic i antiviral. Multe lucrri referitoare la
aplicaiile biosurfactanilor au fost focalizate pe folosirea lor n agricultur i pentru combaterea
polurii mediului, datorit diversitii lor, aciunii prietenoase cu mediul, posibilitii de a fi produi
pe scar larg i datorit eficacitii lor la temperaturi extreme i valori diferite de pH (Rodrigues i
colab., 2006). Astfel c biosurfactanii pot fi folosii pentru combaterea unor boli produse de diferii
ageni patogeni (n special bacterii i fungi) i fac parte din metodele alternative de combatere a unor
ageni care produc pagube mari n diferite zone agricole din lume, metode de combatere biologic
care ctig tot mai mult teren, datorit n principal preocuprii actuale pentru protecia mediului.

OBIECTIVELE CERCETRILOR EFECTUATE

Datorit potenialului aplicativ foarte mare al bacteriilor din genul Bacillus, posibilitatea
cultivrii la scar industrial a acestor microorganisme i obinerea unor cantiti suficiente de
biosurfactani constituie una dintre principalele preocupri ale cercettorilor la nivel internaional.
Lucrarea de fa i-a propus izolarea i identificarea unor noi tulpini bacteriene din genul
Bacillus potenial productoare de biosurfactani, obinerea compuilor tensioactivi n condiii
optime de cultivare a izolatelor bacteriene selectate i studierea posibilelor aplicaii att ale tulpinilor

4
Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului i a culturilor horticole

bacteriene selectate ct i a compuilor cu activitate de surfactant punndu-se accent, n special, pe

activitatea antifungic.
n acest scop principalele obiective urmrite au fost:
1. Izolarea i caracterizarea unor noi tulpini bacteriene capabile s produc biosurfactani.
Pentru aceasta au fost utilizate probe de sol contaminat cu hidrocarburi i ape reziduale din
diferite locaii, din care au fost izolate diverse tulpini bacteriene, precum i metode specifice
de evideniere a producerii de compui tensioactivi. Cercetrile au fost orientate n vederea
stabilirii condiiilor optime de producere a biosurfactanilor bacterieni.
2. Stabilirea unor metode eficiente de identificare a noilor izolate bacteriene prin realizarea
unei abordri polifazice, ce a presupus o combinare a unor metode microbiologice clasice, cu
metode moderne, inclusiv moleculare.
3. Evidenierea capacitii tulpinilor bacteriene selectate i a biosurfactanilor sintetizai de
acestea de a inhiba fungi fitopatogeni precum i de a reduce nivelul unor hidrocarburi
poluante.
4. Testarea in vitro a unor posibile aplicaii ale tulpinilor bacteriene selectate, n condiiile
evidenierii inocuitii acestora.

CERCETRI PROPRII

Capitolul II: Cercetri proprii privind izolarea din medii poluate, caracterizarea i
identificarea unor noi tulpini bacteriene din genul Bacillus
Cercetrile care au fcut obiectul acestui capitol au fost abordate n vederea:
1. Izolrii i caracterizrii unor tulpini bacteriene capabile s produc biosurfactani;
2. Stabilirii unor metode eficiente de identificare a noilor izolate bacteriene printr-o abordare
polifazic, ce presupune o combinare a metodelor microbiologice clasice, cu metode
moderne, inclusiv moleculare.
Recoltarea probelor pentru izolarea microorganismelor productoare de biosurfactani s-a
realizat n perioada 15-17 iulie 2007. Prin izolarea bacteriilor din diverse surse naturale poluate s-au
obinut un numr total de 80 colonii bacteriene, care au fost testate pe mediu ce conine ulei uzat.
Izolarea tulpinilor bacteriene i obinerea culturilor pure s-au realizat prin metode
bacteriologice clasice. Pentru izolarea tulpinilor bacteriene s-au folosit mediile de cultur
Luria-Bertani i geloz. Selectarea tulpinilor bacteriene potenial productoare de biosurfactani s-a

5
Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului i a culturilor horticole

fcut prin cultivarea coloniilor bacteriene izolate din sol i ap n mediul MSM cu zaharoz (Wilson
i Zajic, 1985) i n mediul MSM n care zaharoza a fost nlocuit cu ulei uzat 3%. La sfritul
perioadei de incubare de 7 zile la 280C, s-a examinat intensitatea creterii bacteriilor, aspectul
peliculei de iei i formarea de emulsii, acestea fiind principalele efecte prin care s-ar demonstra c
bacteriile testate ar produce substane tensioactive ce permit formarea de emulsii stabile. Dintre
noile izolate bacteriene, doar 28 au fost capabile de a forma emulsii n mediul testat. Studiile s-au
concentrat asupra bacteriilor Gram-pozitive, aparinnd genului Bacillus, scopul nostru fiind de a
identifica noi tulpini bacteriene capabile de a produce compui tensioactivi i s fie sigure pentru
mediu i sntatea omului. De aceea, din cele 80 noi izolate au fost selectate 18 tulpini
Gram-pozitive, dintre care doar 10 au manifestat capacitatea de a produce biosurfactani.
Pentru a limita i mai mult numrul de tulpini bacteriene care s fie utilizate n experimentele
ulterioare, cele 10 izolate au fost testate i n privina activitii antagoniste fa de fitopatogenul
Alternaria tenuis, evideniindu-se faptul c doar dou tulpini au prezentat o activitate inhibitoare
foarte clar. Aceste tulpini au fost notate B1 (tulpin izolat din sol poluat cu hidrocarburi) i B2
(tulpin izolat din sol, din zona Techirghiol), ele fiind utilizate n experimente de identificare i
caracterizare a proprietilor utile.
Pentru studii comparative, mai ales n privina identificrii, s-a utilizat i o tulpin de bacili
Gram-negativi, izolat din ap de mare, capabil de a produce substane tensioactive. Aceast
tulpin, pe baza unor teste preliminare de identificare, a fost identificat ca aparinnd genului
Pseudomonas. Identificarea izolatelor bacteriene s-a fcut prin utilizarea unei abordri polifazice,
pornind de la metode microbiologice clasice pn la tehnici moleculare, moderne:
1. Evidenierea particularitilor bacteriilor izolate i dezvoltate pe medii solide, de geloz, prin
coloraia Gram;
2. Identificarea tulpinilor bacteriene prin utilizarea sistemului BIOLOG, bazat pe reacii
chimice metabolice de reducere a tetrazoliului, folosind microplcile Biolog GP2 i GN2,
pentru bacterii Gram-pozitive i respectiv, Gram-negative;
3. Analizarea comunitilor microbiene din probele naturale de sol i ap prin tehnica FISH, o
tehnic molecular de hibridizare in situ.
4. Caracterizarea noilor izolate bacteriene prin tehnici moleculare bazate pe:
Izolarea ADN-ului cromozomal bacterian prin folosirea kitului Wizard Genomic DNA
Purification Promega i prin metoda Hopwood i colab. (1985) adaptat;
Verificarea electroforetic a ADN-ului n gel de agaroz;

6
Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului i a culturilor horticole

Amplificarea ADN-ului bacterian prin tehnologia PCR (Polymerase Chain Reaction).

n urma folosirii microplcilor Biolog GP2 s-a evideniat profilul fiziologic al tulpinilor
bacteriene B1 i B2 i s-a stabilit apartenena noilor izolate la genul Bacillus, specia B. subtilis,
probabilitatea de identificare fiind de 85% pentru ambele tulpini.
Analizarea probelor n vederea identificrii tulpinilor prin tehnica FISH, s-a realizat la cele
dou tulpini bacteriene Gram-pozitive izolate, B1 i B2, i la tulpina Gram-negativ,
Pseudomonas sp. Prin folosirea sondelor moleculare marcate fluorescent i examinarea produilor
de hibridizare la microscopul cu epifluorescen, s-au evideniat unele deosebiri ntre cele dou
izolate aparinnd genului Bacillus i a izolatului din genul Pseudomonas, dar nu au permis
identificarea speciilor crora le aparin izolatele testate.
Prin analize moleculare, ADN-ul genomic a fost utilizat n reacii de amplificare distincte,
utiliznd diferite tipuri de primeri, att pentru tulpina Pseudomonas sp., ct i pentru cele dou
tulpini de Bacillus. Rezultatele obinute arat c noul izolat de Pseudomonas aparine speciei
Ps. aeruginosa i c noile tulpini B1 i B2 prezint un comportament similar celui evideniat la
tulpina de referin B. subtilis ATCC 6633, ceea ce ar sugera c aparin speciei B. subtilis.
Dei n cercetrile noastre am pornit de la o baz de date deja existent n ceea ce privete
izolarea, identificarea i caracterizarea micoorganismelor, am considerat necesar testarea metodelor
de identificare i caracterizare, astfel nct rezultatele s fie comparabile cu cele obinute pe plan
internaional. Principalele contribuii au fost axate pe dou direcii: (a) izolarea unor noi tulpini de
Bacillus din medii poluate cu hidrocarburi i (b) o abordare polifazic pentru identificarea noilor
izolate bacteriene prin combinarea metodelor microbiologice clasice cu cele moleculare.

Capitolul III: Cercetri proprii privind testarea activitii antifungice a tulpinilor bacteriene
selectate
Cercetrile prezentate n acest capitol au avut ca obiectiv, evidenierea capacitii tulpinilor
bacteriene selectate de a inhiba fungi fitopatogeni in vitro i in vivo (n condiii de laborator). Pentru
analizarea eficacitii tulpinilor de interes B1 i B2 ca ageni de combatere biologic au fost realizate
teste de apreciere a antagonismului fa de fungii fitopatogeni. Scopul acestor experimente a fost de
a evidenia dac izolatele bacteriene luate n studiu sunt competitive.
Pentru testarea in vitro s-au folosit fungii fitopatogeni Alternaria tenuis, Fusarium
oxysporum var. lycopersici, Sclerotium bataticola, Rhizoctonia solani, Pythium spp., cultivai n
plci Petri cu mediul PDA. Testarea s-a fcut prin inocularea tulpinilor n poziii juxtapuse, n vase

7
Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului i a culturilor horticole

Petri ce conin mediu agarizat. Prin folosirea mai multor specii de fungi fitopatogeni, s-a examinat
spectrul de aciune al celor dou tulpini bacteriene selectate.
S-a constatat c ambele tulpini bacteriene nu au capacitatea de a inhiba creterea fungilor din
speciile Sclerotium bataticola i Rhizoctonia solani. Cu toate acestea s-a observat c, dei n zona de
interaciune direct dintre tulpinile bacteriene B1, B2 i fungii din cele dou specii menionate nu
s-a format o zon clar de inhibare, creterea coloniei fungice a fost ncetinit, marginile coloniei
fungice nedepind marginea coloniei bacteriene sau depind-o foarte puin, ceea ce sugereaz un
efect fungistatic al celor dou izolate bacteriene.
Testarea in vivo s-a fcut dup ce n prealabil tulpinile bacteriene au fost cultivate n mediu
de cultur lichid cu sruri minerale, pentru obinerea biomasei bacteriene necesar tratamentului in
vivo. Prin cultivarea tulpinilor B1 i B2 n mediu MSM, s-a remarcat c tulpina B2 a crescut mai
bine, cantitatea de biomas fiind mai mare.
n acest experiment s-a urmrit activitatea antifungic fa de Alternaria spp., tulpini fungice
izolate de pe fructele de ardei i tomate, identificate ca Alternaria alternata (A. tenuis) i respectiv
A. alternata f.sp. lycopersici. S-au ales trei variante experimentale, concretizate prin tratarea
seminelor cu: (1) suspensie bacterian din tulpinile B1 i B2, (2) cu suspensie bacterian i
suspensie fungic de Alternaria alternata f.sp. lycopersici/Alternaria tenuis i (3) numai cu
suspensie fungic.
S-a constatat c, att la ardei ct i la tomate, plantele tratate doar cu suspensiile bacteriene
au crescut viguros (varianta V1), fr urme de stres, n timp ce plantele tratate cu bacterii i
suspensie fungic au fost mai mici ca dimensiuni, dar aparent sntoase (varianta V2). n cazul
variantei V3, s-a observat c tratamentul exclusiv cu fungii fitopatogeni nu a permis dezvoltarea
plantelor. n urma testrii, s-a observat c tulpina bacterian B2 are o aciune pozitiv asupra
dezvoltrii plantelor testate, att la ardei ct i la tomate, ceea ce arat potenialul acestei specii
bacteriene de a favoriza creterea plantelor. De asemenea, aceasta are un potenial antifungic mai
bun fa de fungii fitopatogeni testai, comparativ cu tulpina B1, datorit producerii compuilor
antifungici.
Din literatura de specialitate se cunoate c efectul de stimulare a creterii plantelor realizat
de unele bacterii antagoniste se datoreaz producerii de auxine, i n principal de acid 3-indolil-
acetic (IAA). Pentru evidenierea producerii de IAA de ctre tulpinile bacteriene B1 i B2 s-a folosit
metoda descris de Brie (1991). n afar de cele dou tulpini bacteriene s-a folosit i un alt izolat
natural aparinnd genului Bacillus, notat BW i o tulpin de B. subtilis de colecie ATCC 6633.

8
Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului i a culturilor horticole

Aceste tulpini bacteriene au fost crescute pe mediu NB simplu i mediu NB suplimentat cu triptofan,
acesta fiind precursorul IAA. Mediile de cultur i metoda de testare sunt descrise n capitolul III al
tezei, subcapitolul Rezultate i discuii. Rezultatele obinute au artat c toate cele trei izolate
naturale produc IAA, cel mai ridicat nivel fiind evideniat la tulpina B2, acesta crescnd i mai mult
atunci cnd cultivarea s-a realizat n mediu suplimentat cu triptofan.
S-a constatat c, n urma interaciunii cu tulpina bacterian B2, au aprut modificri la
nivelul hifelor fungice, reprezentate prin alungiri ale hifelor, ngrori ale peretelui celular,
plasmoliz, fragmentarea membranelor citoplasmatice i ruperea peretelui celular cu eliminarea
coninutului citoplasmatic (pe imagini apar formaiuni alungite asemntoare unor vezicule la
captul hifelor fungice). La toate preparatele fungice analizate, cea mai frecvent modificare
observat a fost plasmoliza (fig. 3.1, sgeata fig. 3.8 b din tez).

Fig. 3.1 (Fig. 3.8.b Tez): Modificrile hifelor de Alternaria tenuis n urma interaciilor cu tulpina
bacterian B. subtilis B2; sgeata: fenomenul de plasmoliz.

n acest capitol am abordat tematica din perspectiva testrii activitii antifungice a izolatelor
bacteriene B1 i B2 n dou direcii: (a) testare in vitro i (b) testare in vivo. Am demonstrat
activitatea antifungic a tulpinilor B1 i B2 fa de fungii testai, evideniind efectele antagoniste
mai puternice n cazul tulpinii B2. Prin testarea in vivo am demonstrat c tulpina B2 manifest, n
plus, i o activitate de stimulare a creterii rsadurilor de ardei sau roii, punnd n eviden
capacitatea mai mare a acestei tulpini de a produce acid indolil acetic. Extrem de interesante au fost
rezultatele obinute n urma examinrii microscopice a hifelor de A. alternata n urma interaciunii
cu tulpinile bacteriene B1 i B2, n special, concretizate prin modificrile hifelor, apariia
plasmolizei i ruperea peretelui celular cu eliberarea coninutului citoplasmatic (vizualizat prin
formarea unor vezicule, mai ales la captul hifelor fungice).

9
Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului i a culturilor horticole

Capitolul IV: Cercetri proprii privind producerea de biosurfactani de ctre tulpinile

bacteriene selectate
Obiectivele urmrite n acest capitol au constat n:
1. Stabilirea condiiilor optime de producere a biosurfactanilor bacterieni;
2. Evidenierea producerii compuilor tensioactivi prin metode specifice.
Pentru realizarea obiectivelor menionate s-au folosit mai multe tipuri de tulpini bacteriene,
dintre care unele de colecie i altele nou izolate (tabelul 4.1 tabelul 4.1 din tez).
Tabelul 4.1 (Tabelul 4.1 Tez)
Tulpini bacteriene utilizate n experimente
Tulpina Particulariti Origine
B. subtilis B1 Activitate antifungic slab Izolat din sol poluat cu hidrocarburi
B. subtilis B2 Activitate antifungic Izolat din sol poluat cu diverse deeuri
B. subtilis ATCC Tulpin de referin Colecia Laboratorului de Genetic i inginerie
6633 genetic, Facultatea de Biotehnologii
Bacillus sp. BW Activitate antifungic i Colecia Laboratorului de Genetic i inginerie
antibacterian genetic, Facultatea de Biotehnologii
Bacillus sp.OS15 Activitate antifungic fa Drd.Oana Sicuia, Institutul pentru Protecia
de Fusarium oxysporum Plantelor Bucureti
Bacillus sp.OS17 Activitate antifungic fa Drd.Oana Sicuia, Institutul pentru Protecia
de Fusarium oxysporum Plantelor Bucureti

Pentru detectarea producerii de biosurfactani s-au folosit dou metode: testul hemolizei, prin
cultivarea bacteriilor pe mediul cu geloz-snge, i testul cu CTAB-agar, ambele descrise n
subcapitolul Materiale i metode din capitolul IV al tezei. n cazul utilizrii tehnicii de cultivare pe
geloz-snge, s-a observat un halou clar de hemoliz n jurul tuturor coloniilor bacteriene testate, cel
mai mare fiind nregistrat la coloniile tulpinilor B1 i B2. n schimb, n urma testrii tulpinlor
bacteriene prin cultivare pe mediu cu CTAB nu s-au observat prezena halourilor albastre-violete n
jurul coloniilor bacteriene. Pentru verificarea rezultatelor s-au testat i patru tulpini de
Pseudomonas sp., unde rezultatele au fost pozitive.
Pentru obinerea unor cantiti suficiente de biosurfactani, bacteriile de interes au fost
cultivate n dou tipuri de medii de cultur, recomandate n literatura de specialitate n acest scop.
Astfel, s-au folosit mediile MSM i McKeen, ultimul cu o formul uor modificat. Compoziia
mediilor de cultur i protocolul de lucru sunt prezentate n subcapitolul menionat anterior. n urma
cultivrii tulpinilor bacteriene B1, B2, B17 (B. subtilis ATCC 6633) n mediul MSM cu 30 g/L
sucroz ca surs de carbon, s-au obinut curbe de cretere tipice pentru o cultur bacterian, fr
diferene semnificative ntre tulpinile analizate. Rezultatele obinute n urma cultivrii tulpinilor
bacteriene n mediul McKeen cu 2,5 % glucoz ca surs de carbon, arat c dup 12 ore de incubare

10
Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului i a culturilor horticole

are loc o cretere progresiv a turbiditii mediului de cultur la toate tulpinile bacteriene testate.
Faza de cretere exponenial se ntinde, la toate cele trei tulpini bacteriene, pe parcursul a 36 ore,
dei, n cazul tulpinii B1 i B2 are loc o cretere rapid n primele 12 ore, dup care ritmul de
cretere ncetinete. De remarcat c, la toate cele trei tulpini testate, s-a observat un vrf de cretere
la aproximativ 84 ore. n cazul celorlalte trei tulpini bacteriene luate n studiu, BW, OS15 i OS17,
se constat o cretere exponenial a bacteriilor timp de 12 ore, dup care, rata de cretere scade
foarte mult, intrndu-se practic ntr-o faz staionar prelungit. Dup 96 ore, numai tulpinile OS15
i OS17 au intrat n faza de declin, datorit limitrii coninutului de nutrieni; la tulpina BW valorile
absorbanei la 600 nm rmnnd constante.
Evidenierea prezenei compuilor lipopeptidici n supernatantele culturilor bacteriene prin
testarea activitii de dispersare a petrolului, s-a fcut prin msurarea diametrului zonei clare de
dispersie, format prin deplasarea substratului. Testrile s-au fcut pe diferite substraturi uleioase:
ulei de floarea soarelui, ulei de msline, kerosen i kerosen cu 20% motorin. Rezultatele prezentate
n tabelul 4.2 (tabelul 4.5 din tez) arat c activitatea cea mai bun de dispersare o are tulpina B2.
Tabelul 4.2 (Tabelul 4.5 Tez)
Evidenierea producerii de biosurfactani de ctre tulpinile bacteriene Bacillus subtilis B1, B2, ATCC 6633 i
BW pe diferite substraturi
Tulpini Zona clar format (mm)
bacteriene Ulei de floarea Ulei de msline Kerosen Kerosen cu 20%
soarelui motorin
B1 4 5 26 26
B2 6 9 56 54
ATCC 6633 3 5 13 12
BW 3 6 18 15

De remarcat c valorile maxime ale zonei de dispersie au fost obinute pe kerosen i pe

kerosen cu motorin. Pornind de la diametrul zonei de dispersie pe substratul kerosen i kerosen cu
motorin, s-a calculat aria de dispersie (n cm2), rezultatele fiind prezentate n tabelul 4.3 (tabelul 4.6
din tez).
Tabelul 4.3 (Tabelul 4.6 Tez)
Aria de dispersie fa de kerosen i kerosen cu 20% motorin a tulpinilor bacteriene testate
Tulpina Kerosen Kerosen cu 20% motorin
bacterian Diametrul zonei Aria zonei de Diametrul zonei Aria zonei de
de dispersie (cm) dispersie (cm2) de dispersie (cm) dispersie (cm2)
B1 26 5,3 26 5,3
B2 56 24,61 54 22,89
ATCC 6633 13 1,32 12 1,13
BW 18 2,54 15 1,76

11
Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului i a culturilor horticole

Faptul c fa de kerosen i kerosen cu 20% motorin, aciunea de dispersare a fost ridicat

la toate tulpinile testate, sugereaz nu numai c acestea produc substane tensioactive ci i c ele ar
putea fi folosite n practic, n experimente de bioremediere dac, alturi de proprietatea menionat,
tulpinile bacteriene manifest i capacitate de a forma emulsii stabile.
Activitatea de emulsionare a fost testat prin dou metode: msurarea densitii optice a
supernatantelor cu diferite substraturi i msurarea stabilitii emulsiei formate dup 24 ore,
respectiv calcularea indicelui de emulsonare la 24 ore (E24). n urma msurrii densitii optice la
lungimea de und de 540 nm, s-a constatat c valorile cele mai ridicate au fost obinute la tulpina B2
(tabelul 4.4 tabelul 4.7 din tez).
Tabelul 4.4 (Tabelul 4.7 Tez)
Testarea activitii de emulsionare a biosurfactanilor obinui de la tulpinile bacteriene izolate Bacillus
subtilis B1, B2, ATCC 6633, BW, prin msurarea densitii optice la 540 nm
Substraturi Activitatea de emulsionare prin msurarea densitii optice la 540 nm
B1 B2 ATCC 6633 BW
Ulei de floarea 0,093 1,177 0,109 0,17
soarelui
Ulei de msline 0,107 1,284 0,281 0,178
Kerosen 0,058 0,391 0,110 0,180
Kerosen cu 20%
motorin 0,060 0,577 0,038 0,227

Se remarc faptul c i valorile indicelui de emulsionare sunt mai mari n cazul tulpinii B2.
n tabelul 4.5 (tabelul 4.8 din tez) sunt prezentate valorile indicelui de emulsionare la 24 ore.
Tabelul 4.5 (Tabelul 4.8 Tez)
Valorile indicelui de emulsionare la 24 ore (E24) la tulpinile bacteriene Bacillus subtilis B1, B2, ATCC 6633
i BW
Tulpini Indicele de emulsionare la 24 ore (E24) (%)
bacteriene Ulei de floarea Ulei de msline Kerosen Kerosen cu 20%
soarelui motorin
B1 43,90 40,24 58,54 51,22
B2 54,88 51,22 71,35 60,37
ATCC 6633 43,90 45,73 51,22 47,56
BW 47,56 49,39 64,03 53,05

Se observ c valorile cele mai ridicate ale indicelui de emulsionare s-au obinut la tulpina
B2, n special la kerosen 71,35% i la kerosen cu 20% motorin de 60,37%. Aceste rezultate arat c
tulpinile bacteriene testate, n special tulpina B2, produc compui cu proprieti de emulsionare i de
stabilizate a emulsiei. n plus, chiar dac zonele de dispersie a uleiurilor vegetale utilizate, au fost
reduse la toate tulpinile testate, indicele de emulsionare a fost ridicat pentru aceste substraturi, ceea

12
Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului i a culturilor horticole

ce sugereaz posibile aplicaii ale tulpinilor bacteriene selectate pentru degradarea uleiurilor
vegetale uzate (arse).
Pentru c rezultatele obinute au artat capacitatea tulpinilor bacteriene B1, B2, B17 i BW
de a produce ageni tensioactivi, ne-am propus s examinm dac aceste tulpini sunt potenial
productoare de lipopeptide de tip iturin, folosind dou perechi de primeri ituD i lpa14. Rezultatele
obinute sunt prezentate n mod sintetic n tabelul 4.6 (tabelul 4.9 din tez).
Tabelul 4.6 (Tabelul 4.9 Tez)
Rezultatele testului PCR
Tulpina Rezultate PCR Comentarii
bacterian
B. subtilis ATCC Ampliconul de 1203 pb specific pentru
6633 ituD este clar, n timp ce ampliconul de Posibil productor de iturin
675 pb corespunztor genei lpa-14 nu
este foarte clar
B. subtilis B1 Ambii ampliconi sunt prezeni Productor de iturin
B. subtilis B2 Niciunul dintre produii de amplificare Nu produce iturin, biosurfactanii pe
nu a fost detectat care i sintetizeaz sunt de alt tip
B. subtilis BW Ambii ampliconi sunt prezeni Productor de iturin

Extracia biosurfactanilor s-a fcut dup o metod adaptat dup mai multe metode
prezentate n literatura de specialitate, fiind descris n capitolul IV al tezei, subcapitolul Materiale
i metode. n experimentele noastre, n urma evaporrii metanolului, s-a obinut, pentru toate
tulpinile bacteriene luate n studiu, un depozit de culoare brun-glbuie, fiind considerat biosurfactant
brut. S-au constatat, totui, diferene n privina mrimii depozitului: cel mai mare depozit s-a
obinut la tulpina B2. n vederea evidenierii biosurfactanilor prin cromatografie n strat subire
(TLC) i pentru determinarea eventualei activiti antifungice, sedimentele de biosurfactant au fost
reluate n 100 l metanol sau n 100 l n-butanol.
Pentru detectarea biosurfactanilor prin TLC, s-a folosit sistemul solvent cloroform-metanol-
ap (65:25:4 v/v/v), iar ca soluie de revelare o soluie alcoolic de ninhidrin 0,2%. Aplicarea
extractelor metanolice sau butanolice pe plcile cu silicagel, a condus la evidenierea unor spoturi de
culoare violet, indicnd prezena lipopeptidelor.
Dei n cercetrile noastre am pornit de la o platform de cunotine deja existente n ceea ce
privete creterea acestui tip de microorganisme, avnd n vedere dificultatea alegerii unui mediu
bun pentru cultivarea izolatelor bacteriene selectate, potenial productoare de biosurfactani, am
considerat necesar testarea i optimizarea creterii tulpinilor bacteriene, astfel nct rezultatele
obinute n cadrul etapelor urmtoare s fie comparabile cu cele obinute pe plan internaional. Am

13
Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului i a culturilor horticole

artat c prin folosirea mediului de cultur McKeen cu 2,5% glucoz, ca surs de carbon, creterea
bacteriilor a fost mai bun, permind producerea unei cantiti mai mari de biosurfactani.
Prin verificarea indicelui de emulsionare fa de uleiul de floarea soarelui i cel de msline,
s-a demonstrat c toate tulpinile bacteriene testate au manifestat valori ridicate, ceea ce sugereaz
posibile aplicaii pentru degradarea uleiurilor vegetale testate.
Pe lng utilizarea mediului de cultur McKeen pentru obinere de biosurfactani, ca element
de noutate putem meniona diferenele tulpinilor B1 i B2 n evidenierea producerii de lipopeptide
de tip iturin A cu dou perechi de primeri (pentru genele ituD i lpa-14). S-a demonstrat c n
genomul B1 se gsesc ambele gene int, implicate n biosinteza iturinului, observndu-se clar
ampliconul de 1203 pb pentru gena ituD i cel de 675 pb corespunztor genei lpa-14. La tulpina B2
nu s-au observat produii de amplificare pentru genele menionate, demonstrndu-se astfel c tulpina
bacterian poate s produc alte tipuri de biosurfactani lipopeptidici.
De asemenea, s-a pus la punct o metod de extracie, adaptat dup mai multe metode
prezentate n literatura de specialitate, reuindu-se obinerea unui biosurfactant lipopeptidic brut, sub
form de sediment brun-glbui, acesta fiind folosit n testrile ulterioare sub form de extracte
lipopeptidice metanolice i butanolice.

Capitolul V: Cercetri proprii privind posibilele aplicaii ale tulpinilor bacteriene

productoare de biosurfactani
Cercetrile care fac obiectul acestui capitol au fost abordate n vederea:
1. Evidenierii capacitii biosurfactanilor sintetizai de tulpinile bacteriene selectate de a
inhiba fungi fitopatogeni;
2. Evidenierii capacitii tulpinilor bacteriene selectate de a reduce nivelul unor hidrocarburi
poluante;
3. Testrii in vitro a unor posibile aplicaii ale tulpinilor bacteriene selectate, n condiiile
evidenierii inocuitii acestora.
Pentru determinarea capacitii de degradare a uleiurilor uzate, s-a folosit numai tulpina
B. subtilis B2, pentru c aceasta a dovedit cea mai bun activitate de emulsifiere a diverselor
categorii de uleiuri i kerosen. S-au folosit trei medii de cultur cu sruri minerale: MSM1, MSM2
i McKeen. Compoziia mediilor de cultur i protocolul de lucru sunt prezentate n capitolul V al
tezei, subcapitolul Materiale i metode. n toate mediile de cultur s-a adugat glucoz numai pentru

14
Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului i a culturilor horticole

culturile preinocul. Pentru evidenierea creterii tulpinii bacteriene B2 n medii cu hidrocarburi s-a
nlocuit glucoza cu ulei ars de motor. Determinrile s-au fcut ealonat la 5, 10, 15 i 20 zile.
n urma testrii, s-a constatat c n mediul MSM2 s-a obinut cel mai bun nivel al creterii
bacteriene. Se remarc faptul c, dup 10 zile de incubare, nivelul creterii bacteriilor se menine
ridicat, ceea ce ilustreaz viabilitatea i, prin urmare, activitatea metabolic a acestora. Determinarea
viabilitii bacteriilor n mediile respective (prin nsmnarea unor plci Petri ce conin mediu LB
agarizat cu diluii ale suspensiilor bacteriene), susine ideea c bacteriile continu s rmn viabile
i active din punct de vedere metabolic o lung perioad de timp, fapt ce reprezint importan n
condiiile utilizrii in vivo a acestora. n plus, s-a observat emulsionarea uleiului de motor, ceea ce
semnific producerea unui compus lipopeptidic extracelular cu activitate de biosurfactant. Putem
spune c activitatea de emulsionare a tulpinii B2 fa de uleiul uzat este ridicat, iar tipul de mediu
utilizat nu influeneaz n mod semnificativ aceast activitate. De altfel, rezultatele confirm datele
prezentate n capitolul IV, care au artat c nivelul activitii de emulsionare rmne ridicat, cel
puin pentru tulpina B2, indiferent de varianta de mediu sintetic utilizat pentru testri.
n vederea evidenierii capacitii antifungice a biosurfactanilor bacterieni, extractele
lipopeptidice de la tulpinile bacteriene B1, B2, ATCC 6633 i BW au fost testate pe speciile fungice
A. tenuis i S. bataticola, n timp ce extractele de la tulpinile bacteriene OS15 i OS17 au fost testate
pe F. oxysporum var. lycopersici. Plcile Petri s-au nsmnat cu extractele metanolice i butanolice
ale lipopeptidelor produse de tulpinile bacteriene, cu tulpina bacterian testat i cu sedimente
bacteriene rezultate de la cea de-a treia extracie cu metanol, n patru puncte la o distan de 1 cm de
poriunea central reprezentat de specia fungic de interes.
Rezultatele obinute n urma testrii activitii antifungice a extractelor lipopeptidice
demonstreaz capacitatea lor de a inhiba creterea speciilor fungice testate. n a patra zi de
observaii a interaciunilor dintre tulpinile bacteriene B1, B2, ATCC 6633 i BW fa de A. tenuis,
se observ zone clare de inhibiie a creterii miceliului la toate zonele delimitate pe plcile Petri, n
cazul tulpinilor bacteriene BW i B2 (fig. 5.1 fig. 5.14 din tez).

15
Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului i a culturilor horticole

Fig. 5.1 (Fig. 5.14 Tez): Interaciile dintre tulpinile bacteriene Bacillus subtilis B1, B2, ATCC
6633 (notat A), BW i a extractelor lipopeptidice metanolice i butanolice fa de Alternaria
tenuis, dup 96 ore la 280C

n urma interaciilor fa de S. bataticola, rezultatele obinute sunt negative. Extractele

lipopeptidice metanolice i butanolice ale tulpinilor bacteriene nu au activitate antifungic fa de
specia patogen testat. La tulpinile B1 i B2 rezultatele obinute sunt confirmate de testele in vitro
privind activitatea antifungic prezentate n capitolul III al tezei.
n urma msurtorilor realizate la plcile cu tulpinile bacteriene OS15 i OS17, privind
activitatea antifungic fa de F. oxysporum var lycopersici, s-a constatat c miceliul fungic s-a
dezvoltat predominant n zonele cu extracte lipopeptidice metanolice i butanolice. Inhibiia s-a
observat la nivelul tulpinilor bacteriene i a sedimentului bacterian, fapt ce demonstreaz activitatea
antifungic a izolatelor bacteriene asupra fungului patogen testat (fig. 5.2 fig. 5.16 din tez).

16
Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului i a culturilor horticole

Fig. 5.2 (Fig. 5.16 Tez): Interaciile dintre tulpinile bacteriene Bacillus subtilis OS15, OS17 i a
extractelor lipopeptidice metanolice i butanolice fa de Fusarium oxysporum var. lycopersici, dup
96 ore la 280C
Analiznd rezultatele obinute la tulpinile de interes B. subtilis B1 i B2, putem spune c
lipopeptidele produse de B2 sunt mult mai active dect cele produse de tulpina B1, avnd o
activitate antifungic mult mai pregnant fa de A. tenuis.
S-au realizat preparate microscopice pentru a vizualiza modificrile hifelor fungice n urma
interaciilor cu extractele metanolice ale lipopeptidelor produse de tulpina bacterian B2 (fig. 5.3
fig. 5.21 din tez).

Fig. 5.3 (Fig. 5.21 Tez): Modificrile hifelor fungice de Alternaria tenuis n urma interaciilor cu
extractele lipopeptidice metanolice ale tulpinii bacteriene Bacillus subtilis B2

Se constat ngroarea hifelor, ntreruperi ale membranelor citoplasmatice, condensarea

citoplasmei i ruperea membranelor, observndu-se formaiuni asemntoare unor picturi la captul
hifelor, care ar putea fi coninut cioplasmatic.
Pentru a demonstra posibilitatea obinerii unui biopreparat din una sau mai multe tulpini
bacteriene care au capacitatea de a produce biosurfactani, s-au fcut interacii ntre tulpinile
bacteriene testate, pentru a evidenia dac apar reacii antagoniste, de inhibare a creterii coloniilor
bacteriene. Din observaiile preliminare s-a constatat c tulpinile bacteriene B2, OS15 i OS17
prezint un uor antagonism fa de BW. Tulpinile bacteriene B2, OS15 i OS17 nu prezint

17
Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului i a culturilor horticole

antagonism ntre ele, ceea ce ar favoriza folosirea acestor tulpini pentru obinerea unui biosurfactant
care s prezinte activitate antifungic bun fa de F. oxysporum var. lycopersici i alte specii
fungice care produc daune culturilor de tomate i ardei.
Pentru folosirea tulpinilor bacteriene precum i a compuilor cu activitate de surfactant n
combaterea biologic a agenilor patogeni i bioremediere, se impune determinarea toxicitii
bacteriilor de interes. n acest scop noi am folosit metoda BACTOX, o analiz rapid care folosete
ca organism senzor, protozoarul ciliat Tetrahymena pyriformis. Acesta este nepatogen, are form de
lacrim i poate fi folosit n medii ieftine. Pentru testarea toxicitii s-au folosit tulpinile bacteriene
B1 i B2. Testarea propriu-zis s-a realizat pe plci de culturi tisulare cu 12 orificii, n care s-au
pipetat suspensia de protozoare i cea bacterian. Monitorizarea s-a fcut prin observarea fiecrui
orificiu al plcii de culturi tisulare, cu ajutorul unui microscop cu faz inversat dup 10 minute, 2, 4
i 8 ore de incubare. Prin cuantificarea rezultatelor dup o scal adaptat de Shlimme i colab.
(1999), s-a constatat c tulpinile bacteriene testate nu au efecte asupra protozoarului ciliat, ceea ce
corespunde cu un indice de toxicitate de 0% echivalent cu aproximativ 100% protozoare vii.
Prin realizarea obiectivelor propuse n acest capitol putem meniona ca element de noutate
demonstrarea viabilitii tulpinii B2 n medii de cultur lichide cu adaos de ulei de motor, ca unica
surs de carbon. S-a observat c tulpina bacterian a rmas activ din punct de vedere metabolic i
dup 20 zile de incubare n mediile cu ulei de motor. Prin testele realizate s-a observat emulsionarea
uleiului de motor n toate mediile de cultur folosite, ceea ce demonstreaz c tulpina B2 produce un
compus lipopeptidic extracelular cu activitate de biosurfactant.
n acest capitol cercetrile au fost extinse i prin demonstrarea unei activitii antifungice
bune a extractelor lipopeptidice produse de tulpina bacterian B2 fa de A. tenuis. De asemenea s-a
evideniat efectele extractelor metanolice ale lipopeptidelor produse de tulpina B2 fa de hifele
fungice de A. tenuis, concretizate prin ngroarea hifelor, condensarea citoplasmei, ruperea pereilor
celulari, observndu-se formaiuni asemntoare unor picturi, mai ales la captul hifelor.
Un alt aspect important prezentat n acest capitol const n absena antagonismului ntre
tulpinile bacteriene cu potenial antifungic testate. Acesta este un avantaj important n perspectiva
folosirii tulpinilor respective pentru obinerea unui biopreparat cu activitate antifungic.
Un alt aspect de noutate l constituie testarea toxicitii tulpinilor B1 i B2 asupra
protozoarului Tetrahymena pyriformis. S-a demonstrat c aceste tulpini nu au efecte negative asupra
organismului test menionat, extrem de sensibil la modificrile aprute n mediu, astfel c tulpinile

18
Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului i a culturilor horticole

bacteriene B1 i B2 pot fi folosite n combaterea biologic, iar biopreparatele care ar putea fi

obinute pot fi sigure pentru mediu.

CONCLUZII GENERALE

1. n experimente au fost utilizate 20 probe de sol i de ap prelevate din diferite zone ale rii:
5 probe de sol contaminat cu hidrocarburi provenit din Ploieti Prahova, din apropierea
zonelor de extracie petrolier; 5 probe de sol din localitatea Techirghiol, de pe un teren
poluat cu deeuri menajere, ape reziduale menajere i hidrocarburi (n special benzin i
motorin); 5 probe de ap din Marea Neagr din zona Cazinoului i zona Pescrie,
Constana; 5 probe de ap din lacul Techirghiol.
2. Metoda de izolare a bacteriilor din sursele naturale poluate a permis obinerea unui numr
total de 80 colonii izolate a cror morfologie a fost examinat. Toate cele 80 de colonii
bacteriene au fost testate pe mediu ce conine ulei uzat, pentru alegerea izolatelor capabile de
a produce biosurfactani. Dintre noile izolate bacteriene, numai 28 au fost capabile de a
forma emulsii stabile n mediul testat.
3. Pentru c scopul principal al cercetrilor este acela de a identifica noi tulpini bacteriene
capabile de a manifesta proprieti utile i care s fie sigure pentru mediu i pentru om, deci
s nu fie patogene, studiile s-au concentrat asupra bacteriilor Gram-pozitive, aparinnd
genului Bacillus. De aceea, cele 80 noi izolate au fost examinate n privina caracterului
Gram, selectndu-se n final 18 tulpini Gram-pozitive, dintre care doar 10 au manifestat
capacitatea de a produce compui tensioactivi.
4. Pentru a limita i mai mult numrul de bacterii de studiat, cele 10 de izolate Gram-pozitive
posibil capabile de a produce biosurfactani au fost examinate i n privina activitii
antifungice, fa de o tulpin de Alternaria alternata (A. tenuis). n final doar dou tulpini
bacteriene au prezentat proprietile dorite, ele fiind notate B1 (izolat din sol poluat cu
hidrocarburi din Ploieti, Prahova) i B2 (izolat din probele de sol poluat cu deeuri
menajere, ape reziduale menajere i hidrocarburi - motorin, benzin, recoltate din
localitatea Techirghiol).
5. Deoarece aplicaiile practice ale oricrui organism nou sunt condiionate, ntre altele, de
identificarea speciei creia i aparine, n experimente a fost utilizat o abordare polifazic

19
Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului i a culturilor horticole

pentru identificarea celor dou tulpini bacteriene. Metodele aplicate au fost variate: sistemul
BIOLOG, tehnica FISH i metode moleculare (ARDRA, PCR-specie specific).
6. Prin utilizarea sistemului BIOLOG s-a ajuns la concluzia c cele dou izolate ar aparine
speciei B. subtilis, cu o probabilitate de aproximativ 85%. Tehnica FISH a permis
diferenierea ntre dou noi izolate aparinnd genului Bacillus i un izolat Gram-negativ,
aparinnd genului Pseudomonas. Sondele moleculare utilizate au condus la evidenierea
unor deosebiri dar nu au permis identificarea speciilor crora le aparin izolatele testate.
7. Metodele moleculare constituie, de regul, metodele ce asigur confirmarea de precizie a
ncadrrii taxonomice a unor noi izolate. Deoarece condiia de baz pentru a realiza
asemenea experimente este izolarea i purificarea ADN genomic, s-au testat mai multe
metode de izolare, cele mai bune rezultate fiind obinute cu ajutorul kit-ului comercial
Promega. De asemenea, prin aplicarea tehnicilor moleculare bazate pe tehnologia PCR
pentru analiza regiunilor din ADN ce codific sinteza ARNr respectiv ARNt, a fost
confirmat faptul c tulpinile bacteriene B1, B2 i B17 (tulpina de referin) aparin aceleiai
specii, Bacillus subtilis.
8. Tulpinile bacteriene, B1 i B2 au manifestat, in vitro, activitate inhibitoare fa de mai multe
specii de fungi fitopatogeni: tulpini de A. alternata izolate de pe ardei sau de pe roii,
Fusarium oxysporum var. lycopersici i, parial fa de Pytium spp., dar nu au avut efect
inhibitor clar fa de Sclerotium bataticola i Rhizoctonia solani. Efectele antagoniste au fost
mai evidente n cazul tulpinii B2, tulpina respectiv fiind folosit pentru teste in vivo.
9. n urma testrilor in vivo s-a constatat c tulpina B2 manifest o activitate de stimulare a
creterii rsadurilor de ardei sau roii. De asemenea, cele dou tulpini bacteriene, n prezena
fitopatogenului A. alternata f.sp. lycopersici la roii sau A. tenuis (A. alternata) la ardei au
asigurat protecie pentru plantele tratate fa de infecia fungic.
10. Cercetrile ce au avut ca scop determinarea unora dintre mecanismele de aciune ale
bacteriilor care au determinat stimularea creterii plantelor, au permis evidenierea producerii
de ctre tulpina B2 a unei cantiti importante de acid indolil acetic (IAA).
11. Prin examinarea microscopic a efectelor produse in vitro asupra hifelor de A. alternata, de
interaciunea cu tulpinile bacteriene B1 i B2, s-au constatat o serie de alungiri ale hifelor,
ngrori ale peretelui celular, plasmoliz, fragmentarea membranelor citoplasmatice i
ruperea peretelui celular cu eliberarea coninutului citoplasmatic. Efectele produse de
bacterii asupra fungilor int se datoreaz unor compui solubili, excretai de celulele

20
Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului i a culturilor horticole

bacteriene n mediu i care acioneaz la distan (inhibarea creterii fungilor nu implic un

contact direct cu celulele bacteriene).
12. Prin cultivarea tulpinilor bacteriene pe mediile de MSM cu 30 g/l sucroz i McKeen cu
2,5% glucoz nu s-au observat diferene semnificative n privina profilului curbelor de
cretere i a acumulrii de biomas. n experimentele ulterioare a fost utilizat mediul
McKeen pentru faptul c se folosete glucoza ca unic surs de carbon, iar creterea
bacteriilor a fost mai bun, permind producerea unei cantiti mai mari de biosurfactani.
13. Pentru evidenierea i cuantificarea producerii de biosurfactani s-au utilizat dou metode:
testul rspndirii petrolului i testul emulsionrii. La tulpinile B1 i B2 s-a observat o aciune
de dispersare ridicat fa de kerosen i kerosen cu motorin, ceea ce sugereaz c acestea
produc substane tensioactive. De asemenea, cele mai mari valori ale indicelui de
emulsionare fa kerosen i kerosen cu motorin au fost nregistrate la tulpinile B2 i BW
(71,35% cu 60,37% i respectiv 64,03% cu 53,05%). De remarcat c indicele de emulsionare
fa de uleiurile vegetale testate (uleiul de floarea soarelui i cel de msline) a fost ridicat la
toate tulpinile bacteriene testate, ceea ce sugereaz posibile aplicaii pentru degradarea
uleiurilor vegetale uzate.
14. Capacitatea tulpinilor bacteriene selectate de a produce biosurfactani, n principal din
categoria lipopeptidelor a fost examinat i prin utilizarea unor tehnici moleculare. Astfel, au
fost folosite dou perechi de primeri, specifici pentru dou gene bacteriene implicate in
producerea iturinului (pentru genele ituD i lpa-14). S-a constatat c n genomul tulpinilor
B1 i BW se gsesc ambele gene int, observndu-se clar ambii ampliconi specifici
(ampliconul de 1203 pb pentru gena ituD i cel de 675 pb corespunztor genei lpa-14), n
timp ce la tulpina B2 aceti produi au fost abseni. Aceasta sugereaz faptul c tulpina B2 ar
putea s produc alte tipuri de biosurfactani lipopeptidici: surfactin, fengycin sau ali
membri ai familiei lipopeptidice iturin (mycosubtilin, bacillomycin L, D i F).
15. Studierea particularitilor biosurfactanilor bacterieni ca i a efectelor antifungice este
condiionat de extracia acestora. Metoda aplicat a permis obinerea unui sediment de
culoare brun glbui (biosurfactantul brut) care a fost supus cromatografiei n strat subire,
pentru separarea componentelor specifice. Spoturile de culoare violet evideniate pe plcile
cu silicagel au indicat prezena lipopeptidelor la toate tulpinile bacteriene testate.
16. Pentru evidenierea unor eventuale aplicaii practice ale bacteriilor selectate, au fost
optimizate condiiile de cultivare n vederea obinerii unei cantiti crescute de biomas

21
Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului i a culturilor horticole

celular. Pentru aceast testare au fost selectate mediile de cultur lichide MSM1, MSM2 i
McKeen cu adaos de ulei de motor ca unica surs de carbon, acestea permind tulpinii B2 o
cretere semnificativ i meninerea viabilitii pe o perioada lung de timp (cel puin 20
zile). Datele obinute sunt relevante, superioare celor raportate n literatura de specialitate
pentru tulpini bacteriene similare (aparinnd aceleiai specii sau unor specii nrudite): astfel,
procentul de biodegradare al uleiului de motor uzat obinut cu tulpina B2 a fost de
aproximativ 66,67%, ceea ce confer tulpinii respective importan n procesul de
bioremediere a unor medii poluate cu astfel de produse.
17. Extractele de biosurfactani bacterieni au fost examinate n vederea evidenierii efectului
antifungic, demonstrndu-se c extractele lipopeptidice de la tulpinile bacteriene B2 i BW
au activitate antifungic bun fa de A. tenuis. S-au obinut valori ale eficacitii extractelor
lipopeptidice metanolice i butanolice de 77,50% i 78,75% pentru tulpina bacterian BW, n
timp ce la tulpina B2 valorile au fost de 73,75% i respectiv 77,50%.
18. Extractele metanolice ale lipopeptidelor produse de tulpina bacterian B2 acioneaz asupra
hifelor fungice de A. tenuis, determinnd ngroarea hifelor, condensarea citoplasmei,
ntreruperi ale membranelor citoplasmatice i ruperea membranelor observndu-se
formaiuni asemntoare unor picturi, n principal la captul hifelor.
19. Datele obinute n legtur cu potenialul antifungic al biosurfactanilor produi de bacteriile
selectate evideniaz faptul c acestea sunt capabile de efecte importante, posibil sinergice.
Din acest motiv, pentru o eventual condiionare a culturilor bacteriene n vederea obinerii
de biopreparate cu activitate antifungic, este important ca tulpinile bacteriene utilizate s nu
manifeste antagonism ntre ele. Rezultatele au evideniat absena acestui antagonism, ceea ce
nseamn c ele ar putea fi folosite pentru obinerea unui biopreparat cu activitate antifungic
fa de unele specii fungice.
20. Utilizarea practic a unor biopreparate microbiene este deseori blocat de lipsa informaiilor
legate de inocuitatea acestora. Din acest motiv, pentru tulpinile bacteriene selectate a fost
aplicat, pentru prima dat n Romnia, testul BACTOX, una dintre puinele metode de
determinare a ecotoxicitii att a bacteriilor ct i a produilor microbieni folosii n
combaterea biologic. Testul s-a realizat prin co-incubarea bacteriilor cu protozoarul ciliat de
ap dulce Tetrahymena pyriformis, dovedindu-se c tulpinile bacteriene B1 i B2 nu au
efecte toxice asupra acestuia (rezultatele au artat un indice de toxicitate de 0% ceea ce
corespunde cu aproximativ 100% protozoare vii). Faptul c aceste tulpini bacteriene nu au

22
Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului i a culturilor horticole

efecte negative asupra protozoarului T. pyriformis, organism test extrem de sensibil la

modificrile aprute n mediu, demonstreaz c tulpinile bacteriene selectate ar putea fi
utilizate n cadrul unor tehnologii de bioremediere a mediilor poluate cu hidrocarburi i/sau
de obinere de biopreparate antifungice.

CONTRIBUII ORIGINALE ALE TEZEI

Tema de cercetare propus prezint importan la nivel internaional, prin faptul c poate
contribui la elaborarea unor metode biotehnologice netoxice pentru mediu, utile pentru protecia
plantelor i pentru bioremedierea solurilor poluate, n general, cu hidrocarburi. Dei exist produse
biologice pe baz de microorganisme deja comercializate, cercetrile n acest domeniu vor prezenta
interes deoarece pot fi utilizate noi microorganisme pentru producerea biosurfactanilor. Abordarea
cercetrilor n cadrul acestei teze prezint noutate i originalitate, mbinnd o gam divers de
metode de studiu n vederea identificrii i evidenierii aplicaiilor unor microorganisme utile din
punct de vedere practic.
Materialul biologic utilizat n experimente este nou, tulpinile bacteriene selectate fiind pentru
prima dat descrise i utilizate pentru evidenierea capacitii de a utiliza uleiul uzat i, n acelai
timp, de a inhiba o serie de ageni fitopatogeni. Din acest punct de vedere, rezultatele obinute au
caracter de originalitate: tulpinile bacteriene selectate manifest simultan proprieti antagoniste fa
de fungi fitopatogeni precum i capacitate de a degrada o serie de hidrocarburi poluante pentru
mediu. S-a analizat capacitatea tulpinilor bacteriene izolate de a crete pe medii de cultur cu ulei
uzat de motor, pentru evidenierea capacitii bacteriilor de a utiliza uleiul uzat i de a fi folosite n
aplicaii de bioremediere.
Prin studierea cineticii i parametrilor care influeneaz producerea biosurfactanilor
bacterieni realizat n cadrul acestei lucrri, sunt create bazele pentru o optimizare viitoare a
proceselor biotehnologice n care acestea ar fi utilizate, putndu-se astfel obine bioproduse la un
nivel de cost sczut, produse care pot nlocui, n anumite situaii, o parte a produselor chimice care
au dezavantajul c sunt toxice i prezint risc de poluare a mediului. S-a descris o metod de
extracie a compuilor lipopeptidici, care a fost adaptat prin studierea unui numr mare de tehnici
de extracie folosite pe plan internaional.
S-au fcut studii privind toxicitatea tulpinilor bacteriene izolate i respectiv a compuilor
produi de acestea fa de organisme acvatice dulcicole, Tetrahymena pyriformis, ceea ce constituie

23
Obinerea de biosurfactani i utilizarea lor n protecia mediului i a culturilor horticole

un element de noutate pe plan naional i internaional i contribuie la dezvoltarea cunotinelor n

acest domeniu.
S-a studiat activitatea antifungic a tulpinilor bacteriene izolate i, mai ales, a
biosurfactanilor produi de acestea, pentru obinerea unui biopreparat care s poat fi folosit n
combaterea biologic a fungilor patogeni care produc pagube culturilor legumicole de tomate i
ardei.

24