12/11/2009

Metode de
analiz a genelor

Expresia genelor Expresia genelor

ADN ARNm Protein Caracter ADNmut ARNmmut Proteinan Caracteran

5-ATTGCAAGATTACCATGT
5- ATTGCAAGATTACCATGT--3 Catena codogen (netranscris) 5-ATT
5- ATTA
ACAAGATTACCATGT
CAAGATTACCATGT--3 mutaie G4A
3--TAACGTTCTAATGGTACA
3 TAACGTTCTAATGGTACA--5 Catena anticodogen (transcris) 3--TAA
3 TAAT
TGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA--5
Transcripie Transcripie
5--AUUGCAAGAUUACCAUGU
5 AUUGCAAGAUUACCAUGU--3 ARNm 5--AUU
5 AUUAACAAGAUUACCAUGU
CAAGAUUACCAUGU--3 ARNmmut

Translaie Translaie
Leu Ala Arg Leu Pro Cys polipeptid Leu Thr Arg Leu Pro Cys polipeptidan
Maturizare
Caracter fenotipic normal Caracter fenotipic anormal

Utilizarea tehnicilor de analiz a

Analiza genelor
acizilor nucleici n medicin
Analiza ADN:
ADN ARN Proteine depistarea mutaiilor genice diagnostic precis al bolilor
genetice (prenatal, postnatal precoce);
Secveniere Northern-blot Western-blot
identificarea polimorfismului individual dactiloscopie
PCR RTPCR Secveniere genomic (analiza filiaiei);
depistarea ADN strin (bacterian, viral) diagnosticul
Southern-blot Hibridare in situ Analiza funciei
bolilor infecioase i gradului de infectare.

Hibridare in situ Analiza Analiza ARNm:

histochimic analiza expresiei genice esut-specific;
evaluarea gradului de expresie a genei normale /
patologice.

1
 12/11/2009

Obinerea FR fragmentelor de restricie prin

aciunea specific a ER (enzimelor de restricie)

RFLPs polimorfismul FR la dou persoane X i Z

-
12 kb

10 kb 10 kb

8 kb

6 kb 6 kb
2,5 kb

10 kb 5 kb
6 kb 4 kb
5 kb
2,5 kb
2 kb

+
M

PCR
Tehnici de analiz a genelor reacia ciclic de polimerizare
PCR Principiile PCR clonarea in vitro = amplificare
Southern - blot Replicare semiconservativ, repetat
Secvenierea ADN Specificitatea primerilor sintetici pentru gena
gena
int
Hibridizarea ADN-
ADN-int primer
Principii de baz complementar:
Denaturare termic a ADN - de cercetat
Etapele principale
Modificarea ciclic a temperaturii:
Componente necesare (la general) Denaturare
Indicaii i limite Renaturare
Sintez

2
 12/11/2009

Clonarea in vitro PCR

(reacia ciclic de polimerizare a noilor
copii de ADN)

Componentele necesare pentru Etapele tehnicii PCR

clonarea in vitro (PCR):
- ADN de cercetat
- Primeri specifici secvenei de clonat
complimentari secvenelor flancante
- Taq-polimeraza ADN-polimeraz termostabil
- Dezoxiribonucleozidtrifosfai (dNTP)
- Instalaie de modificare ciclic a temperaturii:
- t de denaturare ADN
- t de renaturare (ADN+primer)
- t de polimerizare (elongarea catenelor noi de
ADN)
A. Pregtirea amestecului cu toate componentele reactante
B. Repetarea automat a procedurilor de denaturare-
renaturare-elongare de 30-35 ori
Denaturarea ADN la 96oC
Rcirea pn la temperatura de renaturare a primerilor
Elongarea catenelor ADN la 72oC
C. Analiza produilor PCR
- electroforeza
- colorarea
- interpretarea rezultatelor

Extragerea ADN Pregtirea Amplificarea

componentelor pentru
ADN-int
PCR

Electroforeza Colorarea i Interpretarea

produilor PCR vizualizarea produilor rezultatelor
PCR

3
 12/11/2009

Avantajele PCR
Utilizarea PCR
Metod rapid
Metod ieftin Identificarea inseriilor/deleiilor nucleotidice
Utilizarea cantitilor mici de material analizat Identificarea mutaiilor punctiforme (substituiile
Nu necesit izotopi radioactivi nucleotidice)
Interpretarea uoar a rezultatelor Identificarea expresiei genice (RT(RT--PCR
PCR))
Dactiloscopia genomic (filiaie)
Dezavantajele PCR Identificarea agenilor infecioi
Identificarea gradului de infecie (quantitative
(quantitative PCR)
PCR)
Necesitatea cunoaterii secvenei nucleotidice
amplificate
Necesitatea primerilor sintetici, specifici
secvenei analizate

Identificarea inseriilor / deleiilor Identificarea mutaiilor punctiforme

Identificarea agenilor infecioi

4
 12/11/2009

Stabilirea paternitii (filiaiei) Tehnica

Southern-blot
Bazat pe RFLPs
Hibridizare cu sonde marcate
Cu transferul FR din gel-electroforez pe un
suport solid (pe membrane de nitroceluloz)

Hibridarea acizilor nucleici

Tehnica Southern-
Southern-blot
Unirea complementar a fragmentelor
(moleculelor) de acizi nucleici:
ADN de cercetat cu
sonda oligonucleotidic Extragerea ADN Restriia ADN Electroforeza ADN

n reacie particip molecule monocatenare

Moleculele ADN-
ADN-int sunt fixate
Moleculele
Moleculele--sonde sunt marcate radioactiv sau
fluorescent Denaturarea i Hibridare cu sonda Autoradiografia
Identificarea complexelor hibride se realizeaz transferul ADN
pe membrane Vizualizarea i
prin intermediul autoradiografiei interpretarea
rezultatelor

Utilizarea tehnicii RFLPs i analiza genotipului

Southern--blot
Southern
Alela Normal cu 3 SR Alela mutant cu 2 SR, mutaie n SR2

Identificarea inseriilor / deleiilor mari

Identificarea mutaiilor punctiforme ce C (mm)
afecteaz SR
Dactiloscopia genomic RFLPs B (Nm)

A (NN)

Electroforeza FR a 3 persoane A,B i C

5
 12/11/2009

Tehnica
Northern-blot
Northern-
Extragerea ARN din esutul int

Electroforeza ARN n condiii de

denaturare

Transfer pe membran de
nailon

Hibridarea cu sonda marcat

Autoradiografia

Tehnica Northern-
Northern-blot Utilizarea tehnicii
Northern--blot
Northern
Identificarea expresiei genice n anumite
Extragerea ARN Electroforeza ARN esuturi, anumite condiii

Identificarea variantei de splicing a proARNm

Identificarea nivelului de expresie

Hibridare cu sonda Autoradiografia
Transferul ARN Identificarea agenilor infecioi (ribovirusuri)
pe membrane Vizualizarea i
interpretarea
rezultatelor

Identificarea nivelului
de expresie i a variantei
de splicing

6
 12/11/2009

Secvenierea ADN ADNmutARNmmut Proteinan Caracteran

Stabilirea secvenei de nucleotide

5-ATT
ATTA
ACA
CAA
AGATTACCATGT
GATTACCATGT--3 mutaie G4A
3--TAA
3 TAAT
TGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA--5
Metoda chimic (tehnica Maxam-
Maxam-Gilbert, 1973
1973)
Transcripie

Metoda dideoxi (tehnica Sa

Sanger, 1975
1975) 5-AUU
AUUAACA
CAA
AGAUUACCAUGU
GAUUACCAUGU--3 ARNmmut

Translaie
Metoda automat (cu utilizarea agenilor fluoresceni) Leu Thr Arg Leu Pro Cys polipeptidan

Caracter fenotipic anormal

5-ATTACA
ATTACAA
3--TAA
3 TAAT
AGATTACCATGT
GATTACCATGT--3 catena codogen
TGTTCTAATGGTACA
codogen
GTTCTAATGGTACA--5 catena anticodogen (matri)
Tehnica dideoxi
3-TAA
3-TAAT
TGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA--5 Sinteza enzimatic a
5-ATTA
ATTACC-3
5-ATTA -- primer marcat P32 ADN
3-TAA
3-TAAT
TGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA--5
5-ATTA
ATTACCA-3 pentru ADN-polimeraz Utilizarea n paralel a
3-TAA
3-TAAT
TGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA--5 A, T, C, T dNTP (2
(2-dNTP)
5-ATTA
ATTACA
CAA
A-3 nucleotidelor ce
pentru sinteza noilor catene
3-TAA
3-TAAT
TGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA--5 conin deoxiriboz i
5-ATTA
ATTACA
CAA
AG-3 A, T, C, T ddNTP (2
(2,3
,3-ddNTP
dNTP))
pentru stoparea sintezei
dideoxiriboz
3-TAA
3-TAAT
TGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA--5
5-ATTA
ATTACA
CAA
AGA-3 Stoparea sintezei n
3-TAA
3-TAAT
TGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA--5
5-ATTA
ATTACA
CAA
AGA
GAT
T-3 cazul incorporrii
ddNTP
3-TAA
3-TAAT
TGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA--5
5-ATTA
ATTACA
CAA
AGAT
GATTT-3

5-ATTA
ATTAC
CA-3
5-ATTA
ATTACA
CAA
A-3 Tehnica dideoxi
A 5-ATTA
ATTACA
CAA
AGA-3
Extragerea ADN
5-ATTA
ATTACA
CAA
AGATT
GATTA
A-3 Denaturarea ADN
5-ATTA
ATTACA
CAA
AGATTACC
GATTACCA
A-3
A T C G Sinteza catenelor
5-ATTA
ATTACA
CAA
AGA
GAT
T-3 - complementare utiliznd
5-ATTA
ATTACA
CAA
AGAT
GATTT-3 primeri marcai cu 32P n
T prezena dNTP i ddNTP
5-ATTA
ATTACA
CAA
AGATTACCA
GATTACCAT
T-3
Electroforeza n condiii
5-ATTA
ATTACA
CAA
AGATTACCATG
GATTACCATGTT-3
de denaturare
5-ATTA
ATTACA
CAA
AG-3 Vizualizarea fragmentelor
G
5-ATTA
ATTACA
CAA
AGATTACCAT
GATTACCATGG-3 marcate prin
5-ATTA
ATTAC
C-3 autoradiografie
C 5-ATTA +
ATTACA
CAA
AGATTA
GATTAC
C-3
5-ATTA
ATTACA
CAA
AGATTAC
GATTACC
C-3 5-ATTA
ATTACA
CAA
AGATTACCATGT
GATTACCATGT--3

7
 12/11/2009

-
Metoda automat

(+) 5' TAAATGGCTA

TAAATGGCTA.......3'(-)

Hibridarea in situ Hibridarea in situ pentru

depistarea secvenelor ADN
Pregtirea
preparatelor de
cromozomi

Denaturarea ADN

Hibridarea cu sonda
marcat

Vizualizarea la
Hibridarea in situ cu Hibridarea in situ cu
microscopul optic
utilizarea preparatelor utilizarea preparatelor
de cromozomi metafazici cu nuclei interfazici

Hibridarea in situ
pentru depistarea
secvenelor ARN

Hibridarea in situ cu Analiza

utilizarea probei sens (stnga) histochimic
i antisens (dreapta) identificarea
proteinelor n esut

8
 12/11/2009

Rolul practic al tehnicilor de analiz a acizilor

nucleici:
1. Cercetare secvenierea ADN, formarea bibliotecilor de
gene, studiul expresiei genice, studiul mecanismelor de
reglare, studiul consecinelor mutaiilor.
2. Depistarea persoanelor purttoare de mutaii patologice
- prenatal sau postnatal, cu scop de prevenire a naterii
copiilor cu anomalii genetice sau manifestrii unor
patologii severe.
3. Terapie genic (alegerea genei int, construirea
vectorilor de gene etc.).
4. Depistarea ADN strin (viral sau bacterian) n
diagnosticul bolilor infecioase.
5. Identificarea polimorfismelor individuale n analiza
filiaiei, n criminalistic.