Plantele transgenice: metode şi strategii pentru aplicaţii practice

GABRIELA ŢENEA

Institutul de Genetică, Departamentul de Transgeneză şi Epigenetică, Aleea Portocalelor

nr.1-3, Bucureşti

Transformarea genetică a plantelor, proces cunoscut şi sub numele de “transgeneză”

reprezintă la ora actuală principalul instrument de cercetare din biologia plantelor dar şi un
instrument important din punct de vedere practic pentru ameliorarea plantelor de cultură. Prin
caracteristicile noi dobândite de plantele transgenice sunt raportate cu o frecvenţă foarte
ridicată: rezistenţa la ierbicide, la insecte, virusuri, obţinerea de plante cu sterilitate
citoplasmatică masculină precum şi obţinerea de plante de interes în scop medical.
Plantele reprezintă principala sursă de farmaceutice şi substanţe chimice fine şi de
aceea, procesele cu privire la transformarea acestora au crescut în ultimii ani, astfel că se
poate vorbi de procese care implică modificarea a peste 30 de specii de plante cu importanţă
din punct de vedere economic.
Transgeneza este unul din domeniile ingineriei genetice vegetale iar la ora actuală cele
mai importante strategii şi probleme care se pun sunt concentrate asupra înţelegerii ştiinţifice
şi dezvoltării tehnice a unor sisteme bine puse la punct pentru transformarea a numeroase
specii de plante.
Capacitatea de a introduce şi exprima diferite gene străine la plante a fost descrisă
pentru prima dată în 1984 la tutun (De Block M., De Sonville A., Debrouwer D., 1995) şi
apoi a fost extinsă la peste 120 specii de plante aparţinând a cel puţin 35 de familii. Succesul
transformării genetice a plantelor s-a concretizat prin obţinerea de plante ornamentale, plante
de cultură cu proprietăţi îmbogăţite, plante medicinale, fructe, etc.
Procesele de diversificare şi rafinament a tehnicilor de transformare pentru
convenienţă, eficacitate mare, genotipuri variate şi caracteristici moleculare superioare vor
continua cu efecte de lungă durată, astfel că transferul genelor şi regenerarea de plante
transgenice sunt factori limitativi ai dezvoltării şi aplicării sistemelor de transformare practică
pentru multe specii de plante.
Atenţia cea mai mare în procesul transformării este dată de studiul interacţiei şi
expresiei genelor străine-transgenelor- introduse în plante şi interacţia acestora cu genomul
plantei gazdă.
Ingo Potrykus în 1991 a încercat să evalueze procesul transformării genetice a
plantelor bazându-se pe definirea adevărată a transformării integrative, recurgând la
combinaţii genetice, fenotipice şi date fizice (Potrykus I., 1991). Din păcate, combinaţiile
utilizate nu au putut fi dovedite şi practic la unele specii de plante. De exemplu, analiza
descendenţilor unei populaţii de copaci este foarte dificilă deoarece reproducerea sexuată este
înceată, iar propagarea vegetativă la unele specii de plante de cultura, cum ar fi sfecla de
zahăr, este foarte complicată datorită poliploidizării sau aneuploidizării genetice. Similar, o
corelare strânsă între datele fenotipice şi fizice nu este o caracteristică definitorie a metodelor
de transfer a genelor, deoarece mulţi transformanţi nu exprimă aceste copii de gene introduse.
73
 GABRIELA ŢENEA

Capacitatea de a introduce şi exprima (sau inactiva) genele specific în plante

furnizează o putere nouă instrumentului experimental permiţând testarea directă a câtorva
ipoteze din fiziologia plantelor care sunt deosebit de dificil de rezolvat utilizând alte
caracteristici biochimice (Coruzzi G., Puigdomenech P., 1994). Câteva dintre aceste exemple
includ: analize de genetică moleculară a semnalelor celulare ce controlează reproducerea
sexuată şi interacţia microorganism-plantă; rolul enzimelor specifice în procesele metabolice
determinând poziţionarea fotosintezei şi nu în ultimul rând rolul enzimelor specifice şi
hormonilor specifici procesului de dezvoltare (Newbigen E., Smyth DR., Clarke AE., 1995).
Principalele necesităţi în procesele de transfer a genelor pentru obţinerea de plante
transgenice sunt: (a) capacitatea de a ţinti ţesuturi ce includ celule competente pentru
regenerarea plantelor; (b) o metodă de a introduce ADN în aceste celule regenerabile şi (c) un
procedeu de a selecta şi regenera plantele transformate cu o frecvenţă satisfăcătoare.
La ora actuală prin utilizarea sistemelor de transformare cu Agrobacterium
tumefaciens şi Agrobacterium rhizogenes, precum şi prin bombardamentul cu particule
învelite în ADN, este posibilă introducerea de ADN în orice tip de celulă de plantă. Numai o
mică proporţie din aceste celule ţintite nu vor accepta molecula de ADN în timpul acestui
tratament şi numai o mică proporţie din aceste celule vor supravieţui tratamentului şi
integrării stabile a ADN nou introdus. De asemenea, este general esenţial de a detecta
eficienţa transformării prin selecţia celulelor transformate comparativ cu cele netransformate,
care sunt în exces faţă de primele şi de a stabili această eficienţă a transformării prin punerea
la punct a unor condiţii de regenerare de plante dintr-o singură celulă transformată.
Din punct de vedere practic este necesară utilizarea unor tehnici alternative de
evaluare a transformării şi anume:
(a) găsirea ţesutului ţintă; ex: resursele necesare menţinerii unui supliment continuu de
explante cum ar fi embrioni imaturi la un stadiu corect de dezvoltare pentru
transformare.
(b) eficienţă ridicată, economică, reproductibilă, pentru a produce mulţi transformanţi
independenţi pentru testare practică.
(c) simplitate tehnică, implicând un minim de manipulări variabile cum ar fi producerea
de protoplaşti şi regeneranţi.
(d) cotransformarea frecventă cu gene multiple, cum ar fi o proporţie ridicată de linii de
plante selectate pentru expresia unor gene marker.
(e) selecţia sau screeningul eficient de a obţine plante transgenice din celule transformate.
(f) minimul de timp în realizarea culturilor de ţesuturi, reducerea costurilor asociate şi
evitarea indizerabilă a variaţiei somaclonale.
(g) obţinerea de transformanţi uniformi şi stabili, pentru speciile cu propagare vegetativă
sau linii germinale fertile pentru speciile cu propagare sexuală.
(h) capacitatea de a introduce secvenţe de ADN fără secvenţe de vectori.
(i) patternul simplu de integrare şi număr mic de copii a genelor introduse, minimizează
probabilitatea indizerabilă de dezagregare a genelor la situsul de inserţie, sau
multicopii asociate silenţierii genelor (Birch R.G.,1997).
(j) aplicabilitate opţională de transformare a genomurilor organelare.

Strategii de realizare a transformării

În prezent cele mai utilizate tehnici de realizare a transformării la plante sunt:
• Transformarea protoplaştilor;
• Bombardamentul biolistic sau cu microproiectile;
• Transformarea mediată de Agrobacterium.

74
 Plantele transgenice: metode şi strategii pentru aplicaţii practice

Dar care dintre aceste metode este cea mai utilizată? Răspunsul la această întrebare
depinde de foarte mulţi factori, de exemplu, de interesele economice, cum ar fi transformarea
la porumb, care depinde de accesibilitatea ţesutului, tipurile de echipamente accesibile.
Metodele alese sunt extinse la obţinerea de genotipuri de elită, care sunt uneori mai puţin
accesibile la condiţiile de cultura in vitro(Haymes, K.M., Davis T.M., 1998).
Este foarte instructiv să considerăm că există specii de plante cum ar fi orezul, care sunt
considerat a fi recalcitrante la transformare, dar care acum pot fi transformate datorită
utilizării tehnicilor de bombardament cu particule a embrionilor imaturi, culturilor de celule
sau utilizarea transferului direct mediat de Agrobacterium direct asupra calusului embriogenic
(Hiei I., Ohta S., Komari T., Kumashiro T., 1994).
În fiecare caz, succesul transformării înseamnă: identificarea (sau producerea de
culturi de ţesuturi cu multe celule regenerative) optimizarea parametrilor pentru transfer de
gene în celule şi punerea la punct a proceselor de selecţie şi regenerare a plantelor
transgenice obţinute (fig.1)(Cao J., Duan X., McElroy D., Wu R., 1992).

Identificarea Explante
relativă a disponibile
transformării

Medii şi
Dezvoltarea de hormoni
sisteme de culturi
de ţesuturi
Mod de
regenerare
Identificarea
celulelor
regenerabile Frecvenţa
regenerării
Nesatisfăcător
Satisfăcător
Agenţi de
selecţii/startegii

Accesibilitatea
Construcţi genici regeneranţilor

Transfer de gene Parametrii Parametrii

Agrobacterium microproiectilelor

Selecţia sau Expresie

screeningul tranzientă
Nesatisfăcător

Regenerare Distrugere
celulară

Caracterizare Satisfăcător

Figura 1. Caracteristici generale ale sistemelor de transformare la speciile de plante recalcitrante.

Tranformarea protoplaştilor
Dintre sistemele de transformare, transformarea utilizând protoplaşti este una dintre
metodele care necesită mare fineţe. Protoplaştii sunt izolaţi fiecare printr-un proces mecanic
sau enzimatic prin îndepărtarea peretelui celular. Aceste rezultate de producere a unei
75
 GABRIELA ŢENEA

suspensii cu milioane de celule individuale oferă avantajul probabil de ţintire a unei singure
celule. Protoplaştii sunt frecvent obţinuţi de la o suspensie de linii celulare stabilite, de la
calus obţinut din embrioni imaturi, inflorescenţe imature, mezocotil, frunze imature bazale şi
antere (Maheshwari N., 1995). Interesant este faptul că multe suspensii celulare pot fi
criopreservate şi silenţiate menţinând capacitatea de a forma calus şi regenera plante
(DiMaio,J.J., Shillito R.D.,1989).
Protoplaştii pot fi de asemenea transformaţi cu Agrobacterium, acest proces fiind facilitat
de tratamentul cu polietilenglicol, electroporare sau lipozomi. Aceste sisteme de utilizare a
protoplaştilor pentru transformare sunt eficiente în cazul monocotiledonatelor (Shillito R.,
Carswell G., Kramer C.M., 1994).

Transformarea biolistică
Biolistica este o metodă ce utilizează microproiectile de tungsten sau de aur care sunt
acoperite cu ADN şi propulsează în celulele ţintă prin acceleraţie. Această acceleraţie poate fi
produsă de o puşcă cu putere, cu gaze sau cu dioxid de carbon sau heliu, sau prin descărcare
electrică (Finer J.J., Finer K.R., Ponnapa T., in press). Prin această metodă se pot introduce
secvenţe de ADN în orice ţesut, dar succesul depinde de capacitatea ţesutului ţintă de a
prolifera şi da naştere la o plantă fertilă.
Alternanţe minore în protocolul standard biolistic produc risipe destul de ridicate. Acest
proces include:
• Precultura adecvată a explantelor materiale;
• Utilizarea unor microproiectile de dimensiuni mici;
• Supunerea ţesutului la un pretratament osmotic prin uscare parţială într-o capotă cu flux
laminar sau cultivarea într-un mediu ce conţine un agent osmotic.
Un exemplu elocvent în acest sens îl reprezintă transformarea porumbului care a fost deosebit
de ridicată în aceste condiţii (Radolph-Anderson, B., 1995).
Analiza moleculară a plantelor obţinute prin transformare biolistică, în general, relevă
un patern destul de complex al genelor integrate. La aceasta se adaugă faptul că introducerea
unor fragmente mari de ADN se realizează datorită rupturilor care există în ADN-ul introdus.
Pe de altă parte, destinul ADN-ului introdus nu este foarte clar, ligarea fragmentelor de ADN
transgenic înaintea integrării este propusă a justifica dacă ADN transgenic se introduce în
acelaşi situs în genomul plantei (Pawlowski W.P., Somers D.A., 1998). Acesta poate rezulta
prin reducerea expresiei transgenei prin co-supresie.

Transformarea mediată de Agrobacterium

Capacitatea naturală a microorganismelor de a transforma plante este la ora actuală cea
mai utilizată metodă cunoscută şi sub numele de metodă de transformare mediată de
Agrobacterium. Bacteriile de sol din genul A.tumefaciens şi A.rhizogenes sunt agenţi cauzali
ai unor boli la plante si anume producerea de gale în formă de coroană, respectiv rădăcini
firoase (Tepfer D., 1990).
În timpul procesului de transformare, un segment specific al vectorului, ADN-T, care
poate conţine markeri de selecţie şi/sau gene de interes, este transferat de la bacterie în celula
gazdă a plantei şi inserat în genomul nuclear. Aceste funcţii sunt mediate de un set de gene de
virulenţă cu o expresie optimă la un pH acid şi în prezenţa inductorilor fenolici, cum ar fi
acetosiringona, care se produc prin rănirea celulelor plantei (Hamilton C.M., 1996) (fig.2).
Sistemul Agrobacterium este foarte utilizat deoarece este uşor de realizat iar costurile de
realizare sunt foarte scăzute. Mai mult, plantele transgenice obţinute prin această metodă
conţin frecvent inserţii de copii unice. Aceste avantaje au condus la adaptarea acestui sistem

76
 Plantele transgenice: metode şi strategii pentru aplicaţii practice

la multe specii de plante dicotiledonate dar şi monocotiledonate. Acum, este posibil de a

tranfera fragmente mari de ADN (150kb) în genomul nuclear al plantelor.

Figura 2. Diagrama schematică a procesului de infecţie cu Agrobacterium. Căile critice care au loc în
bacterie (semnale chimice, genele vir de inducţie, Procesarea ADN-T), şi în plantă (ataşarea bacteriei, transferul
ADN-T, ţintirea nucleului, integrarea ADN-T), precum şi genele şi/sau proteinele cunoscute a media aceste
evenimente.

Agrobacterium rhizogenes este utilizat cu succes pentru transferul de gene la multe

specii de dicotiledonate, la locul infecţiei formându-se multe rădăcini adventive, fenomen
cunoscut sub numele de „hairy roots”. Infecţia este urmată de transferul unui fragment din
ADN, ADN-T, conţinut într-o plasmidă Ri-ADN, direct în genomul nuclear al plantei.
Plasmida Ri constă din ADN-T, secvenţe de graniţă şi suprafaţa de virulenţă. ADN-T conţine
genele rol (loci rol) A,B,C,D, care conferă capacitatea de diferenţiere de rădăcini în celulele
transformate. Există şi gene care activează sinteza diferitelor clase de opine, cum ar fi cele
implicate în procesul de catabolism. Opinele sunt substanţe naturale unice, pseudoaminoacizi
cum ar fi octopine, nopaline, agrocinopine, care servesc ca nutrienţi, ca sursă de carbon şi
azot, şi ca substanţe specifice de creştere a patogenităţii bacteriei. Suprafaţa de virulenţă
conţine diferite gene vir care sunt silenţiate, deoarece ele nu intră în genomul plantei dar sunt
necesare pentru transferul ADN-T.
Similar cu transformarea mediată de A.rhizogenes, A.tumefaciens este de asemenea
capabil să infecteze plantele. ADN-T de transfer este inserat într-o plasmidă Ti care induce
schimbări metabolice şi genetice în celulele plantei rezultând gale sub formă de coroană. Aşa
cum s-a menţionat la A.rhizogenes, plasmida Ti de la A.tumefaciens este şi ea purtătoare de
gene care codifică pentru enzime responsabile de sinteza şi catabolismul unor aminoacizi
cunoscuţi sub numele de opine. Aceste tipuri de opine, depind de tulpina bacteriană utilizată
şi de asemenea reprezintă un caracter de distincţie între cele doua tulpini de Agrobacterium.
Importanţa şi avantajul utilizării sistemului Agrobacterium este că prin tehnologia
ADN-recombinant şi ingineria genetică se pot transfera o multitudine de gene într-o celulă
gazdă.

77
 GABRIELA ŢENEA

Selecţia transformanţilor
Selecţia este o parte importanţă a proceselor de transformare. În general, genele de
interes sunt co-integrate cu markeri selectabili pentru identificarea cu uşurinţă a celulelor
recipiente transformate. Markerii de selecţie cei mai utilizaţi conferă rezistenţă la agenţi
chimici, cum ar fi antibiotice şi ierbicide (Wilmink A., Dons J.J. M., 1993). Manozo-6 fosfat
izomeraza (MPI) este unul dintre cei mai recenţi markeri de selecţie. Enzima este codificată
de gena manA de la E.coli, care converteşte monoza-6P în frucozo-6P. Astfel, transformanţii
ce conţin manA pot creşte pe manoză ca sursă de carbon. Această selecţie este un mod pozitiv
al acţiunii de creştere a ţesuturilor transformante cu o rată care să-i permită acest lucru.
Markerul MPI este extrem de eficace pentru selecţia transformanţilor de sfeclă (0,94%),
porumb (50%) şi grâu (25%) (HansenG., Wright M.S., 1999).
Markerii de selecţie pot fi utilizaţi într-o primă generaţie şi eliminaţi mai târziu prin
încrucişare convenţională. O posibilitate este de a obţine două ADN-T separate; una cu gene
de interes şi alta cu markeri de selecţie, în aceeaşi sau două celule diferite de Agrobacterium.
Cele două ADN-T sunt inserate în situsuri nelincate în genomul plantei gazdă, permiţând mai
târziu segregarea genetică (Yoder J.I., Goldsbrough, A.P., 1994).
Transformarea optimă se caracterizează printr-o singură copie a transgenei care va
segrega mendelian cu o expresie uniformă de la o generaţie la alta. Transformanţii ideali pot fi
identificaţi cu dificultate, depinzând de materialul vegetal care va fi transformat şi de
cantitatea şi complexitatea transgenelor. O genă inserată este esenţial randomizată în genom,
se observă o variabilitate de la o plantă transgenică la alta, fenomen cunoscut sub numele de
„variaţie cu efect de poziţie” (Gelvin S.B., 1998; Matzke A.J., Matzke M.A., 1998;Vaucheret
H., 1998).

Perspective
Transformarea genetică a plantelor rămâne totuşi o “artă”, deoarece procesul diferă de
la o plantă la alta iar condiţiile de mediu sunt caracteristice fiecărei specii în parte.
Eficacitatea procesului de transformare constă în faptul că cel puţin una dintre speciile de
plante care nu au fost manipulate anterior în cultură, trebuie să se adapteze la protocolul
stabilit şi să dea naştere la o plantă nouă, cu caracteristici noi. Există de asemenea o practică
necesară pentru metodele de transformare care vor scade în complexitatea paternului de
integrare şi expresie a transgenelor. În prezent, sunt comercializate multe plante transgenice
ce prezintă alteraţii ale unei singure gene.
Pe de altă parte, înţelegerea evenimentelor referitoare la procesele de integrare şi
expresie a ADN-ului străin în genomul celulei gazdă este aparentă, multe întrebări au rămas
totuşi fără răspuns. Există celule ţintă sau ţesuturi care sunt mai mult receptibile la
transformare? Există un stadiu fiziologic care permite o transformare mai eficientă? Pot fi ele
manipulate astfel încât să se obţină o eficienţă ridicată a transformării? Toate ţesuturile alese
ca ţintă prezintă modificări ale nivelului de expresie genică? Dacă Agrobacterium este utilizat
cu susses în transformare prin faptul că expresia transgenelor este mult mai frecventă, atunci
poate fi acest lucru atribuit pe seama integrării ADN-T în regiunea telomerică ? ( Hoopen
R.T., 1996).
Tehnologiile de transformare prezintă avantaje din punct de vedere al comercializării
multor plante. Introducerea multor transgenice pe piaţă este o cale multiplă a procesului de
înregistrare a noi varietăţi de plante. În cele mai multe ţări comercializarea cu plante
transgenice este mai întâi cercetată şi aprobată prin stabilirea unor reguli stricte de autorităţile
fiecărui guvern naţional al ţării respective, care trebuie să se asigure că produsele sunt
inofensive atât pentru mediu cât şi pentru consumatori.

78
 Plantele transgenice: metode şi strategii pentru aplicaţii practice

Bibliografie selectivă
1. BIRCH R.G., 1997, Plant transformation: problems and strategies for practical
application,, Annu.Rev.Plant.Physiol.Plant.Mol.Biol.,48, 297-326;
2. CAO J., DUAN X., MCELROY D., WU R., 1992, Regeneration of herbicide resistant
transgenic rice plants following microprojectile mediated transformation of suspension
culture cells, Plant Cell Rep 11, 586-591;
3. CORUZZI G., PUIGDOMENECH P., 1994, Plant molecular Biology, Molecular genetic
analysis of plant development and metabolism, Berlin: Spring Verlag;
4. DE BLOCK M., DE SONVILLE A., DEBROUWER D., 1995, The selection mechanism
of phosphinotricin is influenced by the methabolic state of the tissue, Planta 197, 619-626;
5. DIMAIO,J.J., SHILLITO R.D.,1989, Cryopreservation technology of transgenes to R1
progeny, J.Tissue Cult.Methods 12, 163-169;
6. FINER J.J., FINER K.R., PONNAPA T., Particle bombardament-mediated
transformation, Current topics in microbiology and imunnology 240, Plant biotechnology:
New products and Application) Hammond J., McGarvey P.B., Yusibov V., eds.,) in press;
7. GELVIN S.B., 1998, The introduction and expresion of transgenes in plant,
Curr.Opin.Biotecnol., 9, 227-232;
8. HAMILTON C.M., 1996, Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant
chromosomes, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 26, 2135-2142;
9. HANSENG., WRIGHT M.S., 1999, Recent advances in the transformation of plants,
Trends in plant science 4, 226-231;
10. HAYMES, K.M., DAVIS T.M., 1998, Agrobacterium mediated transformation of alpine
Fragaria vesca and transformation of transgenes to R1 progeny, Plant.Cell.Rep, 17, 279-
283;
11. HIEI I., OHTA S., KOMARI T., KUMASHIRO T., 1994, Efficinet transformation on rice
(Oryza sativaL) mediated by Agribacterium and sequences analysis of the boundaries of
the ADN-T, Plant Journal 6, 271-282;
12. HOOPEN R.T., 1996, Localization of T-DNA insertion in Petunia by fluorescence in situ
hybridization: physicali evidence for suppresion of recombination, Plant Cell 8, 823-830.
13. MAHESHWARI N., 1995, In vitro culture of wheat and genetic transformation-retrospect
and prospect, Crit.Rev.Plant. Sci.14, 149-178;
14. MATZKE A.J., MATZKE M.A., 1998, Position effects and epigenetic silencing of plants
transgenes, Curr.Opin.Plant Biol.1, 142-148;
15. NEWBIGEN E., SMYTH DR., CLARKE AE., 1995, Understanding and controling plant
development, Trends Biotechnology 13, 338-343;
16. PAWLOWSKI W.P., SOMERS D.A., 1998, Transgenic DNA integrated into the oat
genome in freqvently interspersed by host DNA, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 95, 12106-
12110;
17. POTRYKUS I., 1991, gene transfer to plants: assesement of publisched approaches and
results, Annu.Rev.Plant.Physiol.Plant.Mol.Biol.42,205-225;
18. RADOLPH-ANDERSON, B., 1995, Sub-micron gold particles are superior to larger
particles for efficient biolistic transformation of organelles and some cell types, BioRad
Bulletin, 2015;
19. SHILLITO R., CARSWELL G., KRAMER C.M., 1994, Maize protoplast culture, The
Maize Handbook, (Freedling M., Walbolt V.,) Springer, 695-700;
20. TEPFER D., 1990, Genetic transformation using Agrobacterium rhizogenes,
Physiol.Plant., 79, 140-146;
21. VAUCHERET H., 1998, Transgene-induced gene silencing in lant, Plant J. 16, 651-659;
79
 GABRIELA ŢENEA

22. WILMINK A., DONS J.J. M., 1993, Selective agents and marker genes for use in
transformation of monocotyledonous plants, Plant Mol.Biol.Rep.11, 165-185;
23. YODER J.I., GOLDSBROUGH, A.P., 1994, Transformation systems for generating
marker-free transgenic plants, Biotechnology 12, 142-148;

80