UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ

CLUJ-NAPOCA

ŞCOALA DOCTORALĂ

FACULTATEA DE ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII

Chim. VICTORIŢA BURIAN (BONTA)

TEHNICI CROMATOGRAFICE PENTRU

DETERMINAREA CONTAMINANŢILOR DIN
MIEREA DE ALBINE

REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT

Conducător ştiinţific

Prof. Univ. Dr. LIVIU ALEXANDRU MĂRGHITAŞ

Cluj-Napoca

2011

I
 CUPRINS

Pag.
Pag.
rezu-
teza
mat
INTRODUCERE 9 1
PARTEA ÎNTÂI : STUDIU BIBLIOGRAFIC 11
1. SURSE DE CONTAMINARE A PRODUSELOR APICOLE 12 2
1.1. CONTAMINAREA DATORATĂ UNOR FACTORI DIN
13
MEDIU
1.2. CONTAMINAREA DATORATĂ PRACTICILOR APICOLE 17
2. CLASIFICAREA SI STRUCTURA PRINCIPALILOR
22
CONTAMINANŢI (ANTIBIOTICE ŞI PESTICIDE)
3. METODE DE IDENTIFICARE ŞI CUANTIFICARE A
31 2
ANTIBIOTICELOR ŞI PESTICIDELOR DIN MIERE
3.1. METODE DE SCREENING 32
3.2. CROMATOGRAFIA LICHIDĂ DE ÎNALTĂ PERFORMANŢĂ
34
(HPLC) CU DIFERITE TIPURI DE DETECŢIE
3.2.1. Principiul cromatografiei lichide 34
3.2.2. Tehnici de extracţie 37
3.2.3. Detectori utilizaţi în cromatografia lichidă 39
3.3. CROMATOGRAFIA GAZOASĂ CUPLATĂ CU
47
SPECTROMETRIE DE MASĂ (GC-MS)
3.3.1. Principiul cromatografiei gazoase 47
3.3.2. Interfeţe utilizate în cromatografia GC-MS 50
3.3.3. Detectori utilizaţi în cromatografia gazoasă 52
3.4. APLICAŢII ALE CROMATOGRAFIEI ÎN DETERMINAREA
54
CONTAMINANŢILOR DIN MIERE
3.4.1. Stadiul cunoaşterii în determinarea reziduurilor de
55
tetracicline din miere
3.4.2. Stadiul cunoaşterii în determinarea reziduurilor de
57
cloramfenicol din miere

II
 3.4.3 Stadiul cunoaşterii în determinarea reziduurilor de
59
pesticide din miere
PARTEA A DOUA : CERCETĂRI PROPRII 64
4. SCOP ŞI OBIECTIVE 65 3
5. DETERMINAREA REZIDUURILOR DE TETRACICLINE
(TETRACICLINA ŞI OXITETRACICLINA) DIN MIERE PRIN 66 3
TEHNICA HPLC-PDA
5.1. MATERIALE 66 3
5.2. METODĂ 67 4
5.2.1. Dezvoltarea metodei de determinare a reziduurilor de
67 4
tetracicline
5.2.2. Validarea metodei de determinare a reziduurilor de
76 5
tetracicline
5.2.3. Aplicabilitatea metodei dezvoltate şi validate 79
5.3. REZULTATE ŞI DISCUŢII 80 5
5.4. CONCLUZII PARŢIALE 91 7
6. DETERMINAREA REZIDUURILOR DE CLORAMFENICOL
92 8
DIN MIERE PRIN TEHNICA LC-MS
6.1. MATERIALE 93 8
6.2. METODĂ 93 8
6.2.1. Dezvoltarea metodei de determinare a reziduurilor de
93 8
cloramfenicol
6.2.2. Validarea metodei de determinare a reziduurilor de
101 9
cloramfenicol
6.2.3. Aplicabilitatea metodei dezvoltate şi validate 103
6.3. REZULTATE ŞI DISCUŢII 104 10
6.4. CONCLUZII PARŢIALE 107 11
7. DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE
ORGANOCLORURATE ŞI ORGANOFOSFORICE DIN MIERE 108 12
PRIN TEHNICA GC-MS
7.1. MATERIALE 108 12

III
 7.2. METODĂ 109 12
7.2.1. Dezvoltarea metodei de determinare a reziduurilor de
109 12
pesticide
7.2.2. Validarea metodei de determinare a reziduurilor de
120 14
pesticide
7.2.3. Aplicabilitatea metodei dezvoltate şi validate 122
7.3. REZULTATE ŞI DISCUŢII 122 14
7.4. CONCLUZII PARŢIALE 131 16
8. FACTORI EXTERNI CE INFLUENŢEAZA STABILITATEA
PESTICIDELOR ORGANOCLORURATE ŞI 133 16
ORGANOFOSFORICE
8.1. INFLUENŢA RADIAŢIILOR UV ASUPRA REZIDUURILOR
134 16
DE PESTICIDE DIN MIEREA CONTAMINATĂ
8.1.1. Materiale 134 17
8.1.2. Metodă 135 17
8.1.3. Rezultate şi discuţii 136 17
8.1.4. Analiza statistică a datelor 151
8.2. INFLUENŢA TRATAMENTELOR DE IRADIERE ASUPRA
162 23
PARAMETRILOR DE CALITATE AI MIERII
8.2.1. Metode de determinare a parametrilor fizico-chimici
162 23
ai mierii
8.2.2. Rezultate şi discuţii 166 23
8.3. CONCLUZII PARŢIALE 170 23
9. CONCLUZII GENERALE ŞI RECOMANDĂRI 171 24
BIBLIOGRAFIE 174
LISTA LUCRĂRILOR PUBLICATE 189
ANEXE 193

IV
 INTRODUCERE

Mierea este un produs natural cu valoare biologică şi calorică ridicată. Apicultura

furnizează produse cu mare valoare profilactică şi terapeutică, ce contribuie la menţinerea
sănătăţii umane, iar din punct de vedere economic, această ramură de activitate îşi aduce
aportul la bunăstarea populaţiei.
În ultimii ani, a fost menţionată în multe publicaţii problema pe care o ridică
contaminarea mierii şi a celorlalte produse apicole cu reziduuri de antibiotice şi pesticide,
substanţe cu efecte toxice acute şi cronice asupra sănătăţii consumatorului.
Se impune ca structurile de cercetare să dezvolte metodologii noi, performante, în
vederea monitorizării reziduurilor de antibiotice şi pesticide, pentru a promova libera
circulaţie internaţională a produselor apicole româneşti şi recunoaşterea acestora pe piaţa
produselor naturale autentice.
Lucrarea « Tehnici cromatografice pentru determinarea contaminanţilor din
mierea de albine » cuprinde următoarele părţi: introducere, studiu bibliografic, obiective,
cercetări proprii, concluzii, referinţe bibliografice şi anexe.
În această teză s-a urmărit dezvoltarea unor metode analitice cromatografice de
înaltă precizie şi sensitivitate, care să asigure detectarea şi cuantificarea unor reziduuri de
antibiotice şi pesticide din miere, în scopul protejării consumatorului. Deasemenea, a fost
studiată posibilitatea reducerii efectului dăunător al mierii contaminate cu pesticide, prin
procedeul tratamentului cu ultraviolet.
Studiul bibliografic, structurat în 3 capitole, cuprinde informaţii referitoare la căile
de contaminare a produselor apicole, structura şi proprietăţile principalilor contaminanţi şi
evaluarea tehnicilor cromatografice moderne utilizate la determinarea acestor compuşi.
Partea de cercetări proprii, sistematizată în 4 capitole, descrie metodele analitice
propuse pentru determinarea reziduurilor de tetracicline, cloramfenicol, pesticide
organoclorurate şi organofosforice din miere, algoritmul de validare a acestor tehnici,
precum şi rezultatele obţinute.
Deasemenea, s-a realizat un studiu care a urmărit influenţa radiaţiilor UV asupra
reziduurilor de pesticide din mierea contaminată şi în paralel, asupra parametrilor de
calitate ai mierii.

1
 Capitolul 1. SURSE DE CONTAMINARE A PRODUSELOR APICOLE

La contaminarea produselor apicole contribuie mediul poluat precum şi substanţele

utilizate de apicultori pentru controlul bolilor în coloniile de albine.
Principalii contaminanţi proveniţi din mediu sunt: metalele grele, izotopii
radioactivi, poluanţii organici, pesticidele, bacteriile patogene şi organismele modificate
genetic. Pericolul de contaminare a produselor apicole provine într-o mai mare măsură din
practicile apicole, decât din mediul înconjurător, prin utilizarea acaricidelor şi
antibioticelor împotriva bolilor din stup : Varroa şi Loca Europeană sau Americană.

Capitolul 3. METODE DE IDENTIFICARE ŞI CUANTIFICARE A

ANTIBIOTICELOR ŞI PESTICIDELOR DIN MIERE

Se impune dezvoltarea şi îmbunătăţirea metodelor analitice pentru monitorizarea

nivelelor antibioticelor şi pesticidelor în miere, urmărindu-se atingerea unor limite de
detecţie şi cuantificare cât mai scăzute.
Testarea probelor de miere, în vederea stabilirii posibilelor contaminări cu reziduuri
de antibiotice şi pesticide se realizează prin:
• Metode de screening, utilizate pentru indentificarea probelor de miere pozitive: testele
ELISA, Charm II şi ROSA.
• Determinări cantitative a probelor pozitive, prin tehnicile HPLC, LC-MS şi GC.
Cromatografia lichidă de înaltă performanţă (HPLC) este cea mai extinsă tehnică
cromatografică utilizată pentru analiza antibioticelor. Prin cuplarea cromatografului de
lichide cu spectrometrul de masă s-a obţinut un instrument de analiză performant, capabil
să separe, să identifice şi să cuantifice componenţii din cele mai complexe probe. Pe
parcursul anilor, sistemele LC-MS au suferit transformări semnificative, pornind de la
analize simple ca un înlocuitor al tradiţionalului UV şi ajungând la analize calitative şi
cantitative foarte exacte.
Reziduurile de pesticide sunt în general analizate prin gaz cromatografie cuplată cu
diferiţi detectori, cum ar fi ECD (captură de electroni), NPD (nitrogen-fosfor) sau MS
(spectrometru de masă).

2
 Capitolul 4. SCOP ŞI OBIECTIVE

Datorită efectelor negative pe care le au produsele apicole contaminate cu reziduuri

de antibiotice şi pesticide asupra consumatorilor, este absolut necesară verificarea calităţii
acestora prin metode sigure, care să confere rezultate de încredere.
Obiectivul general urmărit se referă la dezvoltarea şi validarea unor metode
moderne performante de tip lichid şi gaz cromatografic de determinare a reziduurilor de
antibiotice şi pesticide din miere.
Obiectivele punctuale se referă la:

Determinarea reziduurilor de tetracicline prin tehnica HPLC-PDA (capitolul 5)

Determinarea reziduurilor de cloramfenicol prin tehnica LC-MS (capitolul 6)

Determinarea reziduurilor de pesticide organoclorurate şi organofosforice prin tehnica
GC-MS (capitolul 7)

Studiul posibilităţii de diminuare a conţinutului de pesticide din mierea contaminată,
prin iradiere UV (capitolul 8).

Capitolul 5. DETERMINAREA REZIDUURILOR DE TETRACICLINE

(TETRACICLINA ŞI OXITETRACICLINA) DIN MIERE PRIN
TEHNICA HPLC-PDA

Determinarea reziduurilor de antibiotice din miere a constituit în ultimii ani o

preocupare generală, deoarece aceşti compuşi pot reduce eficacitatea proprietăţilor
benefice ale mierii, iar dacă se găsesc în cantităţi semnificative, pot reprezenta o
ameninţare gravă pentru sănătatea umană.

5.1. MATERIALE

Dezvoltarea şi validarea metodei cromatografice de identificare şi cuantificare a

reziduurilor de tetracicline din miere s-a bazat pe determinările efectuate pe probe de
miere provenite din stupina disciplinei de Apicultură din cadrul Universităţii de Ştiinţe
Agricole şi Medicină Veterinară Cluj, producţia anului 2007.

3
5.2. METODĂ

Determinarea reziduurilor de tetracicline prin HPLC-PDA este adaptată pentru

matricea “miere” după metoda descrisă în AOAC Official Methods of Analysis (1995)
pentru determinarea acestor antibiotice din lapte.

5.2.1. Dezvoltarea metodei de determinare a reziduurilor de tetracicline

Extracţia şi purificarea reziduurilor de tetracicline din miere se realizează pe

coloniţe MCAC (cromatografie de afinitate utilizând chelaţi metalici).
Sistemul utilizat pentru determinarea tetraciclinelor a fost un cromatograf de lichide
de înaltă performanţă, model Shimadzu seria VP cuplat cu un detector UV-Vis cu reţea de
fotodiode, care permite înregistrarea întregului domeniu spectral în mod continuu, la
intervale de timp de microsecunde, oferind o cantitate mare de informaţii.
Determinarea cromatografică:
Au fost încercate diferite gradiente de concentraţie a fazelor mobile. Varianta
optimă, redată în tabelul 1, a asigurat o separare eficientă a tetraciclinelor, cu rezoluţie
bună şi într-un timp redus.
Tabel 1
Programul de gradient liniar pentru determinarea tetraciclinelor

Timp (min) Faza mobilă A (%) Faza mobilă B (%)

0 74 26
11.5 74 26
13 40 60
17 40 60
19 74 26

Parametrii operaţionali ai sistemului cromatografic:

• Debit de fază mobilă: 1ml/min
• Volum de injectare: 50µl

4
• Temperatura coloanei: 35oC
• Monitorizare λ 360nm (oxitetraciclină) şi λ 355nm (tetraciclină)
• Durata separării: 28 minute

5.2.2. Validarea metodei de determinare a reziduurilor de tetracicline

Determinarea parametrilor de performanţă ai metodei de determinare a

tetraciclinelor prin HPLC-PDA s-a făcut în concordanţă cu cerinţele Ghidului Eurachem
pentru validarea metodelor analitice. Metoda analitică a fost validată prin evaluarea
următorilor parametri: curbă de calibrare, confirmarea identităţii şi specificităţii, precizie,
limită de detecţie şi limită de cuantificare, recuperare, robusteţe, stabilitate.

5.3. REZULTATE ŞI DISCUŢII

Performanţele metodei dezvoltate sunt redate în tabelul 2. A existat linearitate pe

întreg intervalul de concentraţie studiat, aşa cum indică valorile coeficienţilor de corelare
R2, foarte apropiate de valoarea unitară.
Tabel 2
Performanţele metodei

Coeficient de corelare Linearitate

Compus Ecuaţia de regresie
R2 (µg/kg)
Oxitetraciclina Y=0.0135X+0.0 0.9994 5-75
Tetraciclina Y=0.0127X+0.0 0.9995 5-75

Pentru identificarea tetraciclinelor şi a potenţialelor substanţe interferente, am

suprapus cromatogramele obţinute la injectarea unui amestec de standarde (a), a
extractului de miere necontaminată (b) şi a extractului de miere aditivată cu
oxitetraciclină şi tetraciclină (c) (fig. 1). Timpii de retenţie ai standardelor de
oxitetraciclină (7.1 min) şi tetraciclină (8.6 min) au coincis cu cei din proba aditivată, în

5
timp ce pentru proba de miere necontaminată nu s-a înregistrat niciun semnal la aceste
valori. Acest fapt indică absenţa compuşilor de interferenţă matriceali.

7.1

8.6

c
a
b

0 5 10 15
Timp de retentie/Retention time (min)

Fig. 1. Cromatograma unui amestec de tetracicline (a), probă de miere liberă de antibiotice
(b) şi probă de miere aditivată cu amestec de antibiotice (c)

Precizia metodei a fost evaluată prin măsurarea deviaţiei standard relative în

condiţii de repetabilitate şi reproductibilitate, determinările realizându-se pe probe de
miere aditivate cu standarde de tetracicline la 3 nivele de concentraţie. Întrucât valorile
RSD s-au situat de fiecare dată sub 10%, putem considera precizia metodei satisfăcătoare.

Tabel 3
Limitele de detecţie şi cuantificare ale tetraciclinelor

Media concentraţiilor ± SD LOD LOQ

Compus
(µg/kg) (µg/kg) (µg/kg)
Oxitetraciclina 3.32 ± 0.39 4.5 5.5
Tetraciclina 3.08 ± 0.58 4.8 6.3

6
 Din rezultatele prezentate în tabelul 3, se observă că metoda analitică de
determinare a tetraciclinelor dezvoltată este capabilă să detecteze şi să cuantifice
concentraţii de antibiotic mai mici decât valoarea impusă de Legislaţia Europeană
(10µg/kg). Acest fapt îi conferă metodei sensitivitate ridicată.
Recuperarea tetraciclinelor în procente mai mari de 70% este acceptabilă, pierderile
de pe parcursul extracţiei fiind mult mai reduse în cazul oxitetraciclinei, comparativ cu
tetraciclina (tabel 4).
Tabel 4
Procentele de recuperare ale tetraciclinelor
Nivel de aditivare Recuperarea (media ± SD) RSD
Compus
(µg/kg) (%) (%)
10 93.81 ± 3.29 3.50
Oxitetraciclina 15 95.89 ± 5.39 5.63
20 98.96 ± 3.19 3.22
10 75.18 ± 3.49 4.65
Tetraciclina 15 73.75 ± 5.65 7.67
20 73.67 ± 4.60 6.25

5.4. CONCLUZII PARŢIALE

• Metoda pentru determinarea reziduurilor de tetracicline din miere implică extracţia

selectivă a analiţilor prin complexare cu ionii Cu2+, separarea cromatografică şi detectarea
cu un detector UV-Vis cu reţea de fotodiode.
• Tehnica de extracţie aleasă realizează simultan izolarea, curăţarea şi concentrarea
tetraciclinelor, nefiind necesare alte operaţii suplimentare.
• Parametrii de performanţă studiaţi în cadrul validării metodei dovedesc că metoda
dezvoltată se caracterizează prin selectivitate, specificitate, acurateţe, robusteţe şi
sensitivitate ridicate.
• Tehnica HPLC-PDA este eficientă pentru identificarea şi cuantificarea reziduurilor de
tetracicline din diferite sorturi de miere, absenţa interferenţelor matriceale fiind
independentă de originea botanică a mierii analizate

7
 Capitolul 6. DETERMINAREA REZIDUURILOR DE CLORAMFENICOL
DIN MIERE PRIN TEHNICA LC-MS

Tehnica cromatografiei lichide cuplată cu detector de masă (LC-MS) este

recunoscută pentru selectivitatea şi sensitivitatea ridicată pe care le asigură metodelor
analitice de determinare a cloramfenicolului din matrici complexe.

6.1. MATERIALE

Dezvoltarea şi validarea metodei cromatografice de identificare şi cuantificare a

reziduurilor de cloramfenicol din miere s-a bazat pe determinările efectuate pe probe de
miere provenite din stupina disciplinei de Apicultură din cadrul Universităţii de Ştiinţe
Agricole şi Medicină Veterinară Cluj, producţia anului 2009.

6.2. METODǍ

Metoda analitică de determinare a reziduurilor de cloramfenicol este bazată pe

izolarea antibioticului din miere după tehnica descrisă de Shen şi Jiang (2005), cu uşoare
modificări şi utilizarea spectrometriei de masă pentru identificare şi cuantificare.

6.2.1. Dezvoltarea metodei de determinare a reziduurilor de cloramfenicol

Procedura de pregătire a probei este simplă, reziduurile de cloramfenicol se extrag

din miere cu ajutorul sistemului: PBS-acetat de etil-Na2SO4, se separă prin cromatografie
lichidă cu fază inversă şi sunt apoi detectate cu ajutorul spectrometrului de masă echipat
cu sursă de ionizare electrospary şi analizor cuadrupolar.
Determinarea cromatografică:
Pentru separare s-a folosit o coloană cromatografică cu fază inversă Zorbax Eclipse
XDB-C18 , cu dimensiunile 2.1x150mm şi granulaţie 3.5µm. Gradientul de concentraţie al
fazelor mobile utilizat este prezentat în tabelul 5.

8
 Tabel 5
Programul de gradient liniar pentru determinarea cloramfenicolului

Timp (min) Faza mobilă A (%) Faza mobilă B (%)

0.7 100 0
0.75 85 15
5 85 15
12 60 40
14 40 60
14.01 100 0

Parametrii operaţionali ai sistemului cromatografic:

• Temperatură coloană: 25oC
• Temperatură autosampler: 10 oC
• Volum injectat: 50µl
• Debit fază mobilă: 0.3ml/min
• Lungime de undă monitorizare: 278nm
• Durata separării: 28 min
• Voltaj la interfaţă: 4.5KV
• Temperatură la interfaţă: 250oC
• Debit gaz nebulizator: 1.5l/min (N2)
• Selecţie ioni monitorizaţi: m/z 321, 323
• Mod de ionizare: ESI negativ

6.2.2. Validarea metodei de determinare a reziduurilor de cloramfenicol

Protocolul de validare urmat pentru metoda de determinare a reziduurilor de

cloramfenicol din miere este în conformitate cu criteriile Deciziei Comisiei Europene
2002/657/EC. Parametrii de performanţă evaluaţi sunt: curba de calibrare şi linearitatea,
specificitatea, precizia, limita de decizie şi capabilitatea de detecţie, recuperarea.

9
6.3. REZULTATE ŞI DISCUŢII

Curba de calibrare obţinută pentru cloramfenicol a fost realizată prin metoda

standardului extern şi a prezentat linearitate pe întreg intervalul de concentraţie. Datele
regresiei lineare prezentate în tabelul 6 indică o bună corelare între răspunsul detectorului
şi concentraţia analitului. Valorile limitei de decizie şi a capabilităţii de detecţie obţinute
îndeplinesc criteriul stabilit de Decizia Comisiei 2002/657/EC, fiind sub nivelul de
concentraţie de 0.3µg/kg.
Tabel 6

Parametrii regresiei lineare şi limitele analitice pentru cloramfenicol

Coeficient de corelare Linearitate CCα CCβ

Panta Intercept
R2 (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg)
0.142 0.035 0.9999 0.3-25 0.11 0.17

Identificarea cloramfenicolului s-a bazat pe timpul de retenţie cromatografic al

etalonului (13.1min). Confirmarea identităţii compusului s-a realizat prin compararea
spectrelor de absorbţie şi de masă obţinute cu cele corespunzătoare etalonului, înregistrate
în biblioteca de spectre şi prin compararea raţiilor intensităţii ionilor.
S-au comparat cromatogramele obţinute pentru standardul de cloramfenicol, o
probă de miere aditivată cu CAP şi o probă lipsită de antibiotic (blanc) (fig. 2). În
cromatograma mierii blanc nu s-a observat prezenţa niciunui semnal la timpul de retenţie
al cloramfenicolului, fapt ce dovedeşte că niciun alt compus chimic sau matriceal nu a fost
coextras. Absenţa semnalului fals pozitiv indică buna performanţă a metodei analitice.

În urma determinărilor efectuate în condiţii de repetabilitate şi reproductibilitate

pentru evaluarea preciziei metodei, s-au obţinut valori ale deviaţiei standard relative
(RSD) situate sub limitele stabilite de UE: 10%, respectiv 20%.
Recuperările mai mari de 85% obţinute arată eficienţa pregătirii probei. Rezultatele
obţinute sunt prezentate în tabelul 7 şi indică acurateţea ridicată a metodei.

10
 (c)

(b)

(a)

6 8 10 12 14

Timp de retentie/Retention time (min)

Fig.2. Cromatogramele LC-MS-SIM obţinute pentru (a) standardul de CAP, (b) proba de
miere aditivată cu CAP şi (c) proba de miere blanc

Tabel 7
Precizia şi gradul de recuperare (n=6)

Repetabilitate Reproductibilitate
Concentraţia
Concentraţia Concentraţia Recuperare
teoretică RSD RSD
medie±SD medie±SD (%)
(µg/kg) (%) (%)
(µg/kg) (µg/kg)
0.6 0.48 ± 0.021 3.8 0.51 ± 0.042 4.9 85
2 1.68 ± 0.080 5.6 1.74 ± 0.098 7.1 87
5 4.35 ± 0.211 7.7 4.55 ± 0.401 8.9 91

6.4. CONCLUZII PARŢIALE

• Tehnica LC-MS de determinare a reziduurilor de cloramfenicol din miere combină

extracţia simplă, dar eficientă a analitului cu separarea cromatografică adecvată şi detecţia
prin spectrometrie de masă, care asigură certitudine în identificarea acestuia.

11
• Tehnica analitică dezvoltată prezintă sensitivitate ridicată, fiind capabilă să detecteze
concentraţii de cloramfenicol aflate sub limita impusă de Legislaţia Europeană.
• Procedura de validare a urmat toţi paşii necesari pentru a ne asigura de identificarea şi
cuantificarea corectă a reziduurilor de cloramfenicol.
• Este esenţială monitorizarea nivelelor de contaminare cu cloramfenicol atât în mierile de
provenienţă autohtonă, cât şi de import, pentru a asigura sănătatea consumatorului.

Capitolul 7. DETERMINAREA REZIDUURILOR DE PESTICIDE

ORGANOCLORURATE ŞI ORGANOFOSFORICE DIN MIERE PRIN
TEHNICA GC-MS

Utilizate pe scară largă, într-o gamă extrem de variată, pesticidele pătrund în

circuitul biogeochimic al ecosistemelor, iar efectele lor nocive se regăsesc amplificate la
capătul lanţului trofic (organismul uman). Se impune să se acorde atenţie implementării
metodologiilor performante multireziduale, capabile să detecteze un număr cât mai mare
de pesticide printr-o singură determinare.

7.1. MATERIALE

Dezvoltarea şi validarea metodei cromatografice de identificare şi cuantificare a de

pesticidelor din miere s-a bazat pe determinările efectuate pe probe de miere provenite din
stupina disciplinei de Apicultură din cadrul USAMV Cluj, producţia anului 2010.

7.2. METODĂ

Determinarea GC-MS a reziduurilor de pesticide din miere este o metodă

cromatografică multireziduală, care identifică şi cuantifică simultan 37 de compuşi.

7.2.1. Dezvoltarea metodei de determinare a reziduurilor de pesticide

Se transferă reziduurile de pesticide OCL şi OP din miere prin extracţie cu
acetonitril, în prezenţa unor cantităţi mari de săruri (sulfat de magneziu, clorură de sodiu,

12
citrat de sodiu). Purificarea extractului se realizează prin extracţie dispersivă în fază solidă
(dSPE) şi este urmată de concentrarea probei în scopul îmbogăţirii cu analiţii de interes.
Compuşii sunt separaţi prin cromatografie de gaze şi detectaţi apoi prin
spectrometrie de masă.
Determinarea cromatografică:
Separarea compuşilor a fost realizată de stratul activ al coloanei capilare DB-5MS
(lungime 30m, diametru intern 0.25mm, grosimea filmului 0.25µm) şi de programul de
gradient al temperaturii, prezentat în tabelul 8.
Tabel 8
Program coloană

Rata de creştere Temperatura Timp de stagnare

(°C/min) (°C) (min)
- 45 1.00
20 150 5.00
4 200 0.00
2 225 0.00
10 260 0.00
20 300 8.25

Parametrii operaţionali ai sistemului cromatografic:

• Temperatură injector: 250°C
• Temperatură interfaţă GC-MS: 280°C
• Gaz purtător: He, cu debit total de 9 ml/min
• Debit pe coloană: 0.99 ml/min
• Viteza lineară: 36cm/s
• Temperatură coloană: 45oC
• Mod de ionizare: impact de electroni (70eV)
• Mod de detecţie: SIM (monitorizare ioni selectaţi)
• Temperatură sursa ionică: 230°C
• Tensiune la detector: 1.56kV
• Durata separării: 50min

S-a utilizat tehnica de determinare cantitativă în mod SIM (fig. 3).

13
 1000000
7
Abundenta/Abundance (%)

1 8 13
800000 19
17
12 18 26
600000 21 27
16 31
10 33 36
25 30
400000
14 34
11 20 32
4 23
6 9 22 29 35
24
200000 3 37
15 28
2 5
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45
Timp de retentie/Retention time (min)

Fig. 3. Cromatograma GC-MS-SIM a unui amestec de standarde de pesticide

7.2.2. Validarea metodei de determinare a reziduurilor de pesticide

Validarea metodei de determinare a pesticidelor organoclorurate şi organofosforice

din miere este în acord cu criteriile stabilite de Decizia Comisiei Europene 2002/657/EC.
Parametrii de performanţă evaluaţi sunt: curba de calibrare şi linearitatea, confirmarea
identităţii şi specificităţii, precizia, limita de detecţie şi cuantificare, recuperarea.

7.3. REZULTATE ŞI DISCUŢII

Răspunsul detectorului MS a fost linear pe intervalele de concentraţie specificate în

tabelul 9 pentru fiecare pesticid. Sensitivitatea metodei a fost bună pentru majoritatea
compuşilor, detecţia a 30 de pesticide fiind posibilă la concentraţii mai mici de 10µg/kg.
Valorile limitelor de cuantificare au variat în intervalul 3.44-47.22µg/kg, iar valorile RSD
s-au situat între 1.09 şi 13.01% (tabel 9).

14
 Tabel 9
Parametrii de calibrare şi limitele analitice (limita de detecţie şi limita de
cuantificare) pentru pesticidele organoclorurate şi organofosforice

Coeficient
Linearitate Concentraţia ± SD RSD LOD LOQ
Pesticid de corelare
(µg/kg) (µg/kg) % (µg/kg) (µg/kg)
R2
Diclorvos 0.9974 10-500 2.98±0.12 4.06 3.34 3.65
Mevinfos 0.9986 25-500 19.63±0.39 7.08 20.8 21.82
Demeton O 0.9984 10-500 3.91±0.51 13.01 5.44 6.76
Ethoprop 0.9966 10-500 3.33±0.24 7.10 4.03 4.65
Naled 0.9881 50-500 38.57±0.40 10.44 39.78 40.82
Sulfotep 0.9987 10-500 5.46±0.37 6.87 6.59 7.56
Forat 0.9988 10-500 4.49±0.32 7.24 5.46 6.31
α HCH 0.9997 10-500 5.57±0.66 11.94 7.56 9.29
Demeton S 0.9869 25-500 23.43±0.04 1.68 23.55 23.65
β HCH 0.9999 10-500 4.23±0.38 8.98 5.37 6.36
γ HCH 0.9997 10-500 6.56±0.38 5.87 7.71 8.71
Diazinon 0.9984 10-500 4.06±0.40 9.85 5.26 6.30
Disulfoton 0.9988 10-500 4.04±0.28 6.92 4.87 5.60
δ HCH 0.9999 10-500 4.82±0.51 10.57 6.34 7.67
Metil paration 0.9943 25-500 10.44±0.39 3.81 11.63 12.67
Heptaclor 0.9987 10-500 6.00±0.43 7.13 7.28 8.40
Fenclorfos 0.9995 10-500 3.68±0.35 9.42 4.72 5.62
Aldrin 0.9998 10-500 5.79±0.47 8.20 7.22 8.45
Clorpirifos 0.9997 10-500 4.22±0.25 5.97 4.98 5.63
Fention 0.9967 10-500 5.29±0.06 1.09 5.46 5.62
Tricloronat 0.9987 10-500 4.39±0.2 4.54 4.99 5.51
Heptaclor epoxid 0.9999 10-500 5.10±0.25 4.85 5.84 6.49
Stirofos 0.9975 25-500 14.96±0.72 2.89 17.13 19.01
Endosulfan I 0.9998 10-500 5.39±0.30 5.67 6.30 7.10
Tocution 0.9977 10-500 4.21±0.21 5.08 4.85 5.41
4,4’ DDE 0.9999 10-500 4.69±0.36 7.76 5.78 6.73
Dieldrin 0.9999 10-500 5.13±0.35 6.82 6.18 7.09
Endrin 0.9993 10-500 6.57±0.68 9.06 8.62 10.41
Endosulfan II 0.9991 10-500 4.87±0.47 9.66 6.28 7.50
4,4’ DDD 0.9972 10-500 2.24±0.21 9.47 2.88 3.44
Endrin aldehida 0.9979 10-500 4.51±0.28 6.18 5.35 6.07
Bolstar 0.9999 25-500 21.03±0.62 3.42 22.89 24.50
Endosulfan sulfat 0.9938 10-500 4.45±0.45 10.20 5.80 6.98
4,4’ DDT 0.9996 10-500 3.51±0.28 7.84 4.34 5.06
Endrin cetona 0.9996 10-500 6.53±0.41 6.32 7.76 8.84
Metoxiclor 0.9989 10-500 3.04±0.17 5.62 3.55 4.00
Cumafos 0.9939 50-500 45.90±0.24 8.33 46.61 47.22

15
 Confirmarea identităţii compuşilor are la bază compararea spectrului de masă şi a
raţiei abundenţei ionilor de referinţă a fiecărui analit identificat în probă, cu cele ale
standardelor utilizând librăria de spectre.
Un procent de 57% din numărul total de pesticide studiate au prezentat recuperări
cuprinse în intervalul 83%-99%, iar 40% s-au încadrat între limitele 102% şi 117%. Cel
mai slab s-a recuperat endrin aldehida, într-o proporţie de 72%, valoarea fiind acceptată.

7.4. CONCLUZII PARŢIALE

• Tehnica de extracţie QuEchERS utilizată este înalt competitivă pentru analiza GC-MS,
obţinându-se interferenţe foarte reduse.
• Detectorul de masă are selectivitate ridicată şi oferă importante informaţii spectrale, care
asigură identificarea şi cuantificarea fără echivoc a reziduurilor de pesticide.
• Parametrii de validare evaluaţi indică faptul că metoda furnizează rezultate de înaltă
acurateţe şi precizie, iar recuperările sunt foarte ridicate.
• Este necesar să se monitorizeze şi pesticidele a căror utilizare a fost interzisă, în special
cele organoclorurate, întrucât există posibilitatea ca aceşti compuşi să se regăsească în
miere, datorită remanenţei pronunţate care-i caracterizează.

Capitolul 8. FACTORI EXTERNI CE INFLUENŢEAZǍ STABILITATEA

PESTICIDELOR ORGANOCLORURATE ŞI ORGANOFOSFORICE

În mediul ambiant au loc procese care influenţează stabilitatea pesticidelor,

transformându-le în compuşi inactivi, mai puţin toxici. Există trei tipuri de degradare a
pesticidelor: microbiană, chimică şi fotochimică (distrugerea pesticidelor la lumină).

8.1. INFLUENŢA RADIAŢIILOR UV ASUPRA REZIDUURILOR DE PESTICIDE

DIN MIEREA CONTAMINATĂ

Prin analogie cu inactivarea şi scăderea concentraţiilor unor pesticide din mediu

sub influenţa anumitor procese, printre care un rol important îl joacă reacţiile fotochimice,

16
ne-am propus să studiem influenţa radiaţiilor UV asupra stabilităţii unor pesticide
organoclorurate şi organofosforice din mierea contaminată.

8.1.1. Materiale
Pentru realizarea determinărilor, s-au luat în lucru două tipuri de miere: salcâm şi
polifloră, codificate MS, respectiv MP. După aditivarea probelor cu etaloane de pesticide
OCL şi OP, la nivelul de concentraţie 200µg/kg (MSA şi MPA), acestea au fost supuse
acţiunii radiaţiilor UV pentru diferite perioade de timp.

8.1.2. Metodă
Sursa artificială de iradiere cu ultraviolet utilizată a fost lampa UV VL-204.G
(Vilber Lourmat) care emite la lungimea de undă λ=254nm. Timpii de iradiere aplicaţi au
fost: 5, 12, 24, 36, 48, 72 ore.

8.1.3. Rezultate şi discuţii

Pesticidele cu stabilitatea cea mai redusă, îndepărtate din probe în cel mai scurt
timp (36 ore), au fost: stirofos, bolstar, cumafos şi metoxiclor (fig. 4).

100

76,5
Degradation percentage (%)

75
Procent degradare (%)

61,0
53,8 51,0
50
49,4
29,7 27,4
25 Stirofos
22,8 19,8
Bolstar
21,7
Cumafos 16,3
Metoxiclor 4,1
0
5 12 24 36
Timp de iradiere (ore)
Irradiation time (hours)

Fig. 4. Dinamica degradării, exprimată procentual (%), pentru stirofos, bolstar,

cumafos şi metoxiclor în urma iradierii

17
 După 48 ore de expunere la UV, s-au degradat total alte 5 pesticide, dintre care: 3
compuşi organofosforici (naled, metil paration şi fention), a căror rată de descompunere
este ilustrată în figura 5 şi 2 compuşi organocloruraţi (4,4’ DDE şi 4,4’ DDT).

100

77,8
Degradation percentage (%)

75
Procent degradare (%)

65,6
62,3 58,5

50 44,8
45,8
36,3

25 22,1
17,9
Naled
20,5
Metil paration 15,8
Fention 5,1
0
5 12 24 36 48
Timp de iradiere (ore)
Irradiation time (hours)

Fig. 5. Dinamica degradării, exprimată procentual (%), pentru naled, metil paration şi
fention în urma iradierii

100
,2
99

,5

,1
93

91

75
,6
68

,0
Degradation percentage (%)

69
Procent degradare (%)

,6

,7

50
56

59
,1
54

25
,9
,7
,0

34
29
34

,0
11

0
,3

DDD
10

3 8.

5 DDE
12
24 DDT
36
48
72
Timp de iradiere (ore)
Irradiation time (hours)

Fig. 6. Dinamica degradării, exprimată procentual (%), pentru 4,4’ DDT şi metaboliţii săi
în urma iradierii

18
 În timp ce 4,4’ DDT şi 4,4’ DDE nu s-au mai regăsit în probe după 48 ore de
tratament, 4,4’ DDD s-a degradat parţial, un procent de 34.9% persistând chiar şi în urma
timpului maxim de iradiere aplicat (fig. 6).
Alte 4 pesticide organofosforice (diclorvos, mevinfos, forat, clorpirifos) (fig. 7) şi 3
pesticide organoclorurate (aldrin, dieldrin, endrin) nu s-au mai regăsit în probe la
determinarea analitică GC-MS, atunci când timpul de iradiere UV s-a prelungit la 72 ore.

100
90,3

85,6
Degradation percentage (%)

75
Procent degradare (%)

67,8
61,0 58,3
64,5 53,6
57,5
50
40,5 47,2
35,4 45,0
29,5
36,6
Diclorfos 31,5 23,0
25
Mevinfos 20,3
Forat 11,2
Clorpirifos 10,7
0 5,5
5 12 24 36 48 72
Timp de iradiere (ore)
Irradiation time (hours)

Fig. 7. Dinamica degradării, exprimată procentual (%), pentru diclorvos, mevinfos,

forat şi clorpirifos în urma iradierii

Aldrinul şi dieldrinul sunt ambii eliminaţi din probe, în urma a 72 ore de iradiere
UV, diferă însă rata de degradare a acestor 2 compuşi (fig. 8).
În timp ce endrinul nu a mai putut fi identificat în proba MSA-72h, izomerii
acestuia, endrin aldehida şi endrin cetona s-au regăsit în proporţie de 28%, respectiv
17.6% din concentraţiile iniţiale de fortificare (fig. 9).

19
 100

,0
90
75

Degradation percentage (%)

,4
Procent degradare (%)

64
50

,0

,8
58

52

,0
25

39
,2
30

,0

,2
27

26
0

.7
11
5 Dieldrin

6 ,9
12
24 Aldrin
36
48
72
Timp de iradiere (ore)
Irradiation time (hours)

Fig. 8. Dinamica degradării, exprimată procentual (%), pentru aldrin şi dieldrin în urma
iradierii

100
,3
91
,1

,6
83

78

75
,0

,1
82

70
Degradation percentage(%

,1
63
Procent degradare (%)

50
,9

,2
,3

52

50

,0
54

42
,4

,8

25
42

36

,2

,0
33

28
.3

0
,6
21

Endrin aldehida
17
,7

5 Endrin cetona
12

12
24 Endrin
36
48
72
Timp de iradiere (ore)
Irradiation time (hours)

Fig. 9. Dinamica degradării, exprimată procentual (%), pentru endrin, endrin

aldehida şi endrin cetona în urma iradierii

Compusul cel mai stabil a fost sulfotepul, o stabilitate relativ ridicată prezentând şi
pesticidele demeton S, diazinon, α HCH (fig. 10).

20
 98,6 97,5 95,8
100 97,6 95,5 95,1 94,9 95,3 93,3

94,3 89,6
83,9
91,5 89,4 91,1 89,9
Degradation percentage (%)

85,8
Procent degradare (%)

75 68,9
80,0 65,1

62,2
50 56,6
49,7

Sulfotep
25
Demeton O
26,3
Demeton S
Diazinon
0
5 12 24 36 48 72
Durata de iradiere (ore)
Irradiation time (hours)

Fig. 10. Dinamica degradării, exprimată procentual (%), pentru sulfotep, demeton O,
demeton S şi diazinon în urma iradierii

Spre deosebire de demeton S, izomerul acestuia, demeton O a suferit scăderi mai

pronunţate ale concentraţiilor, pentru timpi de iradiere mai mari sau egali cu 36 ore.
Variaţia conţinutului de compuşi HCH este redată în figura 11.
.1

100
.1
90
98

.5
.8
84
.9

94
.7

.6
96

89

.3
89
81
.9

.6
.7
.6
82

.8

75
76
73
.5
85

76
79

.3
Degradation percentage (%)

.8

68
70
.9

.1
Procent degradare (%)

69

68

.3

50
.0
57

54
38
.

.7
.8

47
49

25
.7
31

alfa HCH
0 delta HCH
5 beta HCH
12
24 gama HCH
36
48
72
Timp de iradiere (ore)
Irradiation time (hours)

Fig. 11. Dinamica degradării, exprimată procentual (%), pentru izomerii HCH în
urma iradierii

21
 Restul pesticidelor organofosforice (ethoprop, disulfoton, ronel, tricloronat,
tocution) au fost degradate în diferite proporţii sub acţiunea radiaţiilor UV, procentele
eliminate din probe situându-se între 89.4% (tocution) şi 63.4% (ethotrop).
Produsul transformării fotochimice a endosulfanului care se compune din izomerii
endosulfan I şi endosulfan II, este sulfatul de endosulfan. Cei 3 compuşi au prezentat
variaţii ale concentraţiilor asemănătoare, fiind cuantificaţi după 72 ore de tratare cu UV la
valori apropiate (fig. 12).

,4
100
99
,4
97

,3

71 ,5
75
80

,2
75
,0
76
,6

,2
74

63
Degradation percentage
Procent degradare (%)

,2

50
65

,6
.2
43

,6
44

,1
41
41
25
,5

4,4
37
(%)

,32
,7
28

20
0 Endosulfan I
,7

Endosulfan sulfat
17

5 12 24 Endosulfan II
36
48
72
Timp de iradiere (ore)
Irradiation time (hours)

Fig. 12. Dinamica degradării, exprimată procentual (%), pentru endosulfan I,

endosulfan II şi endosulfan sulfat în urma iradierii

Compuşii organocloruraţi heptaclor şi heptaclor epoxid s-au degradat semnificativ

sub influenţa radiaţiei UV, procente mai mici de 8% menţinându-se în proba după 72 ore
de iradiere.

22
8.2. INFLUENŢA TRATAMENTELOR DE IRADIERE UV ASUPRA
PARAMETRILOR DE CALITATE AI MIERII

8.2.1. Metode de determinare a parametrilor fizico-chimici ai mierii

Parametrii urmăriţi în mierile contaminate cu pesticide şi iradiate UV au fost:

conţinutul de hidroximetilfurfural, indicele diastazic, aciditatea şi conţinutul de zaharuri.

8.2.2. Rezultate şi discuţii

Indiferent de timpul de iradiere, radiaţia ultraviolet nu a afectat în niciun mod pH-ul

mierilor sau concentraţiile de zaharuri şi HMF. Aciditatea mierilor s-a menţinut la valorile
iniţiale, înregistrând uşoare creşteri la timpul maxim de iradiere.
Dintre parametrii fizico-chimici evaluaţi, singurul care a suferit modificări
semnificative a fost indicele diastazic. Amilaza este sensibilă la lumină şi după primele 5
ore de tratament UV s-a degradat considerabil, reducându-şi concentraţia la jumătate. Pe
măsură ce timpul de iradiere a crescut, indicele diastazic a continuat să scadă, ajungând la
valori sub limita prevăzută de Comunitatea Europeană.

8.3. CONCLUZII PARŢIALE

• Radiaţiile UV acţionează benefic asupra mierii ce conţine reziduuri de pesticide,

diminuându-i gradul de contaminare.
• Fotodegradarea pesticidelor este dependentă de timpul de iradiere, intensitatea radiaţiei
şi structura chimică a acestor compuşi.
• Pentru 44% din pesticidele organoclorurate şi organofosforice luate în studiu s-a obţinut
degradarea totală, restul reducându-şi concentraţiile în diferite proporţii.
• Comportamentul reziduurilor de pesticide la aplicarea tratamentului UV a fost similar în
mierea de salcâm şi polifloră.
• Înlăturarea totală sau parţială a pesticidelor din miere prin expunere la ultraviolet nu
implică alterarea calităţii mierii.

23
 Capitolul 9. CONCLUZII GENERALE ŞI RECOMANDǍRI

ELEMENTE DE ORIGINALITATE

1. Dezvoltarea, optimizarea şi validarea unor metode analitice de determinare a unor

contaminanţi ai mierii, utilizând tehnici moderne, dintre care se evidenţiază
cromatografia de lichide cuplată cu detector spectrometru de masă (LC-MS).
2. Utilizarea pentru prima dată în ţara noastră a metodei QuEChERS, în scopul izolării
şi purificării reziduurilor de pesticide din miere.
3. Studierea unui protocol experimental de reducere a toxicităţii mierii contaminate cu
pesticide, prin aplicarea radiaţiilor UV, fără alterarea semnificativă a calităţii mierii.

RECOMANDĂRI ŞI PERSPECTIVE

1. Extinderea monitorizării diferitelor clase de antibiotice şi pesticide la celelalte

produse apicole: polen, păstură, ceară, propolis, lăptişor de matcă.
2. Urmărirea dezvoltării unor metode analitice multireziduale, cu domeniu larg de
aplicare, pentru determinarea unui număr cât mai mare de compuşi într-o singură
analiză.
3. Aprofundarea unei arii de cercetare importante: determinarea metaboliţilor şi
compuşilor de degradare a contaminanţilor din produsele apicole destinate consumului,
în special aceia care sunt consideraţi genotoxici şi cancerigeni.

24
UNIVERSITY OF AGRICULTURAL SCIENCES AND VETERINARY
MEDICINE CLUJ-NAPOCA

DOCTORAL SCHOOL

FACULTY OF AGRICULTURAL SCIENCES AND BIOTECHNOLOGIES

Chim. VICTORIŢA BURIAN (BONTA)

CHROMATOGRAPHIC TECHNIQUES FOR

CONTAMINANTS DETERMINATIONS IN HONEY

SUMMARY OF PhD THESIS

Scientific coordinator

Prof. Univ. LIVIU ALEXANDRU MĂRGHITAŞ, PhD

Cluj-Napoca

2011

25
 CONTENT

PhD Summary
page page

INTRODUCTION 9 29
FIRST PART: BIBLIOGRAPHY STUDY 11
1. THE CONTAMINATION SOURCES OF BEE PRODUCTS 12 30
1.1. CONTAMINATION DUE TO ENVIRONMENTAL
13
FACTORS
1.2. CONTAMINATION DUE TO APICULTURAL
17
PRACTICES
2. CLASSIFICATION AND STRUCTURE OF MAIN
22
CONTAMINANTS (ANTIBIOTICS AND PESTICIDES)
3. METHODS FOR IDENTIFICATION AND
QUANTIFICATION OF ANTIBIOTICS AND PESTICIDES IN 31 30
HONEY
3.1. SCREENING METHODS 32
3.2. HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
34
(HPLC) WITH DIFFERENT DETECTION TYPES
3.2.1. Liquid chromatograpy principle 34
3.2.2. Extraction techniques 37
3.2.3. Detectors used for liquid chromatography 39
3.3. GAS CHROMATOGRAPHY COUPLED WITH MASS
47
SPECTROMETRY (GC-MS)
3.3.1. Gas chromatography principle 47
3.3.2. Interfaces used for GC-MS chromatography 50
3.3.3. Detectors used for gas chromatography 52
3.4. CHROMATOGRAPHIC APPLICATIONS USED FOR
54
HONEY CONTAMINANTS DETERMINATION
3.4.1. State of the art in determining the tetracycline
55
residues in honey

26
 3.4.2. State of the art in determining the chloramphenicol
57
residues in honey
3.4.3. State of the art in determining the pesticides residues
59
in honey
SECOND PART: ORIGINAL RESEARCH 64
4. AIM AND OBJECTIVES 65 31
5. TETRACYCLINE RESIDUES DETERMINATION
(TECTRACYCLINE AND OXYTETRACYCLINE) FROM 66 31
HONEY BY HPLC-DAD
5.1. MATERIALS 66 31
5.2. METHOD 67 32
5.2.1. Method development for tetracycline residues
67 32
determination
5.2.2. Method validation in tetracycline residues
76 33
determination
5.2.3. Aplication of the developed and validated method 79
5.3. RESULTS AND DISCUSSIONS 80 33
5.4. PRELIMINARY CONCLUSIONS 91 35
6. DETERMINATION OF CHLORAMPHENICOL RESIDUES IN
92 36
HONEY BY LC-MS TEHNIQUE
6.1. MATERIALS 93 36
6.2. METHOD 93 36
6.2.1. Development of the method for chloramphenicol
93 36
residues determination
6.2.2. Method validation in chloramphenicol residues
101 37
determination
6.2.3. Aplicability of the developed and validated method 103
6.3. RESULTS AND DISCUSSIONS 104 38
6.4. PRELIMINARY CONCLUSIONS 107 39

27
7. DETERMINATION OF ORGANOCHLORINE AND
ORGANOPHOSPHORUS PESTICIDE RESIDUES IN HONEY BY 108 40
GC-MS TECHNIQUE
7.1. MATERIALS 108 40
7.2. METHOD 109 40
7.2.1. Method development for pesticide residues
109 40
determination
7.2.2. Method validation for pesticide residues
120 42
determination
7.2.3. Aplicability of the developed and validated method 122
7.3. RESULTS AND DISCUSSIONS 122 42
7.4. PRELIMINARY CONCLUSIONS 131 44
8. EXTERNAL FACTORS WHICH INFLUENCE THE
STABILITY OF ORGANOCHLORINE AND 133 44
ORGANOPHOSPHORUS PESTICIDES
8.1. UV RADIATIONS INFLUENCE AGAINST PESTICIDES
134 44
RESIDUES IN CONTAMINATED HONEY
8.1.1. Materials 134 45
8.1.2. Method 135 45
8.1.3. Results and discussions 136 45
8.1.4. Statistical analysis 151
8.2. INFLUENCE OF IRRADIATION TREATMENTS AGAINST
162 51
HONEY QUALITY PARAMETERS
8.2.1. Methods for determination of honey phisico-chemical
162 51
parameters
8.2.2. Results and discussions 166 51
8.3. PRELIMINARY CONCLUSSIONS 170 51
9. GENERAL CONCLUSIONS AND RECOMMENDATION 171 52
REFERENCES 174
LIST OF PUBLISHED PAPERS 189
APPENDIX 193

28
 INTRODUCTION

Honey is a natural product with high biological and caloric value. Beekeeping
offers products with great prophylactic and therapeutically values, which contributes to
human health maintaining and economically it brings contribution to population welfare.
Over the last few years, the problem of honey and other bee products contamination
was mentioned regarding the antibiotics and pesticides residues, substances with toxic
acute and chronic effects on human health.
It is required that research structures to develop new and performing methodologies
for antibiotics and pesticides residues control in order to promote free international
circulation of Romanian bee products and their acknowledgement as authentic natural
products.
Present thesis « Chromatographic techniques for contaminants determinations
in honey » contains the following parts: introduction, bibliographic study, objectives,
original research, conclusions, bibliographic references and appendix.
In the present thesis it was followed the development of high precision and
sensitivity chromatographic analytical methods, which can ensure detection and
quantification of antibiotics and pesticides residues from honey, in order to protect the
consumers. It was also studied the possibility to reduce the damage of pesticides on honey
by ultraviolet light treatment.
Bibliographic study, structured in 3 chapters, contains information regarding the
contamination ways of bee products, structure and properties of main contaminants and
also modern chromatographic techniques use for determination of mentioned compounds.
Personal research part, systematized in 4 chapters, describes the analytical proposed
methods for tetracycline, chloramphenicol, organochloride and organophosphorous
pesticides residues in honey, validation algorithm of the techniques and obtained results.
A study which followed the influence of UV radiations against pesticides residues
in contaminated honey and also against honey quality parameters was employed.

29
 Chapter 1. THE CONTAMINATION SOURCES OF BEE PRODUCTS

Bee products contamination is due to polluted environment and also to substances

used by beekeepers for diseases control of honeybee colonies.
Main contaminates from environment are heavy metals, radioactive isotopes,
organic pollutants, pesticides, photogene bacteria and genetic modified organisms. Bee
products contamination is mainly due to beekeeping practices by using acaricides and
antibiotics against hive diseases: Varroa, European and American Foulbrood.

Chapter 3. METHODS FOR IDENTIFICATION AND QUANTIFICATION

OF ANTIBIOTICS AND PESTICIDES IN HONEY

Development and improvement of analytical methods for antibiotics and pesticides

control levels is required, having detection and quantification limits as low as possible.
Honey samples testing in order to establish possible contaminations with antibiotics
and pesticides residues are realized by the following:
• Screening methods, used identification of positive samples: ELISA, Charm II and
ROSA tests;
• Quantitative determinations of positive samples by HPLC, LC-MS and GC
techniques.
High performance liquid chromatography (HPLC) is the most used
chromatographic technique for antibiotics analysis. Using the liquid chromatography
coupled with mass spectrometer was achieved a performing instrument able to separate,
identify and quantify compounds from complex samples. Over the years, LC-MS systems
were subjected to significant transformations, starting with simple analysis as a
replacement of traditional UV and achieving very precise qualitative and quantitative
analysis.
Pesticide residues are generally analyzed by gas chromatography coupled with
different detectors, such as ECD (electron capture), NPD (nitrogen – phosphor) or MS
(mass spectrometer).

30
 Chapter 4. AIM AND OBJECTIVES

Due to negative effects that bee products contaminated with antibiotics and
pesticides residues have on consumers, quality control is necessary by secure methods
which offer confident results.
Main objective was the development and validation of performing and modern
liquid and gas chromatographic methods for antibiotics and pesticides residues
determination in honey.
Established objectives are:

Tetracycline residues determination by HPLC-PDA (chapter 5)

Chloramphenicol residues determination by LC-MS (chapter 6)

Organochloride and organophosphorous pesticides determination by GC-
MS technique (chapter 7)

Study of possible diminishes of pesticides content from contaminated
honey, by UV irradiation (chapter 8).

Chapter 5. TETRACYCLINE RESIDUES DETERMINATION

(TECTRACYCLINE AND OXYTETRACYCLINE) FROM HONEY BY
HPLC-DAD

Antibiotics residues determination from honey was a major concern over the last
years, because these compounds may reduce the efficacy of honey properties and if they
are found in significant quantities could represent a serious treat on human health.

5.1. MATERIALS

Development and validation of identification and quantification chromatographic

method of tetracycline residues from honey was based on determinations made on honey
samples of beekeeping Department hives of University of Agricultural Sciences and
Veterinary Medicine Cluj-Napoca, production 2007.

31
5.2. METHOD

Tetracycline residues determination by HPLC-PDA was adjusted for “honey”

matrix according to the method described AOAC Official Methods of Analysis (1995) for
antibiotics determination in milk.

5.2.1. Method development for tetracycline residues determination

Extraction and purification of tetracycline residues from honey is done on MCAC

columns (affinity chromatography using metal chelators).
The system used for tetracycline determination was a high performance liquid
chromatograph, Shimadzu model, VP series coupled with UV-Vis detector and photo
diode Array, which allows continuous registration of the spectrum on the whole spectral
domain, in milliseconds time intervals offering a high quantity of information.
Chromatographic determination:
Different concentration gradients of mobile phases were tested. Optimum variant is
showed in table 1, it ensures an efficient separation of tetracyclines, high resolution and
short working time.
Table 1
Linear gradient program for tetracyclines determination

Time (min) Mobile phase A (%) Mobile phase B (%)

0 74 26
11.5 74 26
13 40 60
17 40 60
19 74 26

Operational parameters of the chromatographic system:

• Flow rate of the mobile phase: 1ml/min
• Injection volume: 50µl

32
• Column temperature: 35oC
• Registration at λ 360nm (oxitetracycline) and λ 355nm (tetracycline)
• Separation time: 28 minutes

5.2.2. Method validation in tetracycline residues determination

Performance parameters determination of the used method for tetracycline

determination by HPLC-PDA was realized according to the requirements of Eurachem
Guide for analytical methods validation. Analytical method was validated through the
evaluation of the following parameters: calibration curve, identity and specificity
confirmation, precision, detection limit, quantification limit, recovery rate, robustness,
stability.

5.3. RESULTS AND DISCUSSIONS

Performances of the developed method are shown in table 2. Linearity was

achieved during the whole range of studied concentrations, as indicated by correlation
coefficients R2, very close to unit.
Table 2
Method performances

Correlation coefficient Linearity

Compound Regression equation
R2 (µg/kg)

Oxytetracycline Y=0.0135X+0.0 0.9994 5-75

Tetracycline Y=0.0127X+0.0 0.9995 5-75

For tetracycline identification and potential interfering substances, following

chromatograms were overlaid: standards mixture (a), uncontaminated honey extract (b)
and honey extract supplemented with oxitetracycline and tetracycline (c) (figure 1).
Retention times of oxitetracycline (7.1 min) and tetracycline (8.6 min) standards have

33
coincided with the ones from supplemented honey, while for uncontaminated honey no
signal was registered. This fact indicates the absence of interference compounds.

7.1

8.6

c
a
b

0 5 10 15
Timp de retentie/Retention time (min)

Fig. 1. Chromatogram of a mixture tetracyclines (a), honey sample free of antibiotics (b)
and honey sample spiked with mixture of antibiotics (c)

Method precision was evaluated by standard relative deviation measurement in

conditions of repeatability and reproducibility; determinations were made on honey
samples supplemented with tetracycline standard at 3 different concentrations. Due to the
fact that RSD values were always situated below 10%, we may consider method precision
being satisfactory.
Table 3
Detection and quantification limits of tetracyclines

LOD LOQ
Compound Mean of concentrations ± SD
(µg/kg) (µg/kg) (µg/kg)

Oxytetracycline 3.32 ± 0.39 4.5 5.5

Tetracycline 3.08 ± 0.58 4.8 6.3

34
 Results presented in table 3, show that the analytical method developed for
tetracycline determinations is able to detect and quantify antibiotic concentrations lower
than the limit proposed by European Legislation (10µg/kg). This fact offers a high
sensitivity method.
Tetracyclines recovery in percentage higher than 70% is acceptable, losses during
extraction being reduced a lot for oxitetracycline, comparing to tetracycline (table 4).
Table 4
Recoveries of tetracyclines

Spiked level Recovery (mean ± SD) RSD

Compound
(µg/kg) (%) (%)
10 93.81 ± 3.29 3.50
Oxytetracycline 15 95.89 ± 5.39 5.63
20 98.96 ± 3.19 3.22
10 75.18 ± 3.49 4.65
Tetracycline 15 73.75 ± 5.65 7.67
20 73.67 ± 4.60 6.25

5.4. PRELIMINARY CONCLUSIONS

• Method used for tetracycline determination from honey involves selective extraction of
the analytes by Cu2+ ions complexes, chromatographic separation and detection with UV-
Vis detector with photodiode Array.
• Used extraction technique realizes in a simultaneous way isolation, cleaning and
tetracycline concentration, without being necessary other operations.
• Studied performance parameters during method validation prove that developed method
is characterized by high selectivity, specificity, accuracy, robustness and sensitivity.
• HPLC-PDA technique is efficient for identification and quantification of tetracyclines
residues from different honey types, absence of interferences being independent of
botanical origin of analyzed honey.

35
 Chapter 6. DETERMINATION OF CHLORAMPHENICOL RESIDUES IN
HONEY BY LC-MS TEHNIQUE

Liquid chromatography technique coupled with mass detector (LC-MS) is known

for high selectivity and sensitivity ensured for analytical methods of chloramphenicol
determination from complex matrices.

6.1. MATERIALS

Development and validation of chromatographic method of identification and

quantification of chloramphenicol residue from honey was based on determinations made
on honey samples of beekeeping Department hives of University of Agricultural Sciences
and Veterinary Medicine Cluj-Napoca, production 2009.

6.2. METHOD

Analytical method for chloramphenicol residues determination is based on the

isolation of the antibiotic from honey using the technique described by Shen and Jiang
(2005), with minor modifications and with the help of mass spectrometry for identification
and quantification.

6.2.1. Development of the method for chloramphenicol residues determination

Sample preparation procedure is simple, chloramphenicol residues being extracted

from honey using the PBS-ethyl acetate-Na2SO4 system, after that being separated by
reverse phase liquid chromatography and detected with mass spectrometer equipped with
electrospray ionization source and quadruple analyzer.
Chromatographic determination:
Zorbax Eclipse XDB-C18 reverse phase column was used for separation,
2.1x150mm and granulation of 3.5µm. Concentration gradient used for mobile phases is
shown in table 5.

36
 Table 5
Linear gradient program for chloramphenicol determination

Time (min) Mobile phase A (%) Mobile phase B (%)

0.7 100 0
0.75 85 15
5 85 15
12 60 40
14 40 60
14.01 100 0

Operational paramaters of the chromatographic system:

• Column temperature: 25oC
• Autosampler temperature: 10 oC
• Injection volume: 50µl
• Flow rate: 0.3ml/min
• Wavelength: 278nm
• Separation time: 28 min
• Interface voltage: 4.5KV
• Interface temperature: 250oC
• Gas flow rate: 1.5l/min (N2)
• Monitored ions selection: m/z 321, 323
• Ionization mode: ESI negative

6.2.2. Method validation in chloramphenicol residues determination

Validation protocol followed for chloramphenicol residues determinationis

according to European Commission Decision 2002/657/EC criteria. Evaluated performant
parameters are: calibration curve and linearity, specificity, precision, detection limit and
detection capability, recovery.

37
6.3. RESULTS AND DISCUSSIONS

Calibration curve obtained for chloramphenicol was realized through external

standard method and presented linearity over the whole concentrations domain. Linear
regression data shown in table 6, indicate a good correlation between detector answer and
analytes concentration. Detection limit and detection capability are according to criteria
established by Commission Decision 2002/657/EC, being below the concentration level of
0.3µg/kg.
Table 6
Linear regression parameters and analytical limits of chloramphenicol

Correlation coefficient Linearity CCα CCβ

Slope Intercept
R2 (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg)
0.142 0.035 0.9999 0.3-25 0.11 0.17

Chloramphenicol identification was made according to chromatographic retention

time of the etalon (13.1min). Compound identity confirmation was realized by comparing
with absorption and mass spectra of the etalon, which were registered in the spectra library
and also by comparing ions intensity ratio.
Obtained chromatograms were compared for chloramphenicol standard, honey
sample supplemented with CAP and an antibiotic free sample (blank) (figure 2). In the
blank chromatogram no signal was registered for chloramphenicol retention time, which
proves that no other chemical or matrix compound was co-extracted. Absence of a fake
positive signal indicates a good analytical method performance.
Relative standard deviation (RSD) obtained were below the limits established by
EU: 10%, and 2% respectively in conditions of repeatability and reproducibility made for
method precision evaluation.
Recovery rate obtained higher than 85% indicate the efficiency of sample
preparation. Results are shown in table 7 and indicate high method accuracy.

38
 (c)

(b)

(a)

6 8 10 12 14

Timp de retentie/Retention time (min)

Fig. 2. LC-MS-SIM chromatograms obtained for (a) CAP standard, (b) honey sample
spiked with CAP and (c) blank honey sample

Table 7
Precision and recovery rate (n=6)

Within-day Between-day
Theoretical
Mean Mean Recovery
concentration RSD RSD
concentration±SD concentration±SD (%)
(µg/kg) (%) (%)
(µg/kg) (µg/kg)
0.6 0.48 ± 0.021 3.8 0.51 ± 0.042 4.9 85
2 1.68 ± 0.080 5.6 1.74 ± 0.098 7.1 87
5 4.35 ± 0.211 7.7 4.55 ± 0.401 8.9 91

6.4. PRELIMINARY CONCLUSIONS

• LC-MS technique for chloramphenicol residues determinations from honey combines

simple extraction, but efficient with adequate chromatographic separation and mass
spectrometry detection which ensures certainty to compound identification.
• Analytical technique developed shows high sensitivity, is able to detect chloramphenicol
concentrations below the limit established by European Legislation.

39
• Validation procedure followed all necessary steps to ensure correct identification and
quantification of chloramphenicol residues.
• Chloramphenicol contamination level is essential to be checked for autochthonous honey
and also imported honey, in order to ensure human health.

Chapter 7. DETERMINATION OF ORGANOCHLORINE AND

ORGANOPHOSPHORUS PESTICIDE RESIDUES IN HONEY
BY GC-MS TECHNIQUE

Pesticides, being used on high scale, are part of the ecosystems circuit, and theirs
negative effects are amplified at the end of the trophic chain (human organism). Multi-
residual performing methodologies are necessary to be implemented, able to detect a high
number of pesticides through one determination.

7.1. MATERIALS

Development and validation of the identification and quantification

chromatographic method for pesticides from honey was based on analysis made on honey
samples of Beekeeping Department hives of University of Agricultural Sciences and
Veterinary Medicine Cluj-Napoca, production 2010.

7.2. METHOD

Pesticides residues determination through GC-MS technique is a multi-residual

chromatographic method which identifies and quantifies 37 compounds simultaneously.

7.2.1. Method development for pesticide residues determination

OCL and OP pesticides residues from honey are transferred through acetonitrile
extraction in the presence of high salts quantities (magnesium sulphate, sodium chloride,
sodium citrate). Purification of the extract is realized by solid phase dispersive extraction

40
(dSPE) followed by sample concentration in order to improve the quantity of inters
analytes.
Compounds are separated through gas chromatography and are detected through
mass spectrometry.
Chromatographic determination:
Compounds separation was realized by active layer of the DB-5MS capillary
column (30m length, 0.25mm internal diameter, 0.25µm film thickness) and by gradient
temperature program shown in table 8.
Table 8
Column program

Growth rate (°C/min) Temperature (°C) Stagnation time (min)

- 45 1.00
20 150 5.00
4 200 0.00
2 225 0.00
10 260 0.00
20 300 8.25

Operational parameters of the chromatographic system:

• Injector temperature: 250°C
• GC-MS interface temperature: 280°C
• Used gas: He, total flow rate: 9 ml/min
• Column flow rate: 0.99 ml/min
• Linear velocity: 36cm/s
• Column temparature: 45oC
• Ionization mode: electrons impact (70eV)
• Detection system: SIM (selected ions monitoring)
• Ions source temperature: 230°C
• Detector tension: 1.56kV
• Separation time: 50min

SIM quantitative detection technique was employed (figure 3).

41
 1000000
7
Abundenta/Abundance (%)
1 8 13
800000 19
17
12 18 26
600000 21 27
16 31
10 33 36
25 30
400000
14 34
11 20 32
4 23
6 9 22 29 35
24
200000 3 37
15 28
2 5
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45
Timp de retentie/Retention time (min)

Fig. 3. GC-MS-SIM chromatogram for a pesticide standards mixture

7.2.2. Method validation for pesticide residues determination

Method validation of organochloride and organophosphorous pesticides residues

determinations is according to European Commission Decision 2002/657/EC criteria.
Evaluated performance parameters are: calibration curve and linearity, identity and
specificity confirmation, precision, detection and quantification limit, recovery rate.

7.3. RESULTS AND DISCUSSIONS

MS detector response was linear through concentration range specified in table 9

for each pesticide. Method sensitivity was good for most compounds, 30 pesticides
detection being possible at concentrations below 10µg/kg concentrations. Quantification
limits ranged between 3.44-47.22µg/kg, while RSDvalues were between 1.09 and 13.01%
(table 9).

42
 Table 9
Calibration parameters and analitical limits (limit of detection and limit of
quantitation) for orghanochlorine and organophosphosphorus pesticides

Correlation
Linearity Concentration ± SD RSD LOD LOQ
Pesticide coefficient
(µg/kg) (µg/kg) % (µg/kg) (µg/kg)
R2
Dichlorvos 0.9974 10-500 2.98±0.12 4.06 3.34 3.65
Mevinphos 0.9986 25-500 19.63±0.39 7.08 20.8 21.82
Demeton O 0.9984 10-500 3.91±0.51 13.01 5.44 6.76
Ethoprop 0.9966 10-500 3.33±0.24 7.10 4.03 4.65
Naled 0.9881 50-500 38.57±0.40 10.44 39.78 40.82
Sulfotep 0.9987 10-500 5.46±0.37 6.87 6.59 7.56
Phorate 0.9988 10-500 4.49±0.32 7.24 5.46 6.31
α HCH 0.9997 10-500 5.57±0.66 11.94 7.56 9.29
Demeton S 0.9869 25-500 23.43±0.04 1.68 23.55 23.65
β HCH 0.9999 10-500 4.23±0.38 8.98 5.37 6.36
γ HCH 0.9997 10-500 6.56±0.38 5.87 7.71 8.71
Diazinon 0.9984 10-500 4.06±0.40 9.85 5.26 6.30
Disulfoton 0.9988 10-500 4.04±0.28 6.92 4.87 5.60
δ HCH 0.9999 10-500 4.82±0.51 10.57 6.34 7.67
Methyl parathion 0.9943 25-500 10.44±0.39 3.81 11.63 12.67
Heptachlor 0.9987 10-500 6.00±0.43 7.13 7.28 8.40
Fenchlorphos 0.9995 10-500 3.68±0.35 9.42 4.72 5.62
Aldrin 0.9998 10-500 5.79±0.47 8.20 7.22 8.45
Chlorpyriphos 0.9997 10-500 4.22±0.25 5.97 4.98 5.63
Fenthion 0.9967 10-500 5.29±0.06 1.09 5.46 5.62
Trichloronate 0.9987 10-500 4.39±0.2 4.54 4.99 5.51
Heptachlor
0.9999 10-500 5.10±0.25 4.85 5.84 6.49
epoxide
Stirofos 0.9975 25-500 14.96±0.72 2.89 17.13 19.01
Endosulfan I 0.9998 10-500 5.39±0.30 5.67 6.30 7.10
Tokuthion 0.9977 10-500 4.21±0.21 5.08 4.85 5.41
4,4’ DDE 0.9999 10-500 4.69±0.36 7.76 5.78 6.73
Dieldrin 0.9999 10-500 5.13±0.35 6.82 6.18 7.09
Endrin 0.9993 10-500 6.57±0.68 9.06 8.62 10.41
Endosulfan II 0.9991 10-500 4.87±0.47 9.66 6.28 7.50
4,4’ DDD 0.9972 10-500 2.24±0.21 9.47 2.88 3.44
Endrin aldehyde 0.9979 10-500 4.51±0.28 6.18 5.35 6.07
Bolstar 0.9999 25-500 21.03±0.62 3.42 22.89 24.50
Endosulfan
0.9938 10-500 4.45±0.45 10.20 5.80 6.98
sulfate
4,4’ DDT 0.9996 10-500 3.51±0.28 7.84 4.34 5.06
Endrin ketone 0.9996 10-500 6.53±0.41 6.32 7.76 8.84
Methoxychlor 0.9989 10-500 3.04±0.17 5.62 3.55 4.00
Coumaphos 0.9939 50-500 45.90±0.24 8.33 46.61 47.22

43
 Compounds identity confirmation is based on comparing mass spectrum and
reference ions abundance ratios of each compound identified in the sample, with standards
using spectra library.
57% of total studied pesticides showed recovery rates within the interval 83%-99%,
40% of them were between the limits of 102% and 117%. Lowest recovery rate was for
endrin aldehyde, 72%, accepted value.

7.4. PRELIMINARY CONCLUSIONS

• QuEchERS extraction technique is highly competitive for GC-MS analysis, being

obtained low interferences.
• Mass detector has high selectivity and offers important spectral information, which
ensures identification and quantification of pesticides residues.
• Evaluated validation parameters indicate that the method offers high accuracy and
precision results with very high recovery rates.
• It is necessary to control even pesticides with prohibited use, especially organochloride
ones, because there is the possibility of these compounds to be found in honey, due to
remanence.

Chapter 8. EXTERNAL FACTORS WHICH INFLUENCE THE STABILITY

OF ORGANOCHLORINE AND ORGANOPHOSPHORUS PESTICIDES

In the environment there are processes which influence pesticides stability,

transforming them into inactive compounds, less toxic. There are three types of pesticides
degradation: microbial, chemical and photo-chemical (destruction under light).

8.1. UV RADIATIONS INFLUENCE AGAINST PESTICIDES RESIDUES IN

CONTAMINATED HONEY

We aimed to study the UV radiation influence against organochloride and

organophosphorous pesticides stability from contaminated honey. It was also made a

44
comparison with the inactivity and concentration diminish of some pesticides from the
environment under the influence of certain processes, of which is played by photo-
chemical reactions.

8.1.1. Materials
Two types of honey were analyzed: acacia (MS) and multiflower (MP). After the
OCL and OP pesticides were added in the honeys at 200µg/kg (MSA and MPA)
concentration, these were subjected to UV radiation action for different time periods.

8.1.2. Method
Artificial irradiation source of UV light was a UV VL-204.G (Vilber Lourmat)
lamp with λ=254nm wavelength. Irradiation times were: 5, 12, 24, 36, 48, 72 hours.

8.1.3. Results and discussions

Pesticides with the lowest stability, removed from the samples in the shortest time
period (36 hours), were: stirofos, bolstar, coumaphos and methoxychlor (figure 4).

100

76,5
Degradation percentage (%)

75
Procent degradare (%)

61,0
53,8 51,0
50
49,4
29,7 27,4
25 Stirofos
22,8 19,8
Bolstar
21,7
Cumafos 16,3
Metoxiclor 4,1
0
5 12 24 36
Timp de iradiere (ore)
Irradiation time (hours)

Fig. 4. Degradation dynamics, expressed as percentage (%), for stirofos, bolstar,

coumaphos and methoxychlor after irradiation

45
 After 48 hours exposure time, other 5 pesticides were destroyed, 3
organophosphorous compounds (naled, methyl parathion and fenthion), as shown in figure
5 and 2 organochloride compounds (4,4’ DDE and 4,4’ DDT).

100

77,8
Degradation percentage (%)

75
Procent degradare (%)

65,6
62,3 58,5

50 44,8
45,8
36,3

25 22,1
17,9
Naled
20,5
Metil paration 15,8
Fention 5,1
0
5 12 24 36 48
Timp de iradiere (ore)
Irradiation time (hours)

Fig. 5. Degradation dynamics, expressed as percentage (%), for naled, methyl

parathion and fenthion after irradiation

100
,2
99

,5

,1
93

91

75
,6
68

,0
Degradation percentage (%)

69
Procent degradare (%)

,6

,7

50
56

59
,1
54

25
,9
,7
,0

34
29
34

,0
11

0
,3

DDD
10

3 8.

5 DDE
12
24 DDT
36
48
72
Timp de iradiere (ore)
Irradiation time (hours)

Fig. 6. Degradation dynamics, expressed as percentage (%), for 4,4’ DDT and its
metabolites after irradiation

46
 While 4,4’ DDT and 4,4’ DDE were not present in the samples after 48 hours of
treatment, 4,4’ DDD was only partially destroyed, 34.9% of its concentration being present
even after maximum irradiation time applied (figure 6).
Other 4 organophosphorous pesticides (dichlorvos, mevinphos, phorate,
chlorpyriphos) (fig. 7) and 3 organochloride pesticides (aldrin, dieldrin, endrin) were no
longer present in the samples at GC-MS analysis, when irradiation time was extended to
72 hours.

100
90,3

85,6
Degradation percentage (%)

75
Procent degradare (%)

67,8
61,0 58,3
64,5 53,6
57,5
50
40,5 47,2
35,4 45,0
29,5
36,6
Diclorfos 31,5 23,0
25
Mevinfos 20,3
Forat 11,2
Clorpirifos 10,7
0 5,5
5 12 24 36 48 72
Timp de iradiere (ore)
Irradiation time (hours)

Fig. 7. Degradation dynamics, expressed as percentage (%), for dichlorvos, mevinphos,

phorate and chlorpyriphos after irradiation

Aldrin and dieldrin were both eliminated from the samples, after 72 hours of UV
irradiation time, but in a different degradation rate (figure 8).
While endrin was no longer identified in sample MSA-72h, its isomers, endrin
aldehyde and endrin ketone were found in 28% concentration level and 17.6%
respectively (figure 9).

47
 100

,0
90
75

Degradation percentage (%)

,4
Procent degradare (%)

64
50

,0

,8
58

52

,0
25

39
,2
30

,0

,2
27

26
0

.7
11
5 Dieldrin

6 ,9
12
24 Aldrin
36
48
72
Timp de iradiere (ore)
Irradiation time (hours)

Fig. 8. Degradation dynamics, expressed as percentage (%), for aldrin and dieldrin
after irradiation

100
,3
91
,1

,6
83

78

75
,0

,1
82

70
Degradation percentage(%

,1
63
Procent degradare (%)

50
,9

,2
,3

52

50

,0
54

42
,4

,8

25
42

36

,2

,0
33

28
.3

0
,6
21

Endrin aldehida
17
,7

5 Endrin cetona
12

12
24 Endrin
36
48
72
Timp de iradiere (ore)
Irradiation time (hours)

Fig. 9. Degradation dynamics, expressed as percentage (%), for endrin, endrin

aldehyde and endrin ketone after irradiation

Most stable compound was sulfotep, also a relatively high stability showing
demeton S, diazinon and α HCH pesticides (figure 10).

48
 98,6 97,5 95,8
100 97,6 95,5 95,1 94,9 95,3 93,3

94,3 89,6
83,9
91,5 89,4 91,1 89,9
Degradation percentage (%)

85,8
Procent degradare (%)

75 68,9
80,0 65,1

62,2
50 56,6
49,7

Sulfotep
25
Demeton O
26,3
Demeton S
Diazinon
0
5 12 24 36 48 72
Durata de iradiere (ore)
Irradiation time (hours)

Fig. 10. Degradation dynamics, expressed as percentage (%), for sulfotep, demeton
O, demeton S and diazinon after irradiation

Unlike demeton S, its isomer, demeton O has suffered a pronounced loss of

concentration for irradiation times higher or equal to 36 hours.
HCH compounds variation is pointed out in figure 11.
.1

100
.1
90
98

.5
.8
84
.9

94
.7

.6
96

89

.3
89
81
.9

.6
.7
.6
82

.8

75
76
73
.5
85

76
79

.3
Degradation percentage (%)

.8

68
70
.9

.1
Procent degradare (%)

69

68

.3

50
.0
57

54
38
.

.7
.8

47
49

25
.7
31

alfa HCH
0 delta HCH
5 beta HCH
12
24 gama HCH
36
48
72
Timp de iradiere (ore)
Irradiation time (hours)

Fig. 11. Degradation dynamics, expressed as percentage (%), for HCH isomers
after irradiation

49
 The rest of organophosphorous pesticides (ethoprop, disulfoton, ronnel,
trichloronate, tokuthion) were destroyed in different proportions under the UV radiations
action, percentages of elimination from samples being between 89.4% (tokuthion) and
63.4% (ethotrop).
Photochemical transformation product of endosulfan which is composed of isomers
endosulfan I and endosulfan II, is endosulfan sulfate. These three compounds showed
concentration variations almost equally after 72 hours of UV treatment (figure 12).

,4

100
99
,4
97

,3

71 ,5

75
80

,2
75
,0
76
,6

,2
74

63
Degradation percentage
Procent degradare (%)

,2

50
65

,6
.2
43

,6
44

,1
41
41

25
,5

4,4
37
(%)

,32
,7
28

20

0 Endosulfan I
,7

Endosulfan sulfat
17

5 12 24 Endosulfan II
36
48
72
Timp de iradiere (ore)
Irradiation time (hours)

Fig. 12. Degradation dynamics, expressed as percentage (%), for endosulfan I,

endosulfan II and endosulfan sulfate after irradiation

Organochloride compounds, heptachlor and heptachlor epoxide, were significantly

destroyed under UV radiations influence, having lower than 8% concentrations in the
sample after 72 hours of irradiation.

50
8.2. INFLUENCE OF IRRADIATION TREATMENTS AGAINST HONEY QUALITY
PARAMETERS

8.2.1. Methods for determination of honey phisico-chemical parameters

Parameters followed for pesticides contaminated honey and UV irradiation were:

HMF content, diastase index, acidity and sugars content.

8.2.2. Results and discussions

Regardless of irradiation time, UV light did not affect the pH of honey samples or
sugars and HMF contents. Honey samples acidity was maintained at initial values, slightly
increased values were registered for maximum irradiation times.
Out of all phisico-chemical followed parameters, the only one which has suffered
significant modifications was diastase index. Amylase is sensitive to light, even after 5
hours of UV treatment the concentration dropped to half of the initial one. As irradiation
time was increased, diastase index continued to drop, reaching values below the limit
proposed by European Community.

8.3. PRELIMINARY CONCLUSSIONS

• UV radiations have a beneficial effect on honey with pesticides residues by diminishing

the contamination level.
• Photo-degradation of pesticides is dependent on irradiation time, radiations intensity and
chemical structure of these compounds.
• For a percentage of 44% of organochloride and organophosphorous pesticides studied,
total degradation was achieved, all others having the concentrations reduced in different
proportions.
• Pesticides residues behavior to UV treatment was similar for the two honey types
investigated.

51
• Total or partial remove of pesticides from honey by ultraviolet exposure does not involve
honey adulteration.

Chapter 9. GENERAL CONCLUSIONS AND RECOMMENDATION

ORIGINAL ELEMENTS

1. Development, optimization and validation of analytical methods for honey

contaminants determination, using modern techniques, out of which are pointed
liquid chromatography coupled with mass spectrometer detector (LC-MS).
2. Use for the first time in our country of QuEChERS method, for pesticides residues
isolation and purification from honey.
3. Experimental protocol for pesticides contaminated honey toxicity decrease, by UV
radiations treatment, without significant honey quality adulteration.

RECOMMENDATIONS AND PERSPECTIVES

1. Expansion of control for different antibiotic classes and pesticides for the other bee
products: pollen, bee bread, wax, propolis and royal jelly.
2. Multi-residual analytical methods development, with large applicability in order to
detect high numbers of compounds in one analysis.
3. Study of an important research area: metabolites and degradation compounds
determination of bee products contaminants, especially those considered toxic and
cancer inducers.

52