Curs II.

Notiuni de morfologie şi taxonomie bacteriană

1. Introducere
2. Dimensiunea, forma şi gruparea bacteriilor
3. Structuri bacteriene obligatorii - structură şi funcţii:
a. nucleul,
b. citoplasma,
c. învelişurile celulare
4. Structuri bacteriene facultative - structură şi funcţii:
a. cilii,
b. pilii,
c. capsula,
d.sporiţ
5. Taxonomie bacteriana. Principalele genuri bacteriene implicate în patologia
umană

1. Introducere

În secolul XXI, microbiologia medicală este abordată din perspectivă sistemică.

Pentru a înţelege relaţia complexă care se stabileşte Între microorganism,
organismul gazdă şi ecosistemul în care acestea interacţionează, este necesar să
cunoaştem atât alcătuirea şi fiziologia microorganismelor, cât şi pe cele ale gazdei
umane.
De exemplu, există structuri bacteriene care asigură aderenţa la tegumente sau
mucoase prin interacţiuni cu diverşi receptori ai gazdei - aşa cum sunt pilii, mobilitatea -
aşa cum sunt flagelii, enzime sau toxine care asigură supravieţuirea microorganismelor
prin utilizarea aparatului morfo-funcţional al gazdei etc.
În pasul următor de instruire, înţelegerea structurii si funcţiei microorganismelor,
precum şi a modului în care acestea se manifestă la nivelul organismului uman în condiţii
variabile care ţin de gazda umană şi/sau de mediu, vor constitui baza necesară pentru
aprofundarea mecanismelor procesului infecţios, a recunoaşterii diagnosticului specific
de boală infecţioasă, precum şi a principiilor intervenţiei terapeutice.

2. Dimensiunea, forma şi gruparea bacteriilor

".'
Dimensiunea microorganismelor este de ordinul micronilor, adică a miimilor de
milimetru (Iu = 10 -3 mm).
Este de aceea evident că, dacă dorim să vizualizăm structurile microbiene
individuale, aspectele pe care le vom observa depind de instrumentul optic cu ajutorul
căruia vizualizăm aceste microorganisme, de puterea lui de mărire, procedeele utilizate
pentru diferenţierea microorganismelor etc.
Observarea cu ajutorul microscopului optic asigură mărirea de până la 900-1000
de ori, în timp ce microscopul electronic poate mări de pâna la ori. Pentru observaţii
speciale, se pot utiliza microscopia de fluorescenţă, microscopia în câmp întunecat,
microscopia confocală, microscopia de forţă atomică etc.

...

1
 La micro scopul optic putem observa microorganismele celulare, cum sunt
bacteriile, fungii şi paraziţii microscopici. Pentru a putea fi observate la micro scopul
optic, este necesar ca microorganismele să fie fixate şi colorate pe o lamă de microscop
sau examinate în preparat umed, între lamă şi lamelă.
Bacteriile fixate pe lamă pot deveni vizibile la micro scopul optic obişnuit prin
coloraţii nediferenţiale pentru bacterii, cum sunt coloraţia cu albastru de metilen şi
coloraţia May-Grunwald-Giemsa, dar cele mai frecvent utilizate în bacteriologie sunt
coloraţiile bacteriologice diferenţiale Gram şi Ziehl-Neelsen.
Hans Christian Gram a fost un farmacolog şi medic suedez, care a trăit între anii
1853 şi 1928. În perioada 1883 - 1885 a lucrat în Strasbourg, Marburg şi Berlin.
În 1884, hicrând cu Friedlander în Berlin, a observat în timp ce examina ţesut
pulmonar de la pacienţii decedaţi cu diagnosticul de pneumonie, că unii dintre coloranţi
erau reţinuţi preferenţial de unele dintre celulele bacteriene. Dacă colora un frotiu uscat la
flacără cu violet de genţiană (cristal violet) şi fixa colorantul cu soluţie Lugol (triiodat de
potasiu), după care decolora cu etanol, unele bacterii, cum sunt de exemplu pneumococii
reţineau colorantul (gram-pozitivi), în timp ce alte specii se decolorau (gram-negativi).
Gram nu a utilizat niciodată contracolorarea microorganismelor gram negative. Cu câţiva
ani mai târziu, patologul german din Frankfurt Carl Weigert (1845-1904) a adăugat etapa
fmală de contracolorare cu safranină, pentru vizualizarea bacteriilor Gram negative, care
pierd coloraţia cu cristal violet. Alternativ, s-a folosit uneori fucsina diluată în loc de
safranină, în funcţie de caracterele de colorabilitate ale diverselor microorganisme.
O altă coloraţie larg utilizată în diagnosticul microbiologie de rutină al infecţiilor
cu mycobacterii este coloraţia Ziehl-Neelsen, care aplică un procedeu simplu de încălzire,
necesar colorării cu fucsină a peretelui bacterian al acestui gen bacterian, necolorabil
prin coloraţia Gram. Rezistenţa ulterioară la decolorare energică cu acid-alcool
diferenţiază microorganismele acid-alcoolo-rezistente, dintre care fac parte şi
mycobacteriile, de restul microorganismelor, pe baza structurii biochimice a peretelui
bacterian.
Pentru observarea prin tehnici de microscopie specială se utilizează metode
corespunzătoare instrumentului de observare: fluorocromi pentru microscopia cu
fluorescenţă, preparatul umed pentru microscopia în câmp întunecat etc.
Elemente vizibile la micro scopul optic, pe care le descriem atunci cînd observăm
un preparat microscopic fixat şi colorat pentru microscopie optică, denumit frotiu, sunt:
• Prezenţa sau absenţa celulelor eucariote (leucocite, epitelii), în funcţie de
materialul examinat: prelevat biologic, respectiv cultură microbiană
• Dimensiunea microorganismelor - apreciată în comparaţie cu alte elemente
figurate cu dimensiune cunoscută (ex. hematiile au diametrul aproximativ de 7
microni) sau faţă de unităţi de mărime inscripţionate pe lama de microscopie
• Forma
• Culoarea - pentru diferenţierea cu ajutorul coloraţiei Gram, coloraţia Ziehl-
Neelsen
• Dispoziţia sau modul în care se grupează microorganismele
• Mobilitatea - în preparatul proaspat
• Inc1uzii celulare
• Spori

2
 • Capsula - se observă mai bine cu coloraţii negative, adică utilizând substanţe care
nu colorează cap sula, ca de exemplu coloraţia cu tuş de India

Forma, mărimea, colorabilitatea, modul de grupare ale microorganismelor variază

în funcţie de factori intrinseci, care definesc genul şi specia din care fac parte bacteriile,
dar şi în funcţie de factori extrinseci, reprezentaţi de condiţiile de creştere (cantitatea şi
calitatea substanţelor nutritive, prezenţa sau absenţa inhibitorilor), vârsta culturii
microbiene etc.
În funcţie de formă, dispoziţie şi caractere de tinctorialitate (colorabilitate), putem
descrie următoarele categorii de microorganisme*:
* In partea stanga sunt reprezentate imagini de microscopie optică, iar în partea dreaptă
imagini de microscopie electronică.
2.1. Cocii - bacterii de formă aproximativ rotundă, la care lungimea şi grosimea sunt
aproximativ egale:
Exemple: . f

• Stafilococii - cu specia tip Staphylococcus aureus - sunt coci perfect rotunzi, cu

dispoziţie în ciorchine (staphylos = ciorchine de strugure în lb. greacă), Gram
.,
pozitiviş în preparate din prelevate biologice pot fi intra sau extracelulari

• Streptococii - cu specia tip Streptococcus pyogenes, sunt coci ovalari, dispuşi în

lanţuri (strepto = lanţ), Gram pozitivi

3
 Cocii din specia Streptococcus pneumoniae sunt de formă lanceolată, grupaţi în
diplo (doi câte doi), cu vârfurile ascuţite faţă în faţă, Gram pozitivi.

• Neisseriile - coci }eniformi, sau în formă de boabe de fasole, grupaţi în diplo, cu

feţele concave faţă în faţă, Gram negativi. Pe frotiurile din prelevat biologic se
situează intra sau extracelular. Principalele specii sunt: Neisseria meningitidis si
Neisseria gonorrhoeae

2.2. Bacilii, bacterii de forma alungită, cu aspect de bastonaşe

Exemple:
• Baci/lus subtilis: bacili cu capetele rotunjite, Gram pozitivi ".'

4
• Fusobacterium fusiformis: bacilli cu capetele ascuţite, Gram pozitivi

• Corynebacterium diphteriae: bacilli cu capetele măciucate, cu dispoziţie în formă

de litere majuscule - M, V, X sau litere chinezesti; se pot colora inegal şi pot
conţine incluzii

• Bacil/us cereus: bacili cu capete tăiate drept, dispuse în lanţuri, Gram pozitivi

5
2.3. .Cocobacili - bacterii a căror formă este de COC1 uşor alungiţi: Pasteurella,
Bordetella pertussis, Brucella

Pasteurella spp . Bordetella spp. Brucella spp.

.,
2.4. Vibrioni : Vibrio - formă de virgulă

2.5. Spirili: spire rigide - Spirillum

2.6. Spirochete: spire flexibile: Treponema, Borrelia, Leptospira

6
 2. 7. Actynomicete: filamente lungi (culturi tinere) şi forme bacilare prin fragmentare
(culturi vechi)

'4

Microscopia electronică poate fi utilizată în două variante: microscopie

electronică de baleiaj, în care sistemul optic preia şi transmite fasciculul de electroni
trimis către probă şi reflectat de structurile sale, respectiv microscopia electronică de
transmisie, în care sistemul optic preia fascicului de electroni transmis prin grosimea
preparatului microscopic.
Microscopia electronică ne oferă posibilitatea de a observa structurile fme ale
microorganismelor.
Bacteriile Gram pozitive şi Gram negative posedă, în general, aceleaşi elemente
structurale generice (Fig. 1), care se deosebesc de cele întâlnite la celulele eucariote.

",'

Fig. 1. Bacteria generică - principalele elemente structurale

Principalele elemente de diferenţiere între celulele procariote şi eucariote sunt

redate în tabelul 1 şi se referă la alcătuirea nucleului, a organitelor, învelişurilor celulare,
metabolismul respirator etc.

7
Tabelul 1. Caractere de diferenţiere între celulele procariote şi eucariote

Caracterul Eucariote Procariote

(alge, fungi, plante, (bacterii)
animale)
Dimensiune >5J.1.m 00,5 -30 um
Nucleu Membrană nucleară, Fără membrană nucleară,
nucleoli, genom diploid, ADN circular, genom
- cromozomi haploid A

Organite citoplasmatice Mitocondrii, aparat Golgi, Nu au mitocondrii, aparat

reti cui endoplasmic Golgi, reti cui endoplasmic
Ribozomi 80 S Ribozomi 70 S
(subunităţi 40 S şi 60 S) (50 S şi 30 S)
Membrana celulară ., Conţine colesterol Nu conţine colesterol
Perete celular Prezent numai la fungi Prezent, structură complexă
cu proteine, lipide şi
peptidoglican
Reproducere Sexuată şi asexuată Asexuată
Mişcare Flagel complex, în unele Flagel simplu, uneori
cazuri
Respiraţie La nivelul mitocondriilorLa nivelul membranei
celulare
Modificat după Patrick A. Murray et al. - Medical microbiology, 6th Edition, Mosby
Elsevier, 2009

3. Structuri bacteriene obligatorii şi funcţiile lor:

3.1. Nucleul celulelor procariote nu are membrană şi nucleoli; totuşi, la microscopul
electronic se poate observa o structură discretă la nivelul citoplasmei, numită
"nucleoid". Nucleul ocupă 10% din volumul celulei bacteriene şi constituie 2-3%
din greutatea sa uscata. Cromozomul bacterian este circular, de obicei o singură
copie / celulă bacteriană, cu o greutate de aproximativ 4000 kb. Este .legat de
membrana citoplasmatica prin mesosom (invaginatie a membranei cu rol în
segregarea cromozomilor dupa replicare).
Compoziţia chimică a nucleului constă în: 60%ADN, 30% ARN nou sintetizat,
10% proteine.

Fig. 2 - Structura ADN:

8
 Fig. 3 - Bazele azotate:
~N
, , '[
lcJr;t°
o· o
o o "0

Unodine

Gw.nosine Adenosine

ADN bacterian are structură de dublu helix, format din lanţuri antiparalele, în
oglindă.
Lanţurile nucleotidice sunt pliate, această pliere fiind strict necesară pentru
realizarea funcţiilor ADN. Procesul de pliere are loc cu ajutorul unor enzime, cum este de
exemplu ADN-girăza. . ~
Enzimele pot fi ţinta unor antibiotice, care împiedică plierea şi duc la moartea
celulei bacteriene, prin imposibilitatea de exercitare a funcţiilor ADN.

Fig. 4 - Plierea lanţului de ADN

Funcţiile ADN sunt: _

Funcţia de matrice pentru sinteza de ARNm şi proteine
Funcţia de replicare a materialului genetic
Materialul genetic extracromozomal este reprezentat de plasmide, fragmente de
ADN capabile de replicare autonoma sau controlata. Structural or este similară cu cea a
cromozomului circular. Numai la cateva specii putem întâlni plasmide cu structura
liniară.
Dimensiunea plasmidelor este de aproximativ 1-200 kb (lkb == JOOO perechi
baze). Pot exista 1-700 copii/celula.
Funcţia plasmidelor este incomplet cunoscută, dar prezenţa acestora conferă o
serie de avantaje, deoarece pot fi implicate în procese care conduc la creşterea rezistenţei
la factorii de mediu şi/sau a virulenţei, prin:
Codificarea unor proteine care des compun moleculele de antibiotic
Codificarea unor proteine care conferă virulenta: ex. Ent P307 E. coli -
enterotoxina (E. coli enteropatogen) etc.
Schimbul de ADN între celulele bacteriene - plasmide conjugative

9
 3.2. Citoplasma
Citoplasma este structura aflata in interiorul membranei citoplasmatice.
Este formată dintr-o matrice citoplasmatică, reprezentată de conţinutul
citoplasmei, fără materialul genetic. Matricea este puţin structurata, are o consistenţă de
gel şi prezintă o serie de granule, în care se găsesc dicerse componente ale
compartimentelor funcţionale citoplasmatice.
Principalele compartimente funcţionale ale citoplasmei sunt:
enzimele glicolitice
- enzimele implicate în sinteza ADN, în special la nivelul furcii de
replicare
enzime implicate în sinteza unităţilor structurale etc.
Constituenţii chimiei ai citoplasmei sunt: proteinel, inclusiv enzime, vitamine,
ioni, acizi nucleici şi precursori, aminoacizi şi precursori, zaharuri şi derivaţi, apa (în
proporţie de 80%. .\
Citoplasma are rol în procesul de creştere, metabolismul celulei, multiplicare.
Incluziile citoplasmatice sunt structuri interne vizibile la microscop,
individualizate de restul citoplasmei, având în general un rol functional.
Clasificarea incluziilor citoplsmatice:
a. Majoritatea incluziilor sunt poli-beta-hidroxialcanoaţi (PHA), cele mai comune
fiind poli-beta-hidroxibutiraţii (PHB), pentru care alcanul este metilul. PHB este un
polimer format din unităţi hidrofobe repetitive, de care se leagă diverşi radicali proteici,
lipidici, fosfaţi etc.
Funcţia principală a acestor incluzii este aceea de stocare de compuşi carbonaţi şi
energie, fiind similare ca funcţie rezervelor de substanţe grase la mamifere.
Unii PHA au proprietăţi plastice, astfel încât pot fi folosiţi pentru obţinerea unor
forme de material plactic biodegradabil.

Fig. 5 - Incluzii poli-beta-hidroxibutirat la micro scopul electronic (microscopie

electronică de baleiaj)

b. Incluziile de glicogen, constituie de asemenea depozite de comnpuşi carbonaţi

. .
Şl energie
c. Globule de polifosfaţi si sulfaţi sunt depozite care vor fi utilizate în situaţii
critice şi conţin substanţe strict necesare supravieţuirii. Ex.: "granule de volutina" la

10
Spirillum volutans; corpusculi Babeş-Negri la Corynebacterii - se colorează în roşu cu
coloranţi albaştri, motiv pentru care sunt denumite "granulaţii metacromatice"
d. Cristale si structuri cristaline - legate de procesul sporularii la Clostridii
e. Vezicule cu gaz, structuri impermeabile pentru apa, dar permeabile pentru gaze;
la Cyanobactenium (stramosul cloroplastelor de la plante) servesc la reglarea pozitiei in
coloana de apa, pentru accesul optim la lumină şi substanţe nutritive)
f. Un tip structurat de incluzii celulare este endosporul (vezi CapA - Structuri
bacteriene facultati ve).
O altă componentă structurală a citoplasmei bacteriilor sunt ribozomii, structuri
complexe în componenţa carora intră acidul dezoxiribonucleic şi proteine.
În citoplasma bacteriilor întâlnim toate cele trei tipuri de ARN cunoscute:
ARN ribozomal, sintetizat in cantitati mari în faza de creştere
exponentială; rol în cataliza sintezei proteice
ARN de. transfer: molecule care convertesc codul genetic din limbajul
acizilor nucleici în limbajul aminoacizilor I
,
ARN mesager: dirijează încorporarea aminoacizi lor în proteine; este o
"fotocopie" a ADN pe baza căreia lucrează ARNm.
În componenţa ribozomilor întâlnim peste 50 de proteine diferite, care posedă
funcţii diferite şi formează o unitate functională cu ARNr

3.3. Membrana celulară:

Membrana celulară este o componentă a celulei în imediata vecinătate a
citoplasmei şi reprezintă cea mai conservată structură în lumea vie.
Este cea mai importantă barieră între interiorul şi exteriorul celulei, aflându-se în
interacţiune dinamică, selectivă, cu mediul în care se dezvoltă bacteria.
Are o compoziţie chimică de natură lipo-proteică, cu o grosime de 8 nm.

Fig. 6 - Structura membranei celulare

Proteina

Radicali de natura
Acizi graşi proteica
I

Proteina

Între moleculele lipidice vecine se stabilesc legături hidrofobe şi legături de

hidrogen, iar între moleculele lipide şi proteine legături de hidrogen .:
Legăturile ionice apar între sarcinile negative proteice, cationii divalenţi Mg+2 şi
Ca+2 şi extremităţile hidrofile ale lipidelor.

11
 Proteinele pot fi mobile sau ancorate de structuri din membrană sau din
vecinătatea meinbranei.
Membrana reprezintă astfel o structura fluidă, cu consistenţa unui ulei de densitate
joasă, care este descris ca un "mozaic fluid", matrice în care lipidele se miscă liber, dar
rară să se mute de pe o parte pe alta a membranei.
Funcţiile membranei:
• Contine citoplasma
• Bariera osmotică: previne scurgerea liberă a materialului intracelular, conform
legii osmozei (patrunderea apei in celula, conform principiului echilibrării
soluţiilor: săruri, zaharuri, ioni etc. mai concentraţi in citoplasma)
• Bariera seiectivă pentru schimburile intre interiorul si exteriorul celulei:
• Transport liber: apa, moleculele hidrofobe şi moleculele hidrofile mici;
moleculele hidrofobe pot pătrunde dizolvându-se in dublul strat lipidic
• Transport controlat: moleculele hidrofile: aminoacizi, acizi organici, săruri
anorganic - mecanisme de transport specific cu ajutorul proteinelor
La nivelul membranei pot acţiona o serie de antibiotice care, prin compromiterea
funcţiilor celulare, distrug celula: ex. Polymyxin B (acţionează ca un detergent) şi
Gramicidina. Aceste antibiotice au însă efecte şi asupra membranelor celulare din
organismul uman, motiv pentru care nu se apelează la ele decât în situaţii extreme,
când alte antibiotice mai puţin toxice nu mai sunt active. Antibioticele care au ca ţintă
membrana celulară se mai pot utiliza limitat sub forma unor preparate cu aplicaţie
locală (topică) şi în doze mici.

3.4. Peretele celular

Peretele celular este o structură critică pentru bacterii. Fără acest perete rigid,
celula s-ar umfla prin pătrunderea apei către mediul hipertonic intracelular şi ar exploda.
În interiorul celulei există o presiune pozitivă de 5-20 atmosfere, mai mare la Gram
pozitivi.
Peretele celular al bacteriilor este structură unică în lumea vie. Numai plantele
mai au perete celular, dar de alta natură.
Bacteriile de interes medical prezintă trei tipuri de perete celular; Gram pozitiv,
Gram negativ şi peretele celular cu structură specială al mycobacteriilor.'·

Funcţiile peretelui celular:

Determina forma celulei
Participă în procesul de diviziune (formarea septului de diviziune)

a. Structura peretelui bacterian la bacteriile Gram pozitive:

Cel mai important component structural al peretelui bacterian la bacteriilor gram

pozitive este peptidoglicanul. Acesta are structura unei reţele formate din lanţuri paralele
cu structura de polimer format din unităţi repetitive de acid N-Acetil Muramic (NAM) şi
N-Acetil-Glucozamină (NAG). Lanţurile sunt unite între ele prin punţi peptidice.

Fig. 7. Structura chimică a peptidoglicanului - reprezentare analogică

12