Metode optice de analiza

instrumentala

Cursul 11

1
 OBIECTIVE

Prezentarea tipurilor de metode optice

Principiile fundamentale ale metodelor optice

Spectroscopia moleculara UV – VIS

Principii generale

Variante de lucru

Determinari calitative

Determinari cantitative

Spectrometrie atomica – notiuni fundamentale

2
METODE INSTRUMENTALE DE TIP OPTIC

In functie de natura interactiunii dintre radiatii si

substante:

1. Metode optice de absorbţie de energie

Spectrofotometrie moleculară - UV, VIS, IR

Spectroscopie atomică

2. Metode optice de emisie de energie

Spectroscopie atomică – de emisie – domenii diverse de
lungimi de unda

Spectrofotometrie moleculară - fluorescenta,
fosforescenta, chemiluminiscenta, difuzia luminii 3
3. Metode de fluorescenta, fosforescenta,
chemiluminiscenta

Metode de difractie

Metode refractometrice

Metode polarimetrice

Metode de difuzie a luminii

Metode combinate
4
METODE INSTRUMENTALE DE TIP OPTIC

in functie de tipul de analit cercetat

Metode optice moleculare

absorbţie de energie: Spectrofotometrie (UV, VIS, IR)

emisie de energie - fluorescenta, fosforescenta,
chemiluminiscenta, difuzia sau difractie luminii,
polarimetrie, refractometrie

Metode optice atomice

absorbţie de energie Spectroscopie atomică de
absorbtie AAS

emisie de energie Spectroscopie atomică de emisie OES
5
 Principii fundamentale ale spectroscopiei
optice

Se bazeaza pe absorbţia sau emisia radiaţiilor electromagnetice

de către molecule sau atomi

• radiaţia electromagnetică are:

• proprietăţi de undă şi de particulă
• se caracterizeaza prin :
1. lungimea de undă λ – cm (micrometri µm,
nanometri nm, milimicroni mµ, angstromi Ǻ
2. frecvenţa ν (nr cicli/sec) - herzi Hz
3. amplitudine A - cm
4. Energie - eV, keV , meV, calorii (cal, kcal), , ergi

.
6
Caracterizarea undelor electromagnetice

Lungimea de undă (λ) = wave length

Amplitudine = amplitude

Unde cu frecvenţă înaltă = High frequency waves

7
Unde cu frecvenţă joasă = Low frequency waves
 Rezultatul determinarii
spectroscopice → spectru
• spectrul prezinta grafic energia (emisă sau absorbită) in
functie de lungimea de unda

• Spectrele de absorbţie → A = f(λ).

8
Rezultatul determinarii spectroscopice → spectru

• Fiecare substanţă are un

spectru de absorbţie
caracteristic:
•
• ca formă generală,
• ca domeniu spectral,
• ca număr de maxime
(picuri)
• ca raporturi între
intensităţile diverselor
picuri

9
10
 Absorbţia radiaţiei electromagnetice
Notiuni fundamentale

Considerăm o radiaţie incidentă monocromatică, Io, care cade pe o

celulă conţinând proba (substanta de analizat), celula are lungimea l
cm iar concentraţia substanţei ce absoarbe lumina este C.

Transmitanta T Absorbanta A
T = I1/I0 A = -ln(T)

11
 LEGILE ABSORBTIEI - Legea Lambert-Beer

I = I0·e-kl
k - coeficientul de absorbţie
l – lungimea cuvei

ln(I0/I) = kl
A = kl
k = const. · C

k - coeficient molar de extincţie (absorbanţă) notat ε, pentru C exprimata in [mol/l]

Forma generala a legii Lambert-Beer este:

A = εlC 12
 SPECTROMETRIE UV – VIS (moleculara)
– Caracterizare generala

Spectrofotometrie in domeniul de lungimi de unda

ultraviolet (200-400 nm) si vizibil (400-750 nm)

Aparatele utilizate se numesc spectrofotometre

UV-VIS

Se determina molecule, deci substante

13
 ACTIVITATE INDEPENDENTA

Care din urmatoarele determinari optice aplicate la
controlul alimentelor se desfasoara in domeniul UV si care
in domeniul VIS:

1. Determinarea polifenolilor λ = 760 nm

2. Determinarea flavonoidelor λ = 510 nm
3. Determinarea HMF din miere λ = 284 si 336 nm
4. Determinarea proteinelor (Bradford) λ = 595 nm
5. Determinarea prolinei λ = 510 nm
6. Determinarea catalazei (Beers) λ = 240 nm
7. Determinarea catalazei (Guaiacol) λ = 570 nm
8. Determinarea peroxidazei λ = 470 nm
9. Determinarea nitritilor λ = 520 nm 14
 Aparatura utilizată

Schema bloc pentru un spectrometru de absorbţie

• toate componentele optice trebuie să fie transparente pentru domeniul

de lungimi de unda ales !!!!

15
Spectrofotometru in UV VIS

Spectrometru FT-IR
16
 Caracterizarea părţilor componente
ale aparaturii in spectrometria UV VIS

1. Sursa

Emite semnalul (radiatia)

semnalul emis trebuie să fie o radiaţie continuă
în domeniul ales;

semnalul trebuie să fie constant
2. Monocromatorul

scop: separarea radiaţiei policromatice într-una
monocromatică

dispozitiv de tip optic (prisme)

17
 3. Cuvele pentru probă
• materiale transparente în domeniul lungimii de undă
utilizate;

grosimea trebuie să fie reproductibilă, constantă,

cunoscută, măsurabilă.

ultraviolet - cuve din cuarţ (λ 200 nm – 400 nm)

vizibil –cuve din sticlă moale sau Pyrex (λ 300 nm –
2,5µm)

18
4. Detectorii

fotomultiplicatoare, emulsii fotografice,

termocuple, celule fotoconductive,
celule pneumatice şi celule fotoelectrice
în funcţie de domeniul spectrului.

în domeniul UV – vizibil - fotocelule,

celule fotomultiplicatoare, filme
fotografice
19
Părţi componente ale spectrofotometrului
de absorbţie UV VIS

Diferentieri functionale – UV/VIS

20
 Spectrometria de absorbţie
în UV-VIS - principii
Principiu general

Unele substanţe (nemetale, metale, compuşi ai acestora,
substanţe organice) au proprietatea de a forma cu reactivi
specifici, în anumite condiţii, compuşi solubili coloraţi.
Intensitatea de culoare a compusului format, numit
compus colorimetrabil, este direct proporţională cu
concentraţia sa în anumite limite ale acesteia.

Metoda spectrofotometrică molecularǎ se bazează pe

determinarea (masurarea, citirea) la un aparat numit
spectrofotometru a absorbanţei unei soluţii colorate de o
concentraţie anume, la o lungime de undă specifică, în
domeniul ultraviolet (UV) sau vizibil (VIS).
21

Orice determinare spectrofotometrică se
caracterizează prin următoarele aspecte:

reactivul de culoare utilizat, adică reactivul care

determină formarea unui compus colorimetrabil prin
reacție cu specia pe care dorim să o determinăm;

lungimea de undă λ la care se face determinarea,

specifică pentru fiecare compus şi nominalizată în
metodă;

dimensiunea cuvei aparatului care se utilizează

(drumul optic; de cele mai multe ori este 1 cm).

22
 Spectrometria de absorbţie
în UV-VIS

Variante de lucru:
1. Colorimetria (VIS)

2. Fotometria (VIS: lumina incidentă este

filtrată prin filtre optice, cu spectru larg)

3. Spectrofotometria (UV, VIS: lumina incidentă

este filtrată prin monocromatoare, domeniul
îngust)
23
 Colorimetria

intensitatea culorii probei se compară vizual,
în lumină albă, cu un set de soluţii etalon de
concentratie cunoscuta - prelucrate în condiţii
absolut identice cu proba.

În această tehnică se pot realiza măsurători,

prin comparaţie vizuală, în eprubetă, la
lumina zilei, rezultând analize chimice cu
exactităţi < decât 1%.
24

este o metodă subiectivă şi mai puţin selectivă

rezultatele depind mult de persoana care execută

analiza deoarece sensibilitatea maximă a ochiului
omenesc atinge maximul pentru domeniul 550-
560nm (domeniul culorii verzi), lucru important
când compararea probei cu etalonul se face vizual

Cu cât există mai multe soluţii etalon, pentru

comparaţie, cu atât metoda este mai exactă.

25
Colorimetria

.tropical.com.pl/images/upload/fck/image/test.jpg

26
Culoarea unui compus nu este culoarea absorbita
ci este culoarea care ramane dupa ce se scade
frecventa absorbita din sursa de radiatii

27
ACTIVITATE INDEPENDENTA

Pentru compusii care se determina la
activitatea independenta anterioara
scrieti culoarea compusului
colorimetrabil care se formeaza si caruia
i se determina absorbanta

28
Fotometria şi spectrofotometria

măsoară instrumental lumina transmisă de o soluţie

colorată (vizibil) sau incolora (ultraviolet) lucrând cu o
sursă de lumină monocromatică.

Când lumina incidentă este filtrată, prin filtre optice,
având un spectru mai larg, avem de a face cu o
fotometrie

când domeniul filtrat este mai îngust (utilizând
monocromatoare) vorbim de spectrofotometrie.

La spectrofotometrie, este posibilă fixarea mai precisă a

lungimii de undă la care se lucrează.

29

Cu ambele variante se poate chiar trasa un spectru de
absorbţie, adică o curbă, obţinută prin măsurarea
semnalului în funcţie de lungimea de undă a radiaţiei
incidente.

În literatura de specialitate uneori se foloseşte pentru

ambele metode şi denumirea de metodă colorimetrică (sau
chiar spectrocolorimetrică), ceea ce uneori poate crea
confuzii.

În domeniul UV, ochiul omenesc nepercepând lumina, se

utilizează doar spectrofotometria.

30
 Determinari calitative in spectroscopia
UV VIS

Se bazeaza pe compararea spectrelor de absorbţie (λ maximelor)

ale substanţelor în domeniul UV-VIS, (200-750nm) cu spectre cunoscute

λ max → maxim de absorbţie

X - selectivitatea maximului de absorbţie

31
32
 33
http://siphotonics.com/Pages/UV_Vis_Spectroscopy_Software.html
Determinǎri cantitative ȋn spectroscopie

Înălţimea curbei şi suprafaţa încadrată de curbă

reprezintă caracteristici cantitative care servesc la
determinarea concentraţiei substanţelor din probe

Se bazeaza pe legea Lambert-Beer A = εlC

Se realizeaza o curba de etalonare pe baza

determinarii absorbantei etalonului la
diferite concentratii cunoscute, la lungimea
de unda corespunzatoare maximului de
absorbtie 34

În dreapta - curba de absorbţie la diferite concentraţii

În stânga - curba de etalonare având un maxim de

absorbţie la lungimea de undă, λmax = 610 nm
35
 UV-vis spectra of different concentrations of Rose Bengal.

The molecular structure of Rose Bengal

(4,5,6,7-tetrachloro-2',4',5',7'-
tetraiodofluorescein).

Calibration curve of Rose Bengal.

Equation of line: y = 0.0977x – 0.1492
(R2 = 0.996)

36
http://cnx.org/content/m34525/latest/
Spectrul de absorbție al Rodaminei B la diferite
concentrații

37
 Curba de etalonare, nitriti in ape, Griess
y = 4.9051x + 0.0131
2
1.4 R = 0.9966
1.3
1.2
1.1
1
Absorbanta

0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.025 0.05 0.075 0.1 0.125 0.15 0.175 0.2 0.225 0.25

Concentratia, mg/l 38
 Curba etalonare nitriti ape y = 3.6836x - 0.0631
R2 = 0.9839
1.4
1.2
1
0.8
Abs

0.6
0.4
0.2
0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4
Conc

Curba etalonare nitriti ape y = 11.248x + 0.1883

R2 = 0.8804
1.4
1.2
1
0.8
abs

0.6
0.4
0.2
0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12
conc
39
 Determinarea concentratiei pentru
proba necunoscutǎ
NUMAI PENTRU DOMENIUL DE CONCENTRATIE IN CARE ESTE
VALABILA LEGEA LAMBERT-BEER

1. Prin comparaţie cu un etalon de concentraţie cunoscută

2. Pe baza factorului de panta mediu, Fm

3. Pe baza ecuatiei de regresie aferenta curbei de etalonare,

y=ax + b

40
 1 - Prin comparaţie cu un etalon de concentraţie
cunoscută (interpolare)

εmol - coeficientul de extincţie molară pentru soluţia de concentraţie cunoscută,

respectiv de concentraţie necunoscută,

b-grosimea probei din cuvă,

c-concentraţia cunoscută a probei de referinţă,

cx- concentraţia necunoscută a probei analizată.

Prin împărţirea celor două ecuaţii se obţine:

Calculul concentraţiei pentru proba necunoscută:

41
2 - Pe baza factorului de panta mediu, Fm

factorul de transformare (de pantă) F este raportul dintre

concentraţiile şi absorbanţele corespunzătoare pentru fiecare
soluţie care formează scara etalon.
Ci
Fi = -----
Ai

se calculează media aritmetică a valorilor obţinute Fi, notată cu Fm:
n
∑Fi
i=1
Fm = ----------
n

unde i are valori de la 1 la maxim n, în funcţie de numărul de soluţii etalon utilizate

pentru obţinerea punctelor prin care se obţine curba de etalonare (minim 5
maxim 10, în general).

Concentraţia probei necunoscute se determină prin calcul, înmulţind

absorbanţa citită Ax cu Fm.

Cx = Ax • Fm
42
Exemplu

43
 ACTIVITATE INDEPENDENTA

Pe ex din tabel veti calcula concentratia probelor necunoscute Cx (1, 2, 3)
prin metoda factorului de panta mediu Fm

44
3 - Pe baza ecuatiei de regresie

Pe baza ecuației care descrie curba de etalonare

y = ax +b,

Y – absorbanta

X - concentratia

de unde
x = (y- b)/a

se determinǎ concentrația necunoscutǎ cx

cx = (absorbanţax – b)/a
45
Exemplu
NOTA - R2 este o masura a liniaritatii curbei, deci a respectarii legii Lambert-Beer,
cu atat mai buna cu cat valoarea este mai aproape de 1

46
 ACTIVITATE INDEPENDENTA

Pe ex din tabel veti calcula concentratia probelor necunoscute Cx (1, 2,
3) prin utilizand ecuatia de regresie a curbei de etalonare

47
Spectrometria atomica

Spectroscopia atomică constă în

urmatoarele tehnici de uz analitic:

emisia atomică;

absorbţia atomică

48

introdusă în analiza chimică din anul 1952 de
către australianul A. Walsh

se bazează pe fenomenul descoperit de germanul

G. R. Kirchhoff (1859) - şi anume inversia liniilor
spectrale → legea lui Kirchhoff:

Principiul spectrometriei atomice

Fiecare element chimic absoarbe acele radiaţii pe
care le poate emite în aceleaşi condiţii, bine
determinate, de temperatură şi presiune.

49

Atom → invelis electronic → stare fundamentala

Dacă o radiaţie de o anumită lungime de undă
acţionează asupra unui atom aflat în stare
fundamentală, atomul poate să absoarbă radiaţia şi
să treacă într-o stare excitată, un astfel de proces
fiind cunoscut sub denumirea de absorbţie
atomică 50

Întrucât această stare (excitata) este instabilă, atomul va
reveni imediat şi spontan către starea fundamentală.

Electronul se va întoarce în poziţia lui iniţială, poziţia stabilă

orbital şi va fi emisă o cantitate de energie radiantă
echivalentă cu cea absorbită în procesul de excitare.

Lungimea de undă a energiei radiante emise este direct

legată de tranziţia electronică care a avut loc si este egala
cu cea a energiei absorbite

Deoarece fiecare element are o structură electronică unică,

lungimea de undă a luminii emise este o proprietate unică a
fiecărui element în parte.
51
 Ce se determina prin
spectroscopie atomica?
ATOMI → ELEMENTE CHIMICE, METALE

52
Aparatura ȋn absorbția atomicǎ

53

Sursa de radiații emite un flux luminos de intensitate
constantă, prestabilita

Soluţia conţinând proba de analizat (sau etalonul, este

transformată într-un aerosol fin, în interiorul unei
incinte numite sistem de pulverizare sau pulverizator
(nebulizor).

Aerosolul, amestecat intim cu amestecul de gaze

(oxidant plus carburant) este condus în flacără unde
atomii unui anumit element absorb doar lumina cu
lungimea de undă specifică elementului respectiv.

Monocromatorul selecteaza radiatia specifica

elementului cercetat

Detectorul (un foto-multiplicator), măsoară intensitatea

luminii monocromatice

Inregistrare date – computer - 54
 Determinari in AAS
Determinare calitativă

Atomii unui anumit element absorb doar lumina cu
lungimea de undă specifică elementului respectiv
(emisă de sursă şi trecută prin flacără)

Atomii celorlalte elemente însoţitoare nu absorb

lumina la aceeaşi lungime de undă ci fiecare la alte
valori ale acesteia deci prin selectarea lungimii
de undă se pot identifica elementele chimice
55
http://wps.pearsoned.com.au/ibcol/117/30074/7699000.cw/content/index.html
56
Activitate independenta

Care este elementul necunoscut
(unknown) din exemplul de pe slide-ul
anterior?

57
 Determinare cantitativă

Se bazeaza pe Legea Lambert-Beer

Diminuarea intensitatii radiatiei,

exprimată în unitaţi de absorbanţă, este
proporţională cu numărul de atomi ai
elementului de analizat, prezenţi în flacăra,
deci cu concentratia acestora.

58
Aplicatiile metodelor optice la
controlul alimentelor

59
 CONCLUZII

Metodele optice permit determinari de atomi
si/sau molecule in functie de tehnica folosita si
domeniul spectral (lungimea de unda)

Spectrofotometria moleculara in UV si VIS este

cea mai utilizata tehnica in controlul curent al
alimentelor

Determinarile optice calitative se bazeaza pe λ a

maximelor si numarul acestor maxime

Determinarile optice cantitative se bazeaza pe

relatia dintre absorbanta si concentratie,
potrivit legii Lambert-Beer
60

Aparatele utilizate – Spectrofotometre in care
semnalul optic se converteste in semnal electric
și care are componentele optice transparente la
λ de lucru

Tehnicile de lucru in spectrofotometria

moleculara sunt: colorimetria, fotometria si
spectrofotometria

Determinarile cantitative se bazeaza pe

operatiunea de etalonare – curba de calibrare
prin tehnici de calcul diferite

Spectroscopia atomica – emisie si absorbtie

atomica

Aplicatiile metodelor optice in control alimente

se refera la compozitie, substante adaugate si
contaminanti chimici 61
 Test de verificare
1. Care sunt tipurile de metode optice utilizate ȋn controlul
alimentelor?
2. Pe ce principiu fizic general se bazează spectroscopia optică?
3. Care sunt mărimile care caracterizează o radiație
electromagnetică?
4. Cum se numește rezultatul unei determinări spectroscopice?
5. Care este domeniul de lungimi de undă ȋn care se execută
determinările spectroscopice ȋn UV/VIS?
6. Definiți transmitanța/absorbanța la o determinare
spectrofotometrică.
7. Care este legea fundamentală aplicată la determinările
spectrofotometrice?
8. Definiți legea Lambert – Beer – forma generală.
9. Ce se determină (dpdv analitic) atunci cănd se utilizează
metode spectrofotometrice ȋn domeniul UV și VIS?
62
10. Care sunt părțile componente ale unui spectrofotometru?
11. Care diferențe sunt ȋntre spectrofotometru care face
determinări ȋn domeniul UV față de cel care face
determinări ȋn domeniul ȋn VIS?
12. Care este principiul general al determinărilor ȋn
spectroscopia de absorbție UV-VIS?
13. Prin ce se caracterizează orice determinare
spectrofotometrică?
14. Care sunt variantele de lucru ȋn spectrometria de
absorbţie în UV-VIS
15. Caracterizați pe scurt colorimetria/Fotometria /
spectrofotometria.
16. Pe ce se bazează o determinare calitativă in
spectroscopia UV VIS ?
17. Pe ce se bazează o determinare cantitativă in
spectroscopia UV VIS ?
18. Cum se realizează curba de etalonare ȋn spectroscopia
UV VIS ?
19. Care sunt metodele utilizate ȋn spectroscopia UV VIS
pentru a se determina concentrația probei necunoscute?
63
20. Cum se calculează concentrația probei necunoscute
prin metoda comparaţiei cu un etalon de
concentraţie cunoscută (interpolare)/ metoda
factorului de panta/ utilizand ecuatia curbei de
etalonare?
21. Care sunt tehnicile de lucru ale spectroscopiei
atomice?
22. Pe ce fenomen fizic se bazează spectroscopia
atomică ?
23. Care este principiul de funcționare al spectroscopiei
atomice ?
24. Ce se determină (dpdv analitic) prin spectroscopie
atomică ?
25. Pe ce se bazează determinările calitative ȋn
spectroscopia atomică?
26. Pe ce se bazează determinările cantitative ȋn
spectroscopia atomică?
27. Dati cel putin trei ex de aplicatii ale metodelor
optice in domeniul alimentar
64