Ministerul sănătății Republicii Moldova

Universitatea de Stat de Medicină și Farmacie ”Nicolae Testemițanu”

Catedra Chimie farmaceutică și Toxicologică

Lucrare de curs
Tema: ” Evaluarea eficacității metodelor de izolare a
substanțelor toxice din sânge”

A verificat: Simonov Lidia, Conf. univ.

A elaborat: Vîzîi Ana, rezident anul I

Chișinău 2018
Se evaluează eficiența metodelor existente de izolare a substanțelor toxice din sânge cu ajutorul
substanței-model. Au fost determinate anumite caracteristici de validare ale metodei de extracție
directă din sânge de către un solvent organic.

Cuvinte cheie: validare, cofeină, izolarea substanțelor toxice, extracție direct

Problema îmbunătățirii calității studiilor chimice medico-legale și chimice toxicologice efectuate

în laboratoarele de laboratoare medico-legale Biroului, de droguri și de toxicologie, se duce la
locul 1 ca posibile erori analitice pot afecta grav viața unei persoane și drepturile sale civile. Prin
urmare, standardele internaționale de calitate SR și HBO, precum și recomandările organizațiilor
internaționale toxicologi furnizează în mod necesar validarea și introducerea sistemului de
control al calității al tuturor procedurilor analitice pentru analiza de droguri și substanțe
psihotrope. În țările din Rusia și CSI se efectuează validarea metodelor analitice individuale,
cum ar fi cromatografia în strat subțire (TLC) și cromatografia lichidă de înaltă performanță și
spectrofotometria, însă nu există date privind validarea metodelor toxicologice și criminalistice.

Diagnosticul analitic include 4 etape principale: izolarea, purificarea, identificarea și

determinarea cantitativă a unei substanțe toxice izolate dintr-un obiect biologic. Fundamental
este stadiul de izolare, deoarece din această etapă va depinde în continuare detectarea și
fiabilitatea rezultatelor determinării cantitative a substanțelor toxice și interpretarea corectă a
rezultatelor. În această etapă, este posibilă pierderea parțială sau completă a analitului și, în
extractul obținut, chiar și prin utilizarea celor mai moderne și extrem de sensibile metode, nu se
detectează o substanță toxică. Completitudinea eliberării substanțelor toxice din obiectele
biologice este influențată de: caracteristicile materialului biologic, proprietățile fizice și chimice
ale analitului și solventul folosit ca extractant, metodele de perfuzare, extracția, sorbția,
aciditatea mediului.

Scopul acestei lucrări este evaluarea eficacității metodelor existente de izolare a substanțelor
toxice din sânge utilizând o substanță model și determinarea unora dintre caracteristicile de
validare a acestor metode: precizia, convergența, specificitate, domeniu de aplicare, liniaritate,
robustețe. Pentru a evalua eficiența metodelor de diagnostic analitice nu sunt întotdeauna
parametri aplicabili și criteriile utilizate în chimia analitică și farmaceutică, anumite State
Pharmacopoeia (FS) XI. Prin urmare, pentru analiza prelucrării statistice a rezultatelor am
utilizat caracteristici ca și metrologice indicate în octombrie № 220 din 26.05.03
Reguli“controlul calității intralaboratory metodelor cantitative ale testelor clinice de laborator,
folosind materiale de control“.
OCT recomandă utilizarea coeficientului de variație a CU (CU-8 • 100% / dy) pentru a
caracteriza erorile aleatorii și pentru a evalua convergența și reproductibilitatea măsurătorilor. În
conformitate cu literatura străină, coeficientul de variație pentru metodele chimico-tosicologice
nu trebuie să depășească 15%.
Ca substanță model pentru evaluarea eficacității metodelor de izolare a substanțelor toxice din
grupul de medicamente dintr-un fluid biologic (sânge), folosind tehnicile existente, am folosit
substanța de cafeină. Această substanță conține azot, ca majoritatea medicamentelor, stabilă în
condiții de depozitare, în medii biologice în condițiile experimentului, când pH-ul mediului se
schimbă, are o metodă convenabilă de determinare cantitativă și este disponibilă. Conform
literaturii de specialitate, procentul de legare a cofeinei la proteinele din sânge este de 50-60%.
Cafeina a fost izolată din sânge folosind metodele sugerate de literatură și cele mai frecvent
utilizate în practică: extracția directă cu solvent organic la anumite valori ale pH-ului; Acțiuni
agenți de precipitare: acid tricloracetic 5%, 25% de acid tricloracetic, soluție de acid tricloracetic
50%, soluție de tungstat de sodiu 10% într-un mediu de acid sulfuric 20%; urmată de extracția cu
un solvent organic; (sulfat de amoniu cristalin) și extracția ulterioară cu acid organic cu un
solvent; hemoliza sângelui și extracția ulterioară cu un solvent organic.

Materiale și metode

Experimentele au fost realizate utilizând următorii reactivi: substanțe cafeină a autenticității și

purității FS respectiv 42-2426 97, sânge donat, sulfat de amoniu cristalin (h d o ...), cristal
Tungstat de sodiu (h d o ...). Soluție de acid tricloracetic 5% și 25% au fost preparate dintr-o
metodă de diluare soluție de acid tricloracetic 50%. Soluție tampon fosfat pH 7,4 preparat din
fosfat de sodiu cristalin (h. D. A.) și fosfat diacid de potasiu cristalului (h. D. A.) Urmând
procedura dată în [4]. Prezentul studiu a fost efectuat folosind un marcaj ultraviolete
Spectrofotometru SF-2000 centrifuge ARF-8 termostatic TB-110.

Experiment. Pentru a modela condițiile de intoxicație, am folosit o metodă descrisă în literatură

de SI Cheger [8]. La 2,5 ml de sânge, s-au adăugat 2,5 ml de soluție de cofeină 1 mg / ml în
tampon fosfat pH 7,4, amestecate temeinic. Amestecul de model a fost incubat timp de 1 oră la
37 ° C.

După obținerea complexului de model cu o probă de sânge, pH-ul 4,0-5,0 (conform indicatorului
universal) a fost setat cu acid clorhidric 0,1 M. Amestecul de model a fost transferat într-o pâlnie
de separare și extras cu porțiuni de 3 x 5 ml de cloroform. Extracția cu cloroform a fost filtrată
printr-un filtru pliat cu sulfat de sodiu anhidru, umezit preliminar cu cloroform, evaporat la un
reziduu uscat la temperatura camerei și cuantificat spectrofotometric. Experimentul a fost repetat
de 7 ori.

După obținerea extractului de cloroform cu partea sa, s-a efectuat o reacție de confirmare a
cofeinei (test murexid). Pentru a confirma puritatea cofeinei, s-a efectuat TLC. Extracția cu
cloroform a fost aplicată cu ajutorul unei capilari pe placa cromatografică "Sorb-fil", în paralel,
ca o robinet pe placă s-a aplicat o soluție de substanță cafeină în cloroform. Cromatografia a fost
efectuată printr-o metodă ascendentă în sistemul de eter-acetonă-25% soluție de hidroxid de
amoniu (40: 20: 1), intervalul de solvent fiind de 10 cm. Detectarea cromatogramei a fost
efectuată prin iradierea plăcii cu lumină ultravioletă la o lungime de undă de 254 nm - o
strălucire roz a punctului de cofeină a fost observată la nivelul robinetului; nu au fost observate
pete de substanțe străine care interferează cu definiția ulterioară.
Reziduul uscat de extracție cu cloroform a fost dizolvat în 10 ml de tampon fosfat pH 7,4.
Soluția rezultată a fost filtrată într-o cuvetă de cuarț cu o lățime a stratului absorbant de 10 mm și
spectrul UV a fost înregistrat pe un spectrofotometru SF-2000 în intervalul lungimii de undă de
la 220 la 340 nm, unde cofeina a avut un maxim la 273 nm. Un tampon de fosfat pH 7,4 a fost
utilizat ca soluție de referință. Concentrația a fost determinată utilizând o diagramă de calibrare a
densității optice față de concentrația soluției.
Construcția curbei de calibrare au fost după cum urmează: un eșantion de cofeină exact 100 mg
au fost plasate într-un balon cotat de 100 ml, se dizolvă în tampon fosfat pH 7,4, ajustarea
volumul soluției până la semn, soluția de pornire a fost preparată cu o concentrație de 1 mg / ml.
Apoi pipeta a fost luat 5 ml din soluția rezultată a fost transferată într-un balon cotat de 50 ml, și
ajustarea volumului soluției până la semn, da o concentrație de 0,1 mg / ml (100 ug / ml). O serie
de diluții a fost preparată din soluția rezultată. soluțiile preparate cu o concentrație de 1, 2, 3, 4,
5, 10, 20, 30, 40 ug / ml și absorbanța soluțiilor. A fost construită o schemă de calibrare,
liniaritatea fiind observată în intervalul concentrațiilor de la 1 la 40 μg / ml.
După obținerea complexului de model cu proba de sânge, așa cum s-a descris mai sus, s-au
adăugat 10 ml de soluție 5% (25% sau 50%) de acid tricloracetic și s-au menținut timp de 30 de
minute cu agitare. Soluția a fost centrifugată timp de 10 minute la 3000 rpm. Supernatantul a fost
drenat, plasat într-o pâlnie de separare și pH-ul a fost ajustat la 4,0-5,0 cu o soluție de hidroxid
de amoniu 25% utilizând un indicator universal.
pv. S-a obținut apoi extracția cu cloroform așa cum s-a descris mai sus. Experimentul a fost
repetat de 7 ori.
La proba model de sânge cu cafeină s-au adăugat 0,25 ml dintr-o soluție de tungstat de sodiu
10% și 0,25 ml dintr-o soluție de acid sulfuric 20% sau 10 ml dintr-o soluție saturată de sulfat de
amoniu și agitată timp de 30 de minute. Soluția a fost centrifugată timp de 10 minute la 3000
rpm. Supernatantul a fost drenat, plasat într-o pâlnie de separare și corecția pH la 4,0-5,0 a fost
realizată cu soluție de hidroxid de amoniu 25% sau soluție de acid clorhidric 0,1 M. S-a obținut
apoi extracția cu cloroform așa cum s-a descris mai sus. Experimentul a fost repetat de 7 ori.
După obținerea complexului de model, s-au adăugat 20 ml apă de hemoliză care provoacă
eritrocite purificate și s-a lăsat să stea timp de 30 de minute cu agitare. Transferat într-o pâlnie de
separare, un pH de 4,0-5,0 (conform indicatorului universal) a fost setat cu acid clorhidric 0,1 M.
S-a obținut apoi extracția cu cloroform așa cum s-a descris mai sus. Experimentul a fost repetat
de 7 ori.

Rezultatele studiului
Datele obținute au fost prelucrate statistic conform procedurii descrise în GPC1 (probabilitatea p
= 90%) și OST nr. 220 din 26 mai 2003. Rezultatele sunt prezentate în tabel. Se poate observa că
cel mai înalt grad de extracție a cofeinei este obținut după izolarea prin extracție directă cu un
solvent organic (cloroform) - 45,6 ± 0,2%, ceea ce corespunde fracțiunii libere de cofeină din
sânge și este în concordanță cu datele litiului. Eroarea calculată de GPC1 este de 1,2%.
Coeficientul de variație (CS) în conformitate
g cu OST este de 1,4%.
Acțiunea de precipitare sau saltare a agenților conduce la pierderi de substanțe toxice datorită
adsorbției lor pe precipitat de proteine. Cele mai mari pierderi se observă atunci când se
utilizează o soluție saturată de sulfat de amoniu (până la 31,3%) și 25% și 50% soluții de acid
tricloracetic (de la 12,5 la 14,5%, respectiv).
Am evaluat câteva dintre caracteristicile de validare ale metodei spectrofotometrice de
cuantificare a cofeinei utilizate de noi și metoda de extracție directă a substanței model, cofeină,
cu un solvent organic ca fiind cel mai eficient. Rezultatele datelor din primul caz (precizie ±
1,04%) sunt după cum urmează.

Convergența (D a soluției test) la o concentrație de 1 μg / ml: în ziua 1 - 0,077; în a doua zi

- 0,082; în a treia zi - 0,079; la o concentrație de 5 μg / ml: în ziua 1 - 0,453; în a doua zi - 0,452;
în a treia zi - 0,452; la o concentrație de 10 μg / ml: în ziua 1 - 0,657; în a doua zi - 0,659; în a
treia zi
- 0,657. Lungimea de undă a fost de 273 ± 2 nm; domeniul de aplicare (D) - 0,300-1,500.
Linearitatea curbei de calibrare a fost observată în intervalul de concentrație 1-40 μg / ml.
 Rezultatele experimentului în al doilea caz - extracția directă a cofeinei din sânge cu cloroform
(cu precizie ± 0,21%) au fost aceleași. Convergență (rata de extracție,%): în prima zi - 46,0;
43,1; 44.8; în a doua zi - 46,5; 45.2; 44,9; în a treia zi - 45,8; 48.9; 45,7. Valoarea optimă a pH-
ului este de 4,0 - 5,0. Conform literaturii, fracțiunea de cofeină liberă din sânge a fost de 40-
50%, conform rezultatelor noastre - 45,6%. Intervalul de aplicare este de 40 μg / ml-1 mg / ml.
Când valoarea pH a fost modificată, rata de extracție a scăzut.

Niciuna dintre metodele utilizate pentru a izola substanțele toxice din sânge nu distruge
complexul acestei substanțe cu proteine din sânge, ci eliberează doar o fracție liberă a substanței.
Dacă considerăm că legarea anumitor grupe de substanțe toxice la proteinele din sânge poate fi
de 95-98% (derivați de 1,4-benzodiazepină, fenotiazină etc.), problema dezvoltării unor metode
mai eficiente de izolare a substanțelor dintr-un fluid biologic dat devine actuală.

Concluzie

1. Cel mai mare grad de izolare a cofeinei dintr-un fluid biologic (sânge) este obținut prin
extracția directă cu un solvent organic la anumite valori ale pH-ului.

2. Utilizarea agenților de precipitare duce la pierderi suplimentare ale substanței toxice datorită
adsorbției pe precipitatea dispersată a proteinei.

3. Este necesar să se dezvolte metode mai eficiente de izolare a substanțelor toxice din sânge,
ceea ce ar face posibilă izolarea substanței de complexul său de proteinele din sânge.