CURSUL II- ETIOPATOGENIA AFECŢIUNILOR INDUSE DE

MICOBACTERII

I.1. Complexul Mycobacterium tuberculosis:

► bacilul Koch,
► My.bovis şi specii intermediare
► My.africanum, My.asiaticum.
► Alte specii de micobacterii: MOTT, My.leprae.
I.2. Clasificarea micobacteriilor
I.3. Caracteristicile biologice şi epidemiologice ale My.tuberculosis
► Virulenţa şi patogenitatea micobacteriilor tuberculoase
► Fenomenul KOCH
► Mecanismele rezistenţei naturale la tuberculoză
► Codul genetic al micobacteriilor; genele de susceptibilitate şi rezistenta
Bcg s şi r- studii;
I.4.Tehnici de detectare rapidă şi specifică a diferitelor specii de micobacterii.
I.5.Concluzii

I.1. Agentul patogen al tuberculozei- Complexul Mycobacterium tuberculosis

(CMT). Bacteriile incluse în genul Mycobacterium sunt bacili acidoalcoolorezistenţi,
imobili, care cresc lent pe medii de culturã selective, necesitând aerobiozã.
Mycobacterium este singurul gen al familiei Mycobacteriaceae şi se înrudeşte cu
genurile :
► Nocardia,
► Corynebacterium şi
► Rhodococcus.
Numele genului a fost dat de Lehmann şi Neumann în 1896.
Genul Mycobacterium include atât bacterii strict patogene, cum ar fi :
► Mycobacterium tuberculosis şi
► Mycobacterium leprae,
► germenii oportunişti ca Mycobacterium avium, Mycobacterium
Kansasii precum şi saprofiţii ca Mycobacterium gordonae.
 Cum adesea boala determinatã de micobacteriile nontuberculoase (NMT sau
MOTT) este foarte asemãnãtoare clinic, radiologic şi histopatologic cu tuberculoza, bolile
respective au fost numite "micobacterioze" în tentativa de a marca o diferenţã esenţialã
faţã de tuberculozã, micobacteriozele nontuberculoase fiind lipsite de contagiozitate
interumanã.
Dintre speciile patogene aparţinând complexului Mycobacterium tuberculosis,
genul cel mai frecvent şi important al bolii la om este
► varianta umană: Mycobacterium tuberculosis humanis, bacilul
Koch, iar
► microorganismele strâns înrudite care pot produce infecţia
tuberculoasă la om pot fi:
 Mycobacterium bovis (bacilul tuberculozei bovine, o cauză
importantă a tuberculozei transmise prin lapte nepasteurizat în
trecut)
 Mycobacterium africanum (izolat la o mică parte din cazurile din
Africa Centrală şi de Vest).
Mycobacterium tuberculosis este o bacterie cu o formă de bacil subţire,
nesporulată, slab aerobă, cu dimensiuni cuprinse între 0,5 şi 0,3 µ, care nu se colorează
cu uşurinţă, fiind frecvent neutru sau/şi rar pozitiv la coloraţia Gram. Metoda de
coloraţie de elecţie este metoda Ziehl Nielsen care se bazează pe proprietatea de acid-
alcoolo-rezistenţă.
My. tuberculosis (MTB ) este o bacterie cu forma de bacil subţire, nesporulata,
slab aeroba, cu dimensiuni cuprinse între 0.5 si 3μm. Micobacteriile au o structurã
specialã, fiind constituite dintr-un nucleu fãrã membranã proprie, citoplasmã cu
mezozomi, granule de polifosfaţi şi vacuole electronotranslucide.
Peretele celular micobacterian este constituit din 3 straturi:
 mureina (peptidoglican reprezentat de un polimer al acidului N
glicolil-muramic alternat cu N-acetil glucozaminã, solidarizaţi prin
tetrapeptide, acid meso-diaminopimelic şi D-alaninã),
 stratul mijlociu de arabinomanan şi acizi micolici, cu sulfolipide şi
cord factor între extremitãţile libere ale acizilor micolici şi,
  la exterior, micozidele reprezentate de peptido- şi fenolglicolipide.
Capsula bogatã în lipide protejeazã micobacteriile de acţiunea radicalilor toxici şi
a enzimelor electrolitice produse de macrofag. Complexitatea structuralã celularã conferã
micobacteriilor o antigenitate particularã, fiind cunoscuţi pânã în prezent 90 de antigeni
solubili şi numeroşi alţii insolubili. Pe baza antigenilor solubili specifici anumitor
micobacterii, pot fi deosebite micobacteriile cu creştere lentã de cele care au creştere
rapidã, precum şi fiecare specie în parte.
Micobacteriile, inclusiv M. tuberculosis, nu se colorează cu uşurinţă şi sunt
frecvent neutre la coloraţia Gram, necesitând o coloraţie specială cu fucsină, Ziehl-
Nielsen. Odată realizată coloraţia cu fucsină, bacilii nu pot fi decoloraţi cu acid-alcool, o
caracteristică justificând clasificarea lor ca bacili acid-alcoolo-rezistenţi (BAAR).
Rezistenţa la acţiunea acizilor se datorează în principal conţinutului mare al
microorganismelor în acizi micolici, acizi graşi cu lanţ lung şi legături încrucişate între
lanţuri şi alte lipide ale peretelui celular. Lipidele din peretele celular sunt legate de
arabinoglicani şi peptidoglicani subiacenţi. Această structură este responsabilă pentru
permeabilitatea foarte scăzută a peretelui celular, şi din această cauză , pentru ineficienţa
majorităţii antibioticelor asupra acestui microorganism. În plus, unele lipide ca
trehalozele acilate, sau “cord factors“ pot juca un rol în virulenţa My. tuberculosis,
inducând fenomene mediate de citokine.
O altă moleculă din peretele celular al micobacteriilor, lipoarabinomananul, este
implicată în relaţia microorganism-gazdă şi facilitează supravieţuirea My. tuberculosis în
interiorul macrofagelor. Cele câteva proteine caracteristice pentru My. tuberculosis le
include pe cele din tuberculină, un derivat proteic purificat (purified protein derivative –
PPD) format dintr-un amestec de molecule fără specificitate de specie, extrase dintr-un
filtrat de cultură.
Structura chimică. Bacilii tuberculoşi conţin 80-85% apă şi 15-20% reziduu
uscat format din săruri minerale şi substanţe organice (lipide, glucide, proteine).
Caracteristic este conţinutul ridicat de substanţe lipidice al corpilor bacilari (30-40% din
rezidul uscat), substanţe cu rol important în:
 diferenţierea epitelioidă şi giganto-celulară a celulelor mezenchimale
(tuberculofosfatide şi acizi graşi),
  acido-alcoolo-rezistenţă (acidul nicolic),
 virulenţa micobacteriană.
Fracţiunea protidică a bacililor tuberculoşi are drept principal reprezentant
tuberculina, preparată de Koch prin concentrarea filtratelor de culturi bacilare omorâte
prin caldură şi utilizată în prezent sub formă purificată sub denumirea de P.P.D (“purified
protein derivative”) în diagnosticul infecţiei tuberculoase.
Glucidele bacilare sunt în cea mai mare parte legate de protide, lipide şi acizi
nucleici. Singurul polizaharid liber identificat a fost glicogenul.
Echipamentul enzimatic este format din amilaze, transaminaze, ureaze, fosfataze,
lipaze, catalaze.

I.2. Clasificarea micobacteriilor. Astãzi, sunt cunoscute aproximativ 25 de

specii adiţionale, cultivabile, acceptate ca fiind specii micobacteriene. Aceste
micobacterii sunt considerate a fi, în general, nepatogene dar unele dintre ele pot, în unele
cazuri, excepţional, sã inducã manifestãri clinice.
Se considerã urmãtoarele specii micobacteriene ca având relevanţã clinicã :

1. Specii micobacteriene strict patogene:

 cultivabile pe medii de culturã selective (creştere lentã): Complexul Mycobacterium

tuberculosis include: My.tuberculosis (bacilul Koch), My.bovis şi My.africanum şi
 necultivabile : Mycobacterium leprae (micobacterie "fascinantã", care, deşi afecteazã
peste 12 milioane de persoane pe plan mondial, nu a putut fi cultivatã in vitro).

2. Specii micobacteriene potenţial patogene care, funcţie de rata de dezvoltare a

coloniilor şi de pigmentarea coloniilor, se divid în 4 grupe, aşa-numitele grupele
lui Runyon :
 micobacterii cu creştere lentã şi noncromogene (Complexul Mycobacterium avium
din care fac parte My. avium şi My. intracellulare; Mycobacterium ulcerans, My.
haemophilum, My. malmoense, My. xenopi),
 micobacterii scotocromogene (Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium
szulgai, Mycobacterium gordonae),
 micobacterii fotocromogene (Mycobacterium kansasii, Mycobacterium marinum,
Mycobacterium simiae, Mycobacterium asiaticum) şi
 micobacterii cu creştere rapidã (Mycobacterium chelonae, Mycobacterium
fortuitum).

I.3. Caracteristicile biologice ale bacililor tuberculoşi sunt:

1. Aerobioză strictă- tropism pentru teritorii bine oxigenate;
2. Multiplicarea lentă- timp lung de generaţie (16-18 ore).
3. În situaţii nefavorabile (leziuni cazeoase, încapsulate) încetează să se mai
multiplice, îşi păstreză viabilitatea, supravieţuind cu un metabolism extrem de
lent (bacili dormanţi);
4. Coloraţia Ziehl Nielsen se bazează pe proprietatea de acido-alcoolo-
rezistenţă;
5. Conţinutul crescut în lipide, tuberculofosfatide şi acizi micolici explică
virulenţa, supravieţuirea şi înmulţirea activă intracelulară (în macrofagul
alveolar neactivat);
6. Rezistenţa crescută în cursul habitatului extern, la expunerea la frig, (-180
grade Celsius), căldură uscată, la acţiunea agenţilor fizico-chimici datorită
hidrofobiei peretelui bacilar.
7. Pot fi omorâţi cu ajutorul RUV, luminii solare, căldurii umede,a substanţelor
antiseptice (cloramină 5-10%, clorură de var 20%, hipoclorit de sodium 0,5%,
etc).
Deoarece majoritatea speciilor de micobacterii, inclusiv Mycobacterium
tuberculosis, au creştere lentă, pot fi necesare 4-8 săptămâni inainte de detectarea
creşterii.
Tipul de micobacterie poate fi identificat pe baza timpului de creştere, a
pigmentaţiei şi a morfologiei coloniilor (eugonice sau disgonice).
Utilizarea mediilor lichide (ex.Middlebrook), cu detectarea radiometrică a
creşterii şi identificarea tulpinilor izolate prin probe pentru acizii nucleici, au înlocuit
metodele tradiţionale de izolare pe medii solide şi de identificare prin teste biochimice.
Aceste metode noi au scăzut timpul necesar pentru izolarea şi stabilirea tipului
micobacterian de la 2 luni la 2-3 săptămâni.
Testarea sensibilităţii la medicamentele antituberculoase (antibiograma) devine
obligatorie atunci când pacientul nu răspunde la terapia iniţială, sau prezintă o recădere
după încheierea tratamentului. Antibiograma bK este metoda de testare a sensibilităţii
bacililor tuberculoşi şi poate fi efectuată direct (utilizând proba clinică) sau indirect (pe
culturi micobacteriene), pe mediu solid sau lichid.
Rezultatele sunt obţinute cel mai rapid prin testarea directă a sensibilităţii pe
mediu lichid, cu un timp mediu de obţinere a rezultatelor de 3 săptămâni, în testarea
indirectă pe mediu solid, rezultatele pot să nu fie disponibile 8 săptămâni sau mai mult.

I.4. Caracteristicile epidemiologice ale bacililor tuberculoşi sunt:

1. Patogenitatea- capacitatea de a produce îmbolnăviri a suferit modificări sub
influenţa chimioterapicelor,
2. Virulenţa- capacitatea de multiplicare are determinism genetic şi nu este
constantă în timp şi spaţiu- (ex.experimentul de la Madras; virulenţa atenuată a
My.africanum şi la tulpinile chimiorezistente prin lipsă de apărare la acţiunea
peroxizilor tisulari prin absenţa catalazei).
3. Sensibilitatea la tuberculostatice predomină în tulpinile sălbatice dar există şi
mutanţi spontan rezistenţi,
4. Rezistenţa la tuberculostatice poate fi:
 nativă (thiacetazonă, izoniazidă, pirazinamidă) sau
 dobândită (Canetti: o populaţie rezistentă= > 10.000 mutanţi/ populaţie de
10.000.000 germeni).

I.4.1. Patogenitatea. Modul de viaţă intracelular al bacteriilor este considerat

parazitism intracelular şi presupune convieţuirea cu celula gazdă, fapt explicat prin
toxicitatea scazută a bacteriei intracelulare. Patogenitatea micobacteriilor se bazează
aproape în exclusivitate pe capacitatea lor de a supravieţui în interiorul macrofagelor
alveolare şi include două aspecte importante: pătrunderea şi supravieţuirea în interiorul
macrofagelor cu perturbarea răspunsului imun al organismului gazdă prin inducerea
reacţiilor de hipersensibilitate întârziată.
Macrofagul, celulă din prima linie de apărare nespecifică a organismului, are
potenţial bactericid datorită capacităţii sale de producere a moleculelor toxice ca
radicalii liberi de oxigen (anion superoxid, peroxid de hidrogen, oxigen singlet, radicali
hidroxil), monoxidul de azot , precum şi de apoptoză. Bacilii tuberculoşi supravieţuiesc
acţiunii bactericide a macrofagului alveolar.
Rolul peretelui celular bacilar în determinismul virulenţei şi patogenităţii este
cunoscut, fiind atribuit structurii complexe a peretelui micobacterian dar implicarea
directă a constituienţilor acestuia în patogeneză nu este precis definită.
Macrofagele sunt cunoscute drept celule fagocitare cu activitate antibacteriană
variabilă, de la medie la înaltă, în funcţie de starea de activare. Modul în care se produce
endocitoza, prima etapă a procesului de fagocitoză, poate influenţa activitatea bactericidă
ulterioară a macrofagelor. Unele micobacterii (My.tuberculosis, My.leprae) pot induce
clivarea componentei C3 a sistemului complement, urmată de opsonizare şi de activarea
procesului de fagocitoză, prin legarea la receptorii pentru complement de pe suprafaţa
macrofagelor (CR1/CR3). Unele bacterii cu parazitism intracelular se leagă direct la CR3
printr-un situs de legare lectin-like, independent de activarea C3. Endocitoza prin
intermediul receptorilor CR1/CR3 impiedică apariţia de radicali de oxigen în interiorul
macrofagelor. Astfel, este anulată capacitatea bactericidă a macrofagelor alveolare.
Activarea macrofagului alveolar prin intermediul limfokinei gamma-interferon
(INF) nu are ca finalitate obligatorie însă distrugerea bacililor tuberculoşi care au
pătruns intracelular.
Formarea granulomului reprezintă un mecanism de protecţie al organismului faţă
de infecţia cu bacterii facultativ intracelulare, prin limitarea replicării micobacteriene şi a
extensiei procesului infecţios. Aceste deziderate sunt realizate prin:
a) activarea macrofagelor, celule care au capacitatea de a inhiba înmulţirea
micobacteriei;
b) încapsularea leziunii prin fibroză şi calcificare;
c) necroză, reducerea nutrienţilor şi a aportului de oxigen.
În majoritatea cazurilor, reacţiile imune de la nivelul leziunii granulomatoase nu
reuşesc eradicarea germenilor patogeni şi, de aceea, bacilii tuberculoşi reuşesc să
supravieţuiască în stare de latenţă, în stare dormantă.
Între bacilul tuberculos cu comportament de parazit intramacrofagic, persistenţa
în focar şi mecanismele de apărare ale gazdei se stabileşte un echilibru labil, care se poate
destabiliza după o perioadă îndelungată de timp.
Granulomul tuberculos, după constituire, poate evolua in 5 moduri diferite:
1. Echilibru stabil menţinut între bacilul persistent şi răspunsul imun local de apărare al
gazdei, cu păstrarea unei stări de imunitate în absenţa semnelor clinice de boală. 85-90%
din persoanele infectate cu My.tuberculosis rămân în acest stadiu.
2. Rar bacilii tuberculoşi sunt distruşi de reacţiile imune de la nivelul granulomului
3. Când răspunsul imun al gazdei este exagerat, reacţiile de citoliză imunologică se
intensifică, necroza afectând ţesuturile pe o arie extinsă. Secreţia exagerată de citokine
generatoare de fibroză, cum ar fi factorul de necroză tumorală (TNF) şi factorul de
creştere tumorală (TGF-ß) induce apariţia fibrozei pulmonare iar bacilii tuberculoşi
rămân localizaţi în interiorul leziunii centrale necrotice.
4. Ramolirea leziunii granulomatoase ca urmare a acţiunii mecanismelor de citoliză
imunologică va conduce la înmulţirea necontrolată a bacililor tuberculoşi iar, la nivelul
ţesuturilor organului afectat, apar leziuni extensive-cazeoase.
Diseminarea infecţiei micobacteriene se face pe cale limfo-hematogenă, cu
apariţia de localizări secundare ale infecţiei şi eliminarea continuţului infectant al
granulomului în arborele traheo-bronşic, cu răspândirea bacililor în mediul înconjurător.
TNF eliberat în circulaţie determină apariţia caşexiei.
Boala, în această situaţie, are o evoluţie malignă iar bolnavul este intens
contagios.
5. În cazul unui răspuns imun insuficient sau defectuos al limfocitului T, fără o activare
eficientă a macrofagului, leziunea granulomatoasă se dezintegrează rapid iar bacilii
tuberculoşi diseminează. Această situaţie se întălneşte în practică la persoanele cu
imunodeficit mediat celular, cel mai bun exemplu constituindu-l pacienţii cu SIDA, la
care leziunea granulomatoasă nu se dezvoltă, afecţiunea fiind de la început diseminativă
şi, în general, cu prognostic rezervat.
 I.4.2. Virulenţa. Micobacteriile sintetizează o serie de toxine (sulfolipide, factorii
cord), cu rol minor ca factori de virulenţă. Genele ce conferă virulenţa se exprimă doar
atunci când este necesar. Micobacteriile supravieţuiesc în mediul inconjurător perioade
îndelungate de timp. Exprimarea factorilor de virulenţă este controlată de senzori
specifici care permit bacteriei intracelulare sa-si activeze acesti factori. Desi stimulii
externi raspunzatori de exprimarea genelor de virulenta nu sunt bine cunoscuti, este
posibil ca

I.4.3. Fenomenul Koch, descris de Robert Koch în 1891, cuprinde secvenţa de

reacţii produse de o nouă inoculare subcutanată de bacili virulenţi efectuată în alt punct al
organismului (coapsa condrolaterală) imediat după constituirea leziunilor locale la locul
inoculării iniţiale.
Aceste reacţii diferă de cele înregistrate după prima inoculare prin următoarele
caractere:
a. apar rapid, fără interval de latenţă, în 24-48 ore constituindu-se un nodul local
necrotic care se elimina (escară),
b. nu sunt urmate de propagarea infectiei dincolo de locul reinoculării, bacilii fiind
distruşi şi eliminaţi pe loc,
c. ulceraţia locală se vindecă spontan.
Aceste diferenţe dovedesc că apariţia unei reactivităţi noi, modificate faţă de
aporturile exogene de bacili (suprainfecţii), organismul animal reinfectat dobândind
concomitent:
 stare de hipersensibilitate şi o
 rezistenţă crescută (imunitate) faţă de bacilii tuberculoşi.
Starea de hipersensibilitate face ca răspunsul la noile contacte cu agentul
patogen să fie rapid (fără interval de latenţă) şi brutal (necroză tisulară acută), iar
rezistenţa crescută este ilustrată de blocarea difuziunii şi eliminarea germenilor de
suprainfecţie la locul pătrunderii lor în organism (absenţa reacţiei ganglionare şi
vindecarea leziunii locale).
 I.4.4. Mecanismele rezistenţei naturale la tuberculoză au fost studiate de mai
mulţi cercetători; constatându-se existenţa unor gene reglatoare ale nivelului activării
macrofagelor.
Rezistenţa organismului uman faţă de bacilii tuberculoşi este controlată genetic,
factorii ereditari având o importanţă deosebită. Determinismul genetic a fost demonstrat
încă din 1927, când un numar de 251 de copii au fost vaccinaţi accidental cu
My.tuberculosis viu, în loc de bacilli tuberculoşi cu virulenţă atenuată cum sunt bacilii
Calmette Guerin (BCG). Dupa şase ani de la acest eveniment, 2% dintre copii sufereau de
tuberculoză, 51% se vindecaseră, 31% au murit iar 16% nu au prezentat niciodată semne
clinice de tuberculoză.
Factorii genetici sunt cei care controlează trecerea de la stadiul de infecţie la cel
de boală împărţind indivizii în "susceptibili" şi "rezistenţi". Aceste influenţe ereditare
sunt demonstrate pe modele murine şi par a se manifesta şi la populaţia umană. La
şoareci, s-a remarcat existenţa unor macrofage cu rezistenţă înnăscută (Bcg r) fiind
genetic programate să treacă rapid în starea de activare. Genele Bcg s induc o activare
lenta si greoaie a macrofagelor soarecilor generand o susceptibilitate crescuta la
tuberculoză.

I.5. Identificarea rapidă şi specifică a speciilor Micobacterium este posibilă în

laboratoare performante. Un diagnostic prezumtiv este bazat de obicei pe identificarea
BAAR la examenul microscopic al unei probe diagnostice, cum ar fi un frotiu efectuat
din sputa expectorată sau dintr-un fragment tisular (de exemplu , un fragment bioptic
dintr-un ganglion limfatic).
Majoritatea laboratoarelor moderne ce prelucrează un număr mare de probe
diagnostice utilizează microscopia cu fluorescentă. Metoda tradiţională rămâne
microscopia optică a probelor colorate cu fucsină bazică Ziehl-Neelsen.
Conform ghidurilor OMS, pentru pacienţii cu suspiciune de tuberculoză
pulmonară trebuie furnizate laboratorului trei probe de spută, preferabil recoltate
dimineaţa, pentru efectuarea frotiului pentru BAAR şi a culturilor micobacteriologice.
Diagnosticul bacteriologic definitiv depinde de izolarea şi identificarea M.
tuberculosis pe mediu artificial de cultură. Probele trebuie inoculate într-un mediu cu ou
sau pe baza de agar (mediul de cultură Löwenstein – Jensen). Deoarece majoritatea
speciilor de micobacterii, inclusiv M. tuberculosis, au creştere lentă, pot fi necesare 4 - 8
săptămâni înainte de detectarea creşterii.
În laboratoarele moderne, utilizarea mediilor lichide, cu detectarea radiometrică a
creşterii şi identificarea tulpinilor izolate prin probe pentru acizii nucleici, au înlocuit
metodele traditionale de izolare pe medii solide şi de identificare prin teste biochimice.
Aceste metode noi au scăzut timpul necesar pentru izolare şi stabilirea speciei la 2 - 3
săptămâni.

I.5.1. Tehnicile de genetică moleculară permit detectarea rapidă şi specifică a

diferitelor specii de micobacterii. Creşterea lentă a My.tuberculosis pe mediile de cultură,
dificultăţile de cultivare şi de testare a sensibilităţii la medicamente au impus
descoperirea de metode rapide de detectare a bacililor prin tehnologiile moleculare bazate
pe genetica micobacteriilor, cum ar fi: sondele de hibridizare ADN, polimorfismele de
restricţie a lungimii fragmentelor de ADN, reacţia lanturilor de polimerază, reacţia
lanţurilor de ligază, sistemele gena reporter- micobacteriofag.
Perfecţionarea tehnicilor de clonare a AND-lui şi dezvoltarea colecţiilor genomice
(genomic library) au permis rezolvarea dificultăţilor legate de izolarea şi purificarea
antigenelor proteice micobacteriene, precum şi obţinerea unui număr mare de antigene
peptidice pure.
Antigenele 6,7,8 micobacteriene sunt proteine cu răspândire largă în timp ce
antigenul 5 este o proteină cu masă moleculară de 28 500-35 000 daltoni specifică M.
tuberculosis. Proteinele secretate activ de către micobacterii sunt componente
preponderente ale filtratului culturilor de M. tuberculosis aflate în faza logaritmică de
creştere. În filtratul culturii de M. tuberculosis, se găsesc aproximativ 200 de proteine, din
care mai mult de 30 de proteine secretate au fost caracterizate utilizându-se mai multe
tipuri de tehnici : purificare proteică, metode imunologice şi screeninig-ul colecţiilor
genice ale ADN- ului M. tuberculosis.
Testul genei- reporter micobacteriofag reprezintă o opţiune în viitor. Testul
permite identificarea tulpinilor multichimiorezistente în mai puţin de 48 de ore. Din
păcate, aceste metode sunt extreme de costisitoare pentru a fi incluse în actualele
programe naţionale de control şi tratament al tuberculozei.
Amprentarea ADN a tulpinilor micobacteriene reprezintă chiar un test diagnostic,
ci, mai degrabă un instrument epidemiologic în studiul transmiterii infecţiei.
Probele ADN disponibile pentru identificarea speciilor de micobacterium, inclusiv
complexul My. tuberculosis, complexul My. avium, My. avium, My. intracellulare, My.
gordonae şi My. Kansasii oferă rezultate disponibile în 3 ore. Pot fi folosite şi pentru
testarea tulpinilor din culturi pozitive deoarece nu sunt suficient de sensibile pentru a
decela micobacteriile în produsele patologice. Testele pentru micobacterii, altele decât
My. tuberculosis se găsesc doar în laboratoarele de referinţă şi sunt foarte scumpe.
Testele de amplificare genică amplifică secvenţe ţintă ale ADN sau ARN-ului
micobacterian şi au fost introduse în clinică în ultimii 15 ani. Ele identifică My.
tuberculosis în 2 etape. Mai întâi segmentele specifice de ADN aparţinând My.
tuberculosis sunt amplificate, apoi ADN-ul amplificat este determinat cu ajutorul unor
sonde ADN. Aceste teste sunt complexe şi costisitoare, dar prezintă câteva avantaje
importante. Furnizează rezultatul în 3-24 ore, sunt mult mai sensibile decât metodele de
colorare, mai puţin sensibile decât culturile şi prezintă o specificitate importantă.
Există în prezent câteva teste disponibile:
1. Amplicor (Roche Diagnostic Inc.) amplifică şi identifică secvenţa 16 S a ARN-
ului ribozomal utilizând tehnologia PCR. Sunt necesare 6 ore pentru obţinerea
rezultatului.
2. Cobas Amplicor (Roche Diagnostic Inc) este o versiune automată a testului
original Amplicor şi este mai practic în laboratoarele în care se rulează un număr
mare de produse.
3. MTD şi MTD amplificat (Gen-Probe Inc), sisteme care utilizează amplificarea
aceleeaşi secvenţe 16S ARN ribozomal. Durează aproximativ 3 ore.
4. Reacţia în lanţ a ligazei (Abbot Laboratories).
Aceste teste necesită aparatură adecvată şi, datorită costurilor ridicate, nu pot fi
recomandate în practica curentă a activităţii de control al tuberculozei din România.
Metodele moleculare de identificare, tipizare şi determinare a susceptibilităţii
micobacteriilor la droguri sunt extrem de valoroase mai ales în cazul micobacteriilor care
nu pot fi cultivate pe medii artificiale, precum şi a celor care au o creştere lentă. PCR
progresează rapid şi va deveni curând o metodă de rutină în diagnosticul bacteriologic al
micobacteriozelor.
Testele moleculare de amplificare a acizilor nucleici (NAAT) pot fi utilizate
pentru identificarea rapidă a M. tuberculosis (în contrast cu micobacteriile
nontuberculoase) şi oferă informaţii utile privind rezistenţa la rifampicină.

I.5.2. Testele serologice. Primul test serologic pentru identificarea TB a fost

descris în 1898. Testele serologice folosite în trecut erau brute şi nestandardizate, cu
rezultate puţin sensibile sau specifice. Micobacteriile care formează suspensii stabile,
netede, pot fi identificate sau tipate prin teste de aglutinare ( M. avium-
intracellulare). Şi serotipurile altor specii pot fi identificate prin aglutinare dar nu
şi ale M.tuberculosis care autoaglutinează uşor. Noile antigene utilizate în cadrul
tehnicii ELISA au o specificitate mai bună, deşi sensibilitatea este suboptimală.
În prezent, nu se recomandă utilizarea testelor serologice în diagnosticul
tuberculozei. Totuşi, acestea reprezintă un domeniu activ de cercetare deoarece un test
ELISA cu sensibilitatea şi specificitatea tehnicii de colorare pe lamă ar aduce avantaje
enorme fiind rapid, simplu şi puţin costisitor.
Deşi testul de dozare a secreţiei de -INF (IGRA) necesită recoltarea sângelui, nu
este un test serologic.

I.5.3. Testele IGRA măsoară eliberarea de IFN-γ (Interferon gamma releasing

assay-IGRA) şi au ca principiu faptul că celule T sensibilizate anterior la antigene ale
MTB produc niveluri înalte de INF-γ când are loc o nouă expunere la antigenele
micobacteriene.
Există doua teste IGRA disponibile comercial:
 Quantiferon TB Gold (Cellestis, Carnegie, Australia) şi
 T-SPOT. TB (Oxford Immunotec, Abingdon, Marea Britanie), teste care s-au
impus deja în multe ţări ca mijloace moderne pentru imunodiagnosticul infecţiei
TB latente (LTBI).
Metoda de lucru este relativ simplă:
  În cazul testului Quantiferon TB Gold, tot sângele recoltat (5 mL) este incubat cu
antigene de M. tuberculosis, iar INF-γ produs este măsurat prin reacţia ELISA.
 Pentru testul T-SPOT, celulele mononucleate din sângele periferic sunt incubate
cu antigene de My. tuberculosis, iar numărul de celule T care au produs INF-γ este
determinat prin reacţia ELISPOT.
Testele IGRA au fost concepute pentru a măsura producţia de IFN-γ de către
celulele sanguine periferice, predominant de către un grup distinct de limfocite T.
Aproximativ 2-5% din totalul limfocitelor corpului uman circulă în sânge. Celulele T
efectoare cu memorie reprezintă sursa predominantă a producţiei precoce de IFN-γ. În TB
activă, limfocitele T cu memorie care se transformă în celule T efectoare cu memorie sunt
recrutate la locul infecţiei.
Testele de identificare a celulelor T efectoare cu memorie în rândul celulelor
mononucleare din sângele periferic (PBMC) pot numai să ofere informaţii indirecte
despre activarea sistemului imun în boala activă.
În consecinţă, testele IGRA efectuate pe celulele mononucleare din
compartimentele infectate ar oferi o discriminare mai bună decât testele efectuate doar pe
PBMC între TB boală activă si infecţia TB latentă.
Limfocitele T specifice împotriva M. Tuberculosis (MTB) au fost identificate în
număr crescut atât la persoane imunocompetente cât şi la cele imunodeprimate, între
limfocitele din lichidul de lavaj bronhiolo-alveolar (LBA), revărsatele pleurale sau
pericardice, lichidele de ascită şi lichidul cefalorahidian la pacienţii cu TB pulmonară şi
microscopie BAAR negativă în spută şi cei cu TB pleurală, peritoneală, pericardică şi
meningeală.
Testele IGRA actualmente comercializate, care se bazează pe combinaţia de
antigene RD-1 ca ESAT6 şi CFP10, par să reducă semnificativ rezultatele fals pozitive
datorate vaccinării BCG şi sensibilizării la micobacterii netuberculoase. Aceste proteine
specifice de M. tuberculosis- ESAT6 (early secretory antigenic target 6-ESAT-6) şi
CFP10 (culture filtrate protein 10- CFP10) sunt codificate de genele localizate la nivelul
secvenţei RD-1 din genomul My. tuberculosis. Aceste antigene nu se găsesc în vaccinul
BCG sau la speciile de micobacterii atipice, nontuberculoase.
 În contrast cu amestecul de antigene prezent în derivatul proteic purificat utilizat
in vivo prin IDR la PPD, testele IGRA depistează răspunsul imun cu memorie faţă de un
număr limitat de peptide specifice RD1 din partea celulelor mononucleare din sângele
periferic (PBMC) ex vivo. Genele care codifică proteinele RD1 lipsesc din tulpina
vaccinală de bacili Calmette-Guerin (BCG).
În consecinţă, la contacţii recenţi ai unor cazuri contagioase de TB, vaccinaţi
BCG, rezultatele IGRA corelează mai bine expunerea la M. tuberculosis şi apariţia
ulterioară a infecţiei tuberculoase decât IDR la PPD.
Cu toate acestea, rolul IGRA în diagnosticul bolii tuberculoase active este mai
puţin clar, mai ales la copiii mici cu sistem imun imatur. În 10-15% din copii şi ≈50% din
adulţii cu TB activă (cu BAAR pozitiv in examenul de spută), imunodiagnosticul prin
IDR la PPD sau IGRA nu este necesar.
Imunodiagnosticul prin test IGRA pozitiv poate avea o oarecare utilitate în
cazurile la care examenul microscopic al sputei suspecţilor de TB este BAAR negativ,
eventual şi NAAT, acolo unde sunt disponibile. În aceste cazuri (frecvente în special la
copii), rezultatele pozitive ale IGRA şi/sau ale IDR-PPD au o valoare limitată deoarece
nu pot distinge între TB activă şi infecţia TB latentă decât în corelaţie cu datele
epidemiologice, clinico-radiologice şi bronhologice.
Kampmann şi colab. au subliniat inabilitatea IGRA de a separa TB activă de
infecţia TB latentă. O cohortă de 209 copii din Marea Britanie a fost investigată prin 2
teste comerciale IGRA, efectuate comparativ cu IDR PPD, pentru diagnosticul
prezumptiv de infecţie TB latentă (n=118) sau TB activă (n=91). Nici prezenţa unui test
IGRA pozitiv, nici magnitudinea răspunsului imun evaluat în acest fel (IFN-γ în UI/ml în
testul ELISA, respectiv numărul de celule formatoare de pete per 250.000 PBMC în
testul ELISPOT) nu au fost capabile să discrimineze între TB activă şi infecţia TB.
Kampmann şi colab. au raportat o sensibilitate de 83% a IDR-PPD în TB activă,
comparativ cu 80% pentru QFT-GIT şi 58% pentru T-SPOT.TB. Acest studiu confirmă
valoarea predictivă negativă pentru infecţia cu M. tuberculosis de >95% în cazul în care
atât IDR la PPD cât şi IGRA sunt negative. Astfel combinaţia dintre cele două teste
negative aproape exclude diagnosticul atât de infecţie TB latentă, cât şi de TB activă la
indivizii imunocompetenţi.
 Valorile predictive pozitivă şi negativă ale testelor IGRA în diagnosticul TB active
în rândul populaţiilor vulnerabile imunodeprimate (ex. infecţie HIV-SIDA, insuficienţă
renală cronică, transplante de organ sau de măduvă, tratament cu agenţi anti-TNF) sunt
încă insuficient definite, fiind foarte limitate. Rezultatele unor studii cross-secţionale pe
cohorte sugerează că frecvenţa răspunsului imun pozitiv la IGRA este mai mare decât a
celui la IDR-PPD la pacienţii cu imunosupresie severă însă, din nefericire, lipsesc date
din studii longitudinale despre incidenţa TB‚ în rândul persoanelor testate. În ţările cu
incidenţă ridicată a TB, unde riscul infecţiei şi reinfecţiei este crescut, rămâne
deocamdată neclar dacă testele IGRA au o valoare predictivă mai bună decât IDR-PPD.
Până ce vor fi identificaţi biomarkeri imunologici adecvaţi, gold-standard-ul în
diagnosticul TB active continuă să fie detectarea directă, izolarea sau amplificarea ADN-
ului M. tuberculosis din specimenele clinice.

I.5. Concluzii:
1. Agentul patogen al tuberculozei face parte din:
 Familia Mycobacteriaceae;
 Ordinul Actinomycetales;
 Genul Mycobacterium (Lehmann şi Neumann,1896) înrudit cu genurile Nocardia,
Corynebacterium şi Rhodococcus;
2. Speciile de micobacterii tuberculoase patogene pentru om sunt:
 Mycobacterium tuberculosis, varianta umană, bacilul Koch (Robert Koch,1882);
 Mycobacterium bovis (Smith,1896);
 Mycobacterium africanum (Castels,1968) izolat la bolnavii cu TB din Africa
Centrală şi de Vest, are caracteristici intermediare între 1 şi 2.
3. Evidenţierea microscopică a bacililor tuberculoşi în produsele patologice se
bazează pe acid-alcoolo-rezistenţa microbiană. Această proprietate tinctorială constă în
fixarea solidă a anumitor coloranţi pe corpii bacilari, fixare care rezistă selectiv acţiunii
decolorante a acizilor şi alcoolului (coloraţia clasică Ziehl–Nielsen)
4. Exigenţele nutritive explică dificultatile de cultivare a micobacteriilor pe
medii artificiale. Creşterea lentă pe mediul solid de cultură Lowenstein-Jensen
determină depistarea tardivă a sensibilitatii la medicamentele antimicobacteriene şi
explică, în unele cazuri (paucibacilare) subdiagnosticarea bacililor tuberculoşi prin
metodele clasice de diagnostic bacteriologic.
5.Virulenţa şi patogenitatea diferă la micobacterii.
6. Până în momentul actual, nici unul dintre testele bazate pe răspunsul imun
(IDR-PPD, IGRA din sângele periferic, dozarea anticorpilor circulanţi) nu poate înlocui
testele convenţionale precum examenul microscopic, cultura şi testele de amplificare a
acizilor nucleici în diagnosticul TB active.
7. În rândul populaţiei vaccinate BCG, specificitatea mai mare a testelor IGRA
permite identificarea contacţilor infectaţi.
8. Valoarea testelor IGRA în diagnosticul bolii TB active este limitată.
9. Testele imune ca IGRA si IDR-PPD nu detectează în mod direct M.
tuberculosis, ci indică răspunsul celular la sensibilizarea recentă sau îndepărtată la M.
tuberculosis. Deoarece IGRA nu pot diferenţia TB activă de infecţia TB latentă, un
rezultat IGRA pozitiv nu indică neapărat TB activă (afirmaţie aproape întotdeauna
adevărată pentru locurile cu prevalenţă ridicată a TB). Mai mult decât atât, un rezultat
negativ izolat la un test IGRA nu poate exclude boala activă la un pacient suspect de TB;
această afirmaţie este valabilă şi pentru IDR la PPD.