UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE “IULIU HAȚIEGANU” CLUJ-NAPOCA

REZUMAT TEZĂ DE DOCTORAT

Particularități imunologice la
pacientele cu avort recurent

Doctorand Corina-Alina Matiș

Conducător de doctorat Acad.Prof.dr.Florin Vasile Stamatian

2015
 CUPRINS

INTRODUCERE 11
STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII 17
1. INTRODUCERE 19
1.1. Importanța problemei.Argument 19
1.2. Epidemiologie 19
2. AVORTUL RECURENT 21
2.1. Definiția avortului spontan și a avortului recurent 21
2.2. Subgrupele avortului recurrent 21
2.3. Integrarea factorilor epidemiologici în cercetare 22
2.3.1. Numărul de avorturi spontane în antecedentele obstetricale 22
2.3.2. Vârsta materna 22
2.3.3. Agregarea familială 23
2.3.4. Specificitatea de partener 23
2.3.5. Stilul de viață 23
2.3.6. Asocieri clinice 23
2.3.7. Factorii socio-economici 24
3. DEZVOLTAREA EMBRIONULUI ȘI IMUNOREACTIVITATEA EMBRIO-MATERNĂ 25
3.1. Molecule implicate în apoptoza celulară 25
3.2. Semnalizarea embrio-maternă precoce 26
4. IMUNOLOGIA AVORTULUI RECURENT 27
4.1. Introducere. Avortul recurent autoimun 27
4.2. Avortul recurent asociat cu anticorpii antifosfolipidici 27
4.3. Avortul recurent asociat cu anticorpii antinucleari 29
4.4. Avortul recurent asociat cu anticorpii antitiroidieni 29
4.5. Imunoterapia preventivă în avortul recurrent 30
5. GENETICA AVORTULUI RECURENT 31
5.1. Introducere. Frecvență 31
5.2. Tipurile de anomalii genetice implicate în etiologia avortului recurent 31
5.3. Aneuploidiile recurente 32
5.4. Anomaliile structural 32
5.5. Transmiterea poligenică 32
6. ENDOCRINOLOGIA AVORTULUI RECURENT 33
6.1. Deficiența de fază luteală 33
6.2. Hiperprolactinemia 33
6.3. Patologia tiroidiană 34
6.4. Inhibinele 34
7. SINDROMUL ANTIFOSFOLIPIDIC ȘI AVORTUL RECURENT 35
7.1. Introducere. Etiologia sindromului antifosfolipidic 35
7.2. Mecanismele avortului recurent în sindromul antifosfolipidic 35
7.3. Diagnosticul sindromului antifosfolipidic- izotipurile și metodele de detecție ale 35
 anticorpilor antifosfolipidici

8. DEFECTELE DE COAGULARE ȘI AVORTUL RECURENT 37

8.1. Deficiențele fibrinogenului 37
8.2. Deficiențele ereditare ale factorului XIII 37
8.3. Trombofiliile 38
8.3.1. Introducere. Mecanisme fiziopatologice 38
8.3.2. Complicații obstetricale ale trombofiliilor 38
9. ANOMALIILE UTERINE ȘI AVORTUL RECURENT 39
9.1. Introducere. Clasificarea defectelor de duct Mullerian 39
9.2. Stări patologice dobândite asociate avortului recurent 39
9.3. Metode de investigare a integrității uterine 40

CONTRIBUȚIA PERSONALĂ 41
1. IPOTEZA DE LUCRU. OBIECTIVE 43
2. METODOLOGIA GENERALĂ 45
2.1. Caracteristici generale ale lotului studiat 46
2.2. Predicția numărului de avorturi cu ajutorul factorilor de risc extinseci și intrinseci 51
3. STUDIUL 1. PREVALENȚA TESTELOR DE DIAGNOSTIC POZITIV LA PACIENTELE
53
CU DOUĂ VERSUS TREI PIERDERI SPONTANE DE SARCINĂ
3.1. Introducere 53
3.2. Material și metodă 57
3.3. Rezultate 58
3.4. Discuții 59
4. STUDIUL 2. EVALUAREA IMUNITĂȚII CELULARE PRIN DOZAREA TNF-Α, IL-4, IL-6 61
ȘI IL-10 ȘI DETERMINAREA ACTIVITĂȚII LIMFOCITELOR TH1/TH2 LA
PACIENTELE CU AVORT RECURRENT
4.1. Introducere 61
4.2. Material și metodă 62
4.3. Rezultate 64
4.4. Discuții 66
5. STUDIUL 3. IMUNOFENOTIPAREA LIMFOCITELOR T ȘI B ȘI ANALIZA CELULELOR 69
NK DIN SÂNGELE PERIFERIC LA PACIENTELE CU AVORT RECURENT IDIOPATIC
COMPARATIV CU FEMEILE FĂRĂ ACEASTĂ PATOLOGIE
5.1. Introducere 69
5.2. Material și metodă 71
5.3. Rezultate 74
5.4. Discuții 76

6. STUDIUL 4. IMPACTUL AUTOIMUNITĂȚII LA PACIENTELE CU AVORT RECURENT 79

ANTICORPII ANTITIROGLOBULINĂ, ANTIPEROXIDAZĂ TIROIDIANĂ,
ANTICOAGULANTUL LUPIC, ANTICORPII ANTICARDIOLIPINICI ȘI ANTIΒ2GPI
6.1. Avortul recurent autoimun 79
6.1.1. Anticorpii antitiroidieni 80
6.1.1.1. Obiectivul studiului 80
6.1.1.2. Material și metodă 80
 6.1.1.3. Rezultate 81
6.1.1.4. Discuții 82
6.1.2. Anticorpii antifosfolipidici 83
6.1.2.1. Obiectivul studiului 85
6.1.2.2. Material și metoda 85
6.1.2.3. Rezultate 86
6.1.2.4. Discuții 87
7. STUDIUL 5. NIVELUL INSULINEMIEI PREPRANDIALE ȘI REZISTENȚA LA 89
INSULINĂ POT FI CORELATE CU AVORTUL RECURENT IDIOPATIC
7.1. Introducere 89
7.2. Material și metodă 90
7.3. Rezultate 91
7.4. Discuții 93

8. PROTOCOALE DE INVESTIGAȚIE PENTRU AVORTUL RECURENT 95

9. CONCLUZII GENERALE 99
10. ORIGINALITATEA ȘI CONTRIBUȚII INOVATIVE ALE TEZEI 101

REFERINȚE

Cuvinte cheie: avort recurent, etiologie imunologică, interleukine, imunofenotipare limfocitară,

autoimunitate, anticorpi antitiroidieni, sindrom antifosfolipidic
 STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII

Patologia avortului recurent va rămâne în continuare una dintre cele mai frustrante patologii pentru
obstetricieni. Abordarea etiologică trebuie făcută multidisciplinar, implicând ramuri precum hematologia,
endocrinologia, diabetologia, genetica clinică etc. Există multiple studii care încearcă să ofere soluții pentru
întrebarile legate atât de etiologie cât și de tratament, dar foarte puține realizate în țara noastră. Studiul
actual este singurul după cunoștința noastră care abordează populație românească diagnosticată cu avort
recurent și realizează o stratificare a factorilor etiologici implicați.
În peste 50% dintre cazuri, nu se identifică un factor cauzator la cuplurile diagnosticate cu avort
recurent. Testarea cariotipului parental, a anticorpilor antifosfolipidici, histerosalpingografia, testarea
trombofiliilor sau a afecțiunilor endocrinologice rămân negative. Este important de subliniat pentru femeile
cu avort recurent idiopatic că șansa unei sarcini la termen este în jur de 50-60%, dependentă de vârsta
maternă și paritate, așa cum subliniază un studiu recent.
În partea generală se regăsesc capitole și sub-capitolele aferente, care descriu stadiul actual al
cunoașterii în ceea ce privește avortul recurent. Datele furnizate sunt de mare actualitate, regăsite în studii
recente cu rezultate promițătoare.
Această parte de generalități a tezei clarifică aspecte legate de terminologie, clasificare, incidență, factori de
risc, etiopatogenie și fiziopatologia avortului recurent. Implicarea patologiei imunologice este evidentă încă
din stadiile inițiale ale implantării, motiv pentru care a fost detaliată imunoreactivitatea maternă. Sunt luate
în discuție detaliat etiologia genetică, endocrinologică, sindromul antifosfolipidic, trombofiliile, anomaliile
uterine.

CONTRIBUȚIA PERSONALĂ

1. IPOTEZA DE LUCRU. OBIECTIVE

În încercarea de a evalua relația dintre patologia imunologică și avortul recurent, am realizat
investigații în cele trei direcții mari ale imunologiei: autoimunitatea, evidențiată prin prezența unor
autoanticorpi specifici; imunitatea umorală și respectiv celulară. Obiectivele au fost ierarhizarea factorilor
etiologici în populația descrisă, formularea unor ipoteze privind factorii prognostici, evaluarea legăturii între
patologia imunologică și avortul recurent, cuantificarea acestei legături, iar la final propunerea unui protocol
de investigare și tratament al avortului recurent adaptat populației în studiu.
Cercetarea factorilor imunologici a urmat patru direcții principale: asocierea avortului recurent cu
interleukine specifice, cu celulele natural killer, cu autoanticorpii și respectiv creșterea rezistenței la insulină
și a insulinemiei preprandiale. Pentru că patologia este rară, majoritatea studiilor au fost de tip caz-control,
raportarea făcându-se la un lot de control fără pierderi spontane de sarcină, cu cel putin o naștere la termen.

2. METODOLOGIA GENERALĂ
Studiile au inclus paciente care s-au adresat Clinicii Ginecologie I în perioada 1 ianuarie 2009-31
decembrie 2009 şi Secţiei Obstetrica-Ginecologie Sibiu, respectiv Centrului de Fertilitate Polisano în perioada
1 ianuarie 2010-31 decembrie 2012. Au fost incluse 108 paciente care au prezentat cel puţin două pierderi
spontane de sarcină, sub vârsta de 20 de săptămâni de sarcină sau cu produs de concepţie sub 500 de grame.
Sarcina a fost documentată prin examen histopatologic după chiuretajul evacuator sau prin examinare
ecografică. Avortul recurent primar s-a definit ca cel puţin două pierderi spontane de sarcină fără obţinerea
unui făt viabil, iar avortul recurent secundar s-a definit ca cel puţin două pierderi spontane de sarcină după o
sarcină cu un făt viabil. Sarcină ectopică şi sarcina molară au fost excluse din studiu.
Pacientele incluse în lotul de cazuri sunt paciente negravide, la o distanţă de cel puţin 6 săptămâni de
evenimentul abortiv. După semnarea unui consimţământ informat de participare în studiu, s-a efectuat un
test de sarcină urinar. Au fost incluse în studiu doar pacientele cu test de sarcină negativ. S-a realizat o
anamneză detaliată generală şi obstetricală, urmată de o examinare clinică amănunţită. Au fost incluse în
studiu doar pacientele cu documentaţie privind sarcinile anterioare(examinări ecografice care să ateste
prezența sacului gestațional sau rezultate ale examenului histopatologic care să demonstreze prezența
sarcinii). S-au efectuat apoi testele de evaluare pentru avortul recurent: cariotipul matern şi patern din
sângele periferic prin bandare G, ecografie ginecologică endovaginală şi histerosalpingografie, dozări multiple
sangvine (recoltarea s-a efectuat pentru toate pacientele în aceeaşi fază a ciclului menstrual). În lotul de
cazuri au fost incluse pacientele care au fost diagnosticate cu avort recurent sau avort recurent idiopatic (în
funcție de studiu).

Lotul martor a inclus paciente care au îndeplinit următoarele criterii de includere: vârsta peste 18 ani, au
semnat consimțământ informat de participare în studiu, au în antecedentele obstetricale cel puțin o naștere la
termen și nu au prezentat pierderi spontane de sarcină sau sarcini oprite în evoluție.

3. STUDIUL 1- CORELAREA ISTORICULUI OBSTETRICAL CU FACTORI DE RISC ÎN AVORTUL

RECURENT

INTRODUCERE
Primul studiu a pornit de la controversa legată de definiția avortului recurent: când ar trebui
începute investigațiile complexe ale unui cuplu cu avort recurent- la două sau la trei pierderi spontane de
sarcină? Scopul a fost compararea frecvenței testelor diagnostice specifice pozitive la pacientele cu 2 și 3 sau
mai multe pierderi spontane de sarcină.
MATERIAL ȘI METODĂ
Studiul a inclus paciente care s-au adresat Clinicii Ginecologie I Cluj-Napoca, între 1 ianuarie 2010 şi
31 decembrie 2012. Criteriile de includere în studiu au fost: paciente negravide >18 ani, la mai mult de 6
săptămâni de evenimentul abortiv, cu cel putin două avorturi spontane documentate histopatologic sau
ecografic, care și-au dat acordul de participare în studiu. Au fost excluse sarcinile molare, ectopice sau
avorturile terapeutice și pacientele sub 18 ani.
După anamneză, examen clinic general și local, s-au efectuat următoarele teste de evaluare: cariotipul ambilor
parteneri din sângele periferic prin bandare G, histerosalpingografie, determinarea anticorpilor sindromului
antifosfolipidic: ancoagulantul lupic, anticorpii anticardiolipinici și anticorpii anti beta2glico-proteina1,
pozitivi dacă valorile au fost crescute la 12 săptămâni interval, TSH, glicemia a jeun, trombofiliile( doar
anumite forme și doar formele homozigote prezintă interes). Rezultatele acestor testari au fost clasificate
negative în cazul unor valori normale și pozitive atunci când au fost modificate.
REZULTATE
Au fost incluse în studiu 108 paciente, dintre care 75 cu 2 avorturi spontane și 33 cu 3 sau mai multe avorturi
spontane. La compararea rezultatelor anormale la aceste teste, valorile p>0,05, demonstrând că nu există
diferență semnificativ statistică între frecvențele rezultatelor anormale la cele doua loturi, ceea ce sugerează
că testarea cuplurilor trebuie începută la 2 pierderi spontane de sarcină.
Numărul de avorturi spontane din antecedente se corelează cu vârsta maternă și cu riscul unei viitoare
pierderi: riscul unui avort spontan dupa 3 pierderi de sarcină este de 40%. Factorii toxici: fumatul, cafeina,
alcoolul și drogurile sunt factori de risc demonstrați pentru avortul spontan sporadic, dar nu s-au corelat cu
avortul recurent decât în masura în care consumul și dozele se mențin. Regresia multiplă ierarhică a fost
utilizată pentru a evalua capacitatea a 5 măsuri (vârsta maternă,numărul de pierderi spontane de sarcină din
antecedente, vârsta paternă, consumul de cafea, cantitatea de ţigări fumată) pentru a prezice numărul de
avorturi ulterioare. Cel mai important contributor la model este vârsta maternă, care are cea mai mare
valoare betași procent important de varianță unică explicată(beta=0,5, p<0,001), urmat de numărul de
avorturi spontane din antecedente și numărul de țigarete fumate. Vârsta paternă și consumul de cafea nu au
contribuit în mod semnificativ la model.
CONCLUZII
Frecvenţa egală a rezultatelor anormale pentru 6 din 7 teste aplicate ambelor loturi a sugerat ca
investigarea pacientelor pentru avort recurent trebuie începută la 2 pierderi spontane de sarcină.
 4. STUDIUL 2. EVALUAREA IMUNITĂȚII CELULARE PRIN DOZAREA FACTORULUI DE
NECROZĂ-α, INTERLEUKINEI-4, INTERLEUKINEI-6 ŞI INTERLEUKINEI-10 ȘI
DETERMINAREA ACTIVITĂŢII LIMFOCITELOR Thelper1/Thelper2 LA PACIENTELE CU
AVORT RECURENT

INTRODUCERE
Studiul evaluează imunitatea celulară prin intermediul unor interleukine specifice. Ipoteza studiului
este aceea că la femeile cu avort recurent anergizarea limfocitelor se face în raport invers față de femeile fără
aceasta patologie.
MATERIAL ȘI METODĂ
Au fost incluse paciente care s-au adresat Clinicii Ginecologie I Cluj-Napoca, între 1 ianuarie 2010 şi 31
decembrie 2012. Studiul a inclus lotul de cazuri: paciente diagnosticate cu avort recurent, la care nu s-a
depistat nici un factor etiologic, prin urmare cu diagnosticul de avort recurent idiopatic stabilit și lotul control
a inclus femei cu cel puțin o naștere la termen, fără avorturi spontane. S-au dozat interleukine produse
exclusiv în compartimentul matern, pentru ambele linii limfocitare.
La toate pacientele incluse în studiu s-a facut dozarea interleukinelor din sânge venos periferic, printr-o
metodă imunoenzimatică, determinându-se TNF-alfa și IL-6, produse de limfocitele THelper1, exclusiv în
compartimentul matern, cu efect proinflamator, protrombotic, de stimulare a fagocitozei și a producției de
PGE2 și IL-10, IL- 4, produse exclusiv în compartimentul matern, cu rol antiinflamator și imunosupresor,
inhibitor al producției de interleukine produse de limfocitele T Helper2, monocite activate și celule NK. Cel
mai important parametru urmărit este nu atât valoarea absolută a acestor dozări, dar mai ales raportul TNF-
alfa/IL-10 și TNF-alfa/IL-4, ca marker al predominanței activării uneia dintre cele două linii limfocitare.
REZULTATE
La compararea mediilor interleukinelor proinflamatorii cu lotul de control, lotul de cazuri a prezentat valori
mai mari semnificativ statistic, dar interleukinele produse de limfocitele THelper2 au avut valori similare în
cele două loturi. IL-6 la este semnificativ statistic mai mare la lotul pacientelor cu avort recurent idiopatic
decât la lotul martor, t(69,62)=3,12(2,84±2,27pg/ml vs 1,61±1,06pg/ml, p<0,01). TNF-alfa este semnificativ
mai mare la lotul pacientelor cu avort recurent idiopatic decât la lotul martor, t(70)=2,56,(1,75±1,43pg/ml vs
1,09±0,66pg/ml;p<0,05). Media raportului TNFa/IL-10 la lotul pacientelor cu avort recurent idiopatic este
semnificativ mai crescută decât la lotul martor, t(57,67)=2,55, p<0,05. Media raportului TNF-alfa/IL-4 la lotul
pacientelor cu avort recurent idiopatic este semnificativ mai crescută decât la lotul martor, t(54,19)=2,77,
p<0,01. Raporturile menționate au fost semnificativ statistic mai mari la lotul de cazuri, traducând un status
proinflamator, protrombotic la pacientele cu avort recurent idiopatic.
CONCLUZII
Cele două inteleukine produse exclusiv în compartimentul matern de către limfocitele Thelper1
(TNF-alfa şi IL-6) au avut titruri crescute semnificativ statistic la pacientele cu avort recurent faţă de lotul
martor. Nu există diferenţe între titrurile interleukinelor produse de limfocitele Thelper2 între loturi.
Raporturile TNF-alfa/IL-10 şi TNF-alfa/IL-4 au fost semnificativ mai mari la lotul de cazuri, demonstrând o
predominantă a activării limfocitelor Thelper1 faţă de cele Thelper2.

5. STUDIUL 3. IMUNOFENOTIPAREA LIMFOCITELOR T ŞI B ŞI ANALIZA CELULELOR NK DIN

SÂNGELE PERIFERIC LA PACIENTELE CU AVORT RECURENT IDIOPATIC COMPARATIV CU
PACIENTELE FĂRĂ ACEASTĂ PATOLOGIE. STUDIU CAZ-CONTROL

INTRODUCERE
Studiul propune compararea imunofenotipării limfocitare periferice la femeile cu avort recurent
idiopatic prin comparație cu femeile sănătoase, cu cel putin o naștere la termen. Celulele NK aparțin
imunității înnăscute, cu fenotip CD3-CD56+; Exista 2 subgrupe de celule NK-dim, cu efect predominant
citotoxic si NK-bright, ce stimuleaza producția de citokine. Rolul lor este de a iniția și regla procesul de
remodelare a arterelor spiralate, dar și de limitare a procesului de invazie trofoblastică prin intermediul unor
factori de creștere: factorul de creștere vascular endotelial, factorul de creștere placentar și prin intermediul
unor citokine ce cresc toleranța imunologica: IL-10 sau IL-8.
MATERIAL ȘI METODĂ
Au fost incluse paciente care s-au adresat Clinicii Ginecologie I Cluj-Napoca, între 1 ianuarie 2010 şi 31
decembrie 2012. Lotul de cazuri a inclus paciente cu avort recurent idiopatic, lotul de control a inclus femei
sănătoase, fără pierderi spontane de sarcină, cu cel puțin o naștere la termen. S-a realizat imunofenotiparea
limfocitară periferică.
REZULTATE
În studiu au fost incluse 72 de paciente, dintre care 50 în lotul de cazuri. Dintre tipurile limfocitare, s-
au obtinut diferențe semnificative statistic pentru: limfocitele T citotoxice și celule NK care au fost crescute la
lotul cu avort recurent, respectiv limfocitele reglatoare care au fost crescute la lotul de control. La comparația
mediilor limfocitelor, limfocitelor T totale CD3+, limfocitelor T helper CD3+CD4+, limfocitelor B CD19+, între
cele 2 loturi nu s-au determinat diferențe semnificative statistic.
Limfocitele T supresoare/citotoxice sunt semnificativ mai crescute la lotul pacientelor, comparativ cu lotul
martor, t(70)=0,17, cu media la lotul de cazuri de 75,34% și IC 95% [73,57; 77,11]; media la lotul martor de
68,82% și IC 95%[66,67; 70,87], p<0,05.
Limfocitele NK CD3-CD16+CD56+(10-30%) sunt semnificativ mai crescute la lotul pacientelor, comparativ cu
lotul martor, t(70)=2,34. Media valorilor la lotul de cazuri este 27,46% cu IC[26,27;28,65], iar pentru lotul
martor media a fost de 22,5% cu IC[20,8; 24,17], p<0,05.
Limfocitele reglatoare CD8+CD28-(6-43) sunt semnificativ mai crescute la lotul martor, comparativ cu lotul
pacientelor, t(70)=-4,08. Media valorilor la lotul de cazuri a fost 20,92%, cu IC [19,54; 22,3], iar la lotul de
cazuri media valorilor a fost de 31,59 cu IC[29,23; 33,95] p<0,001
CONCLUZIE
Acest studiu este singurul din ţară care realizează imunofenotiparea limfocitară în scopul analizei
preconceptuale a statusului imunologic al pacientelor cu avort recurent idiopatic comparativ cu paciente fără
această patologie. S-a demonstrat că există o creştere procentuală a celulelor NK, a limfocitelor citotoxice
CD3+/CD8+ şi o scădere a limfocitelor reglatoare faţă de lotul de control. Aceste observaţii susţin ideea că
activarea imunologică a celulelor NK şi a unor subpopulaţii de limfocite T sunt implicate în etiopatogenia
avortului recurent.

6. STUDIUL 4. IMPACTUL AUTOIMUNITĂȚII LA PACIENTELE CU AVORT RECURENT:

ANTICORPII ANTITIREOGLOBULINA, ANTIPEROXIDAZA TIROIDIANĂ, ANTICOAGULANT
LUPIC, ANTICORPII ANTICARDIOLIPINICI, ANTI BETA-2-GLICOPROTEINA-1

INTRODUCERE
Studiul evaluează autoanticorpii antitiroidieni și antifosfolipidici la pacientele cu avort recurent., comparative
cu pacientele fără această patologie.
MATERIAL ȘI METODĂ
Au fost incluse 130 paciente în studiu, paciente care s-au adresat Clinicii Ginecologie I Cluj-Napoca, între 1
ianuarie 2010 şi 31 decembrie 2012, dintre care 81 în lotul de cazuri și 49 în lotul de control. Lotul de cazuri a
inclus pacientele diagnosticate cu avort recurent, cel martor a inclus paciente fără această patologie.
REZULTATE
Autoanticorpii antitiroidieni au fost crescuți semnificativ statistic la pacientele cu avort recurent, dar
numărul cu anticorpi pozitivi a fost redus per ansamblu, așa încât sunt necesare studii mult mai ample pentru
a obține o concluzie validă. Din 108 paciente cu avort recurent, 11,1% au prezentat cel putin 1 dintre tipurile
de autoanticorpi antifosfolipidici pozitivi la un interval de 12 săptămâni.
Autoanticorpii antitiroidieni(antitiroglobulina, antiperoxidaza tiroidiană) au fost depistati crescuți la
pacientele cu avort recurent comparativ cu lotul martor(p<0,05), pe seama pacientelor cu 3 sau mai multe
pierderi spontane de sarcină. Între valorile acestor autoanticorpi la pacientele cu 2 avorturi spontane și cele
ale lotului martor nu s-au determinat diferențe semnificative statistic.
Nu s-a determinat diferență semnificativ statistică între prevalențele anticorpilor antitiroidieni în funcție de tipul de
avortul recurent, primar sau secundar.
CONCLUZII
Rezultatele studiului arată o detecţie a anticorpilor antitiroidieni mai frecventă la pacientele cu avort
recurent decât la femeile sănătoase, fără avorturi spontane în antecedente. Studiul confirmă posibilitatea ca
afectarea chiar şi subclinică a funcţiei tiroidiene (hipotiroidismul subclinic) să fie implicată în patogeneza
avortului recurent. Rezultatele sugerează faptul că investigarea de rutină a autoimunităţii antitiroidiene
împreună cu screeningul statusului hormonal tiroidian ar trebui efectuate la femeile cu avort recurent, în
special la cele cu 3 sau mai multe pierderi spontane de sarcină.

7. STUDIUL 5. NIVELUL INSULINEMIEI PREPRANDIALE ŞI REZISTENŢA LA INSULINĂ POT FI

CORELATE CU AVORTUL RECURENT IDIOPATIC. STUDIU CAZ-CONTROL

INTRODUCERE
Studiul ia în discuție insulinorezistența și insulinemia la pacientele cu avort recurent. Insulino-rezistența
periferică produce o creștere a activității PAI-1 și a producției de androgeni de origine ovariană, scăzând
nivelul proteinelor de legare a unor factori de creștere insulin-like, expresia glicodelinei sau a integrinelor
endometriale. Insulino-rezistența s-a cuantificat printr-un index denumit HOMA-IR care se calculează în
funcție de nivelul glicemiei și insulinemiei a jeun.
MATERIAL ȘI METODĂ
Selectarea pacientelor s-a făcut astfel: în lotul de cazuri au fost incluse pacientele diagnosticate cu avort
recurent idiopatic, cu excluderea pacientelor cu diabet zaharat sau sindrom de ovare micropolichistice,
condiții în care se cunoaște creșterea rezistenței periferice la insulină. In lotul martor au fost incluse paciente
cu cel puțin o naștere la termen, fără patologie cunoscută. După o pauză alimentară de 12 ore, s-a recoltat
sânge venos periferic și s-a determinat prin metoda oxido-reductazei glicemia a jeun iar printr-o metodă
imunoenzimatică- insulinemia a jeun.
REZULTATE
Între cele două loturi ce au inclus 65 respectiv 53 de paciente, nu au existat diferențe semnificative statistic în
ceea ce privește vârsta sau indicele de masă corporală. Glicemia a jeun a fost semnificativ crescută la lotul
control comparativ cu lotul de cazuri(79.8±10.1 mg/dl vs. 85.6±13.1 mg/dl, p<0.01); indexul HOMA-IR a fost
mai mare la lotul de cazuri cu semnificaţie statistică prezentă (2.98 vs. 1.69, p<0.05).
CONCLUZIE
Se recomandă determinarea nu doar a glicemiei ci și a insulinemiei la pacientele diagnosticate cu avort
recurent, având în vedere beneficiul pe care aceste paciente l-ar putea avea din tratamentul cu Metformin.
 CONCLUZII GENERALE

1. Diagnosticul de avort recurent imunologic este cel mai frecvent un diagnostic de excludere.

2. Cu ajutorul regresiei multiple ierarhice, propunem o ecuație de predicție a numărului de avorturi

spontane, având ca factori importanți din punct de vedere al semnificatiei statistice vârsta maternă,
numărul de pierderi spontane din antecedentele obstetricale și numărul de țigări fumate.

3. Frecventa testelor anormale la pacientele cu două versus trei sau mai multe pierderi spontane de
sarcină este statistic similară, așa încât propunem începerea investigării pacientelor după două
pierderi spontane de sarcină.

4. La pacientele cu avort recurent idiopatic media limfocitelor totale, limfocitelor T totale CD3+,
limfocitelor T helper CD3+CD4+, limfocitelor B CD19+ nu este semnificativ statistic crescută față de
cea a lotului martor.

5. Limfocitele T supresoare/citotoxice sunt semnificativ mai crescute la lotul pacientelor cu avort

recurent idiopatic, comparativ cu lotul martor, t(70)=0,17, p<0,05.

6. Limfocitele reglatoare CD8+CD28- sunt semnificativ mai crescute la lotul martor, comparativ cu lotul
pacientelor cu avort recurent idiopatic, t(70)=-4,08, p<0,001.

7. Limfocitele NK CD3-CD16+CD56+ sunt semnificativ mai crescute la lotul pacientelor cu avort

recurent idiopatic, comparativ cu lotul martor, t(70)=2,34, p<0,05.

8. IL-6 la este semnificativ statistic mai mare la lotul pacientelor cu avort recurent idiopatic decât la
lotul martor, t(69,62)=3,12(2,84±2,27pg/ml vs 1,61±1,06pg/ml, p<0,01).

9. TNF-alfa este semnificativ mai mare la lotul pacientelor cu avort recurent idiopatic decât la lotul
martor, t(70)=2,56,(1,75±1,43pg/ml vs 1,09±0,66pg/ml;p<0,05).

10. Media raportului TNFa/IL-10 la lotul pacientelor cu avort recurent idiopatic este semnificativ mai
crescută decât la lotul martor, t(57,67)=2,55, p<0,05.

11. Media raportului TNF-alfa/IL-4 la lotul pacientelor cu avort recurent idiopatic este semnificativ mai
crescută decât la lotul martor, t(54,19)=2,77, p<0,01.

12. Raporturile TNF-alfa/IL-10 si TNF-alfa/IL-4 au fost semnificativ mai mari la lotul de cazuri,
demonstrând o predominanță a activării limfocitelor Th1 față de cele Th2.

13. Autoanticorpii antitiroidieni(antitiroglobulina, antiperoxidaza tiroidiană) au fost depistati crescuți la

pacientele cu avort recurent comparativ cu lotul martor(p<0,05), pe seama pacientelor cu 3 sau mai
 multe pierderi spontane de sarcină. Între valorile acestor autoanticorpi la pacientele cu 2 avorturi
spontane și cele ale lotului martor nu s-au determinat diferențe semnificative statistic.

14. Nu s-a determinat diferență semnificativ statistică între prevalențele anticorpilor antitiroidieni în
funcție de tipul de avortul recurent, primar sau secundar.

15. La femeile cu avort recurent idiopatic, insulinemia şi insulino-rezistența sunt crescute comparativ cu
femeile fără avorturi spontane, dar sunt necesare trialuri clinice randomizate de confirmare a acestor
ipoteze. Recomandăm ca tuturor femeilor diagnosticate cu avort recurent să li se măsoare glicemia a
jeun şi nivelul insulinemiei serice.

16. Pe baza protocoalelor internaționale de investigare și tratament precum și a rezultatelor tezei,

propunem un protocol propriu de investigare a pacientelor cu avort recurent.
 UNIVERSITY OF MEDICINE AND PHARMACY “IULIU HAŢIEGANU”CLUJ-NAPOCA

SUMMARY OF THE PhD THESIS

Immunological features in patients

diagnosed with recurrent pregnancy
loss

PhD student Corina-Alina Matiș

Thesis adviser Acad.Prof.dr.Florin Vasile Stamatian

2015
 SUMMARY

INTRODUCTION
11
CURRENT STATE OF KNOWLEDGE 17
1. INTRODUCTION
19
1.1. The importance of the matter
19
1.2. Epidemiology 19

2. RECURRENT PREGNANCY LOSS 21

2.1. The definions of spontaneous and recurrent pregnancy loss 21

2.2. The subgroups of recurrent pregnancy loss 21
2.3. Integration of epidemiology in research 22
2.3.1. The number of spontaneous pregnancy losses in obstetrical history 22
2.3.2. Maternal age 22
2.3.3. Familial aggregation 23
2.3.4. Partner specificity 23
2.3.5. Lifestyle 23
2.3.6. Clinical association 23
2.3.7. Socio-economic factors 24
3. EMBRYONIC DEVELOPMENT AND EMBRYO-MATERNAL IMMUNOREACTIVITY 25
3.1. Molecules involved in the celular apoptosis 25
3.2. Early embryo-maternal signalling 26
4. IMMUNOLOGY OF RECURRENT PREGNANCY LOSS 27
4.1. Introduction. Immunological recurrent pregnancy loss 27
4.2. Recurrent miscarriage associated with antiphospholipid antibodies 27
4.3. Recurrent miscarriage associated with antinuclear antibodies 29
4.4. Recurrent miscarriage associated with antithyroid antibodies 29
4.5. Preventive immunotherapy in recurrent pregnancy loss 30

5. GENETICS OF RECURRENT PREGNANCY LOSS 31

5.1. Introduction. Frequency 31
5.2. Types of genetic abnormalities and recurrent pregnancy loss 31
5.3. Recurrent aneuploidies 32
5.4. Structural abnormalities 32
5.5. Polygenic transmission 32
6. ENDOCRINOLOGY OF RECURRENT PREGNANCY LOSS 33
6.1. Luteal phase deficiency 33
6.2. Hyperprolactinemia 33
6.3. Thyroid pathology 34
6.4. Inhibins 34
7. ANTIPHOSPHOLIPIDIC SYNDROME AND RECURRENT PREGNANCY LOSS 35
7.1. Introduction. The etiology of antiphospholipidic syndrome 35
 7.2. Mecanisms of recurrent pregnancy loss in antiphospholipidic sindrome 35
7.3. Antiphospholipidic syndrome diagnosis –isotypes and detection methods of 35
antiphospholipidic antibodies
8. COAGULATION DEFECTS AND RECURRENT PREGNANCY LOSS 37
8.1. Fibrinogen deficiencies 37
8.2. Hereditary deficiencies of Factor XIII 37
8.3. Thrombophilia 38
8.3.1. Introduction. Pathophisiological mecanisms 38
8.3.2. Obstetrical complications of thrombophilia 38
9. UTERINE ANOMALIES AND RECURRENT PREGNANCY LOSS 39
9.1. Introduction. Mullerian duct defects classification 39
9.2. Acquired pathological conditions associated with recurrent abortion 39
9.3. Investigation of uterine integrity 40

PERSONAL CONTRIBUTION 41
1. 1. WORK HYPOTHESIS. OBJECTIVES 43
2. GENERAL METHODOLOGY 45
2.1. General characteristics of study group 46
2.2. Predicting the number of spontaneous pregnancy losses using external and internal factors 51
3. STUDY 1. THE PREVALENCE OF POSITIVE DIAGNOSIS TESTS IN PATIENTS WITH TWO
53
VERSUS THREE OR MORE SPONTANEOUS PREGNANCY LOSSES
3.1. Introduction 53
3.2. Material and method 57
3.3. Results 58
3.4. Discussions 59
4. STUDY 2. EVALUATION OF CELLULAR IMMUNITY BY DETERMINATION OF LYMPHOCYTES 61
TH1/TH2 ACTIVITY IN PATIENTS DIAGNOSED WITH RECURRENT PREGNANCY LOSS
4.1. Introduction 61
4.2. Material and method 62
4.3. Results 64
4.4. Discussion 66
5. STUDY 3. LYMPHOCYTE B AND T PERIPHERAL BLOOD IMUNOPHENOTYPING AND NK- 69
CELLS ANALYSIS IN PATIENTS WITH RECURRENT PREGNANCY LOSS IN COMPARISON
TO HEALTHY WOMEN
5.1. Introduction 69
5.2. Material and method 71
5.3. Results 74
5.4. Discussion 76

6. STUDY 4. THE IMPACT OF AUTOIMMUNITY IN PATIENTS WITH RECURRENT PREGNANCY 79

LOSS. THE DETECTION OF ANTITHYROGLOBULIN ANTIBODIES, THYROID
ANTIPEROXIDASE, LUPIC ANTICOAGULANT, ANTICARDIOLIPINIC ANTIBODIES AND
ANTIBETA2GLICOPROTEIN1
6.1. Autoimmune recurrent pregnancy loss 79
6.1.1. Antithyroid antibodies 80
6.1.1.1. Objective 80
 6.1.1.2. Material and method 80
6.1.1.3. Results 81
6.1.1.4. Discussion 82
6.1.2. Antiphospholipinic antibodies 83
6.1.2.1. Objective 85
6.1.2.2. Material and method 85
6.1.2.3. Results 86
6.1.2.4. Discussion 87
7. STUDY 5. FASTING INSULINEMIA AND INSULIN RESISTANCE MAY BE CORELATED TO 89
RECURRENT IDIOPATIC PREGNANCY LOSS
7.1. Introduction 89
7.2. Material and method 90
7.3. Results 91
7.4. Discussions 93

8. INVESTIGATION PROTOCOLS FOR RECURRENT PREGNANCY LOSS 95

9. GENERAL CONCLUSIONS 99
10. ORIGINALITY AND INNOVATIVE CONTRIBUTION OF THE THESIS 10
1
REFERENCES

Key-words: recurrent pregnancy loss, immune etiology, interleukin, lymphocyte immunophenotyping,

autoimmunity, antuthyroid antibodies, antiphospholipidic syndrome
 CURRENT STATE OF KNOWLEDGE

Recurrent pregnancy loss is one of the most frustrating problems for the obstetricians. The etiological
approach must be done multidisciplinary and includes haematology, endocrinology, diabetes, clinical
genetics, etc. There are many studies attempting to provide solution related to both etiology and treatment,
but very few were conducted in our country. The current study is to our knowledge the only Romanian
addressing population diagnosed with recurrent miscarriage and provides a stratification of etiologic factors
involved.
In more that 50% of the cases there is no etiological factor identified for recurrent pregnancy loss
couples. Parental karyotype testing, antiphospholipidic antibodies, hysterosalpingography, thrombophilia or
endocrine disorders testing remain negative. As pointed out by a recent study, the chance of a pregnancy to
term is around 50-60% for the women diagnosed with recurrent idiopatic pregnancy loss.
In the first part of the thesis there are chapters and sub-chapters describing the current state of
knowledge about the recurrent pregnancy loss. The data are of great interest, found in recent studies with
promising results.
This part of the thesis clarifies general issues of terminology, classification, incidence, risk factors, etiology
and pathophysiology of recurrent pregnancy loss. Involvement of immune pathology is evident from the
initial stages of implantation, which is why native immunoreactivity was detailed. Some of the etiological
factors are discussed in detail such as genetics, endocrinology, antiphospholipid syndrome, thrombophilia,
uterine abnormalities.

PERSONAL CONTRIBUTION
1. WORK HYPOTHESIS. OBJECTIVES

Cercetarea factorilor imunologici a urmat patru direcții principale: asocierea avortului recurent cu
interleukine specifice, cu celulele natural killer, cu autoanticorpii și respectiv creșterea rezistenței la insulină
și a insulinemiei preprandiale. Pentru că patologia este rară, majoritatea studiilor au fost de tip caz-control,
raportarea făcându-se la un lot de control fără pierderi spontane de sarcină, cu cel putin o naștere la termen.
In an attempt to assess the relationship between immune pathology and recurrent pregnancy loss,
we conducted investigations concerning three immunological directions: autoimmunity, as evidenced by the
presence of specific autoantibodies; humoral immunity and cellular respectively. The objectives were: to
describe the hierarchy of etiologic factors in the population, the formulation of hypotheses on prognostic
factors, immunological assessment of the link between immune pathology and recurrent recurrent pregnancy
loss, quantifying this relationship, and finally propose a protocol for investigation and treatment of recurrent
pregnancy loss adapted to study population.
The research of immunological factors followed four main directions: recurrent miscarriage association with
specific interleukins, natural killer cells, autoantibodies and the increase in insulin resistance and fasting
insulinemia. Because the pathology is rare, most studies were case-control type, the comparison being made
to a control group of women without pregnancy losses, at least one birth at term .

2. GENERAL METHODOLOGY

The studies included patients who addressed the I Gynecology Clinic Cluj-Napoca between the 1st of
January 2009 and the 31st of December 2009 and Section of Obstetrics and Gynecology Sibiu, respectively
Fertility Center Polisano between the 1st of January 2010 and 31st of December 2012. 108 patients were
inclueded, who experienced at least two spontaneous pregnancy losses, with gestational age below 20 weeks
or fetus weigh less than 500 grams. The pregnancy was documented by histopathology after curettage or
ultrasound examination. Primary recurrent abortion was defined as at least two miscarriages without
obtaining a viable fetus and secondary recurrent miscarriage was defined as at least two miscarriages after a
pregnancy with a viable fetus. Ectopic and molar pregnancies were excluded from the study.
Patients included in the case group are non-pregnant patients at a distance of at least 6 weeks from
the abortive event. After signing an informed consent to participate in the study, a urine pregnancy test was
conducted. Only patients with negative pregnancy test were included in the study. We performed a detailed
general and obstetric anamnesis, followed by a detailed examination. Only patients with previous
pregnancies documentation were included in the study (ultrasound examination showing the presence of
gestational sac or histopathological results demonstrating pregnancy).
Evaluation tests for recurrent pregnancy loss were then conducted: maternal and paternal karyotype from
peripheral blood by G banding, gynecological transvaginal ultrasound and hysterosalpingography, multiple
blood tests (the blood withdrawal was performed for all patients in the same phase of the menstrual cycle).
The patients in the case group were patients who were diagnosed with idiopathic recurrent miscarriage or
recurrent pregnancy loss (depending on the study). Patients included in the control group met the following
inclusion criteria: older than 18 years, signed informed consent to participate in the study, obstetric history
with at least one birth at term and had no spontaneous pregnancy losses.

3. STUDY 1. THE CORRELATION BETWEEN OBSTETRICAL HISTORY AND RISK FACTORS IN

RECURRENT PREGNANCY LOSS

INTRODUCTION
The first study investigated the controversy over the definition of recurrent miscarriage: when should more
complex investigations begin in a couple diagnosed with recurent pregnancy loss- two or three miscarriages?
The objective was to compare the frequency of specific positive diagnostic tests in patients with 2 and 3 or
more pregnancy losses.
MATERIAL AND METHOD
The study included patients who addressed the I Gynecology Clinic Cluj-Napoca between the 1st of
January 2009 and the 31st of December 2012. The inclusion criteria were: non-pregnant patients, at least 6
weeks after the abortive event, with at least 2 spontaneous pregnancy losses that were documented by
histopatological exam or ultrasound, with an signed informed consent to participate in the study. Molarand
ectopic pregnancies were excluded, but also therapeutic abortion and patients below 18 years old.
After anamnesis, general and local examination, the following tests were performed for couple evaluation:
both partners peripheral blood karyotype by G banding, hysterosalpingography, determination of
antiphospholipid antibodies: lupus anticoagulant, anticardiolipin antibodies and anti- beta2glicoprotein1
(positive results were retested at 12 weeks interval), TSH, fasting glicemia, thrombophilia (only certain
homozygous forms were at interest). The results of these tests were classified as negative in case of normal
range and as positive when were out of range.
RESULTS
108 patients were included in the study, of which 75 had 2 pregnancy losses and 33 had 3 or more pregnancy
losses. When comparing the results of the abnormal tests, p value was > 0.05, demonstrating that there is no
statistically significant difference between the frequencies of abnormal results in the two groups, suggesting
that couples should begin testing at two miscarriages.
The number of pregnancy losses correlates with maternal age and the risk of future losses: the risk of a
miscarriage after 3 miscarriages is 40%. Toxic factors: smoking, caffeine, alcohol and drugs are proven risk
factors for sporadic spontaneous pregnancy loss, but are not correlated with recurrent pregnancy loss only to
the extent that consumption and doses are maintained.
Hierarchical multiple regression was used to assess the ability of the five measures (maternal age, number of
previous miscarriages, paternal age, coffee consume, the quantity of cigarettes smoked) to predict the future
number of spontaneous pregnancy losses. The most important contributor to the model is maternal age,
which has the highest value Beta- significant proportion of unique explained variance (beta = 0.5, p <0.001),
followed by the number of previous miscarriages and the number of cigarettes smoked. Paternal age and
coffee consumption did not contribute significantly to the model.
 CONCLUSION
The equal frequency of abnormal results in 6 of 7 tests applied to both groups suggested that
investigation for recurrent miscarriage patients should be started at 2 miscarriages.

4. STUDY 2. THE EVALUATION OF CELLULAR IMMUNITY BY DOSING THE TUMOR NECROSIS

FACTOR- α, INTERLEUKIN-4, INTERLEUKIN-6, INTERLEUKIN-10 AND LYMPHOCYTE
ACTIVITY DETECTION THELPER1/THELPER2 IN PATIENTS DIAGNOSED WITH RECURRENT
PREGNANCY LOSS

INTRODUCTION
The study assesses cellular immunity through specific interleukins. The hypothesis of the study is
that in women with recurrent miscarriage lymphocytes activation is in inverse ratio compared to women
without this pathology.
MATERIAL AND METHOD
The study included patients who addressed the I Gynecology Clinic Cluj-Napoca between the 1st of January
2009 and the 31st of December 2012. The study group included: patients diagnosed with recurrent pregnancy
loss in which no etiologic factor was detected, therefore diagnosed with idiopathic recurrent miscarriage, and
control group which included women with at least one birth at term, without spontaneous pregnancy loss.
Interleukins exclusively produced in maternal compartment were dosed, for both lymphocyte lines.
All patients included in the study were tested for interleukins in the peripheral venous blood by an enzyme
immunoassay method; TNF-alpha and IL-6 were detected, produced by lymphocytes THelper1 exclusively in
the maternal compartment with a proinflammatory and prothrombotic effect, stimulating phagocytosis and
the production of PGE2; also IL-10, IL-4, produced in the maternal compartment were assessed, with an anti-
inflammatory and immunosuppressive role, inhibitors of interleukin produced by T2Helper-lymphocytes,
monocytes, and activated NK cells. The most important parameter is not the absolute value of these dosages,
but the ratio of TNF-alpha / IL-10 and TNF-alpha / IL-4, as a marker of predominant activation of one of the
two lines of lymphocytes.
RESULTS
La compararea mediilor interleukinelor proinflamatorii cu lotul de control, lotul de cazuri a prezentat valori
mai mari semnificativ statistic, dar interleukinele produse de limfocitele THelper2 au avut valori similare în
cele două loturi. IL-6 la este semnificativ statistic mai mare la lotul pacientelor cu avort recurent idiopatic
decât la lotul martor, t(69,62)=3,12(2,84±2,27pg/ml vs 1,61±1,06pg/ml, p<0,01). TNF-alfa este semnificativ
mai mare la lotul pacientelor cu avort recurent idiopatic decât la lotul martor, t(70)=2,56,(1,75±1,43pg/ml vs
1,09±0,66pg/ml;p<0,05). Media raportului TNFa/IL-10 la lotul pacientelor cu avort recurent idiopatic este
semnificativ mai crescută decât la lotul martor, t(57,67)=2,55, p<0,05. Media raportului TNF-alfa/IL-4 la lotul
pacientelor cu avort recurent idiopatic este semnificativ mai crescută decât la lotul martor, t(54,19)=2,77,
p<0,01. Raporturile menționate au fost semnificativ statistic mai mari la lotul de cazuri, traducând un status
proinflamator, protrombotic la pacientele cu avort recurent idiopatic.
When comparing the mean values of proinflammatory interleukins with the control group, the group of cases
showed significantly higher values, but interleukins produced by lymphocytes THelper2 values were similar
in the two groups. IL-6 is significantly higher in the group of patients with idiopathic recurrent pregnancy
loss than in the control group, t (69.62) = 3.12 (2.84 ± 2,27pg / ml vs 1.61 ± 1,06pg / ml, p <0.01). TNF-alpha
is significantly higher in the group of patients with idiopathic recurrent miscarriage than the control group, t
(70) = 2.56, (1.75 ± 1,43pg / ml vs 1.09 ± 0,66pg / ml; p <0.05). Mean values of TNF-alpha / IL-10 in the case
group is significantly higher than in the control group, t (57.67) = 2.55, p <0.05. Mean valuea of TNF-alpha /
IL-4 in the case group is significantly higher than in the control group, t (54.19) = 2.77, p <0.01. Ratios
mentioned were statistically higher in the group of cases, showing a proinflammatory and prothrombotic
status in patients with idiopathic recurrent miscarriage.
 CONCLUSION
The two interleukins produced exclusively in the maternal compartment by Thelper1
lymphocytes(TNF-alpha and IL-6) had significantly increased titers in patients with recurrent pregnancy loss
compared to control group. There are no differences between interleukins titers produced by lymphocytes
Thelper2 between groups. The ratios of TNF-alpha / IL-10 and TNF-alpha / IL-4 were significantly higher in
the group of cases, showing predominant Thelper1 lymphocytes activation.

5. STUDY 3. IMMUNOPHENOTYPING OF T AND B LYMPHOCYTES FROM PERIPHERAL BLOOD

AND NK CELLS ANALISYS IN PATIENTS WITH IDIOPATHIC RECURRENT PREGNANCY LOSS
COMPARED TO THE PATIENTS WITHOUT THIS PATHOLOGY. CASE-CONTROL STUDY

INTRODUCTION
The study compares peripheral lymphocyte immunophenotyping in women with idiopathic
recurrent pregnancy loss and healthy women with at least one birth at term. NK cells belong to the innate
immunity, having a CD3-CD56 + phenotype; there are 2 NK cell subsets: NK-dim with predominant cytotoxic
effect and NK- bright, which stimulates cytokine production. Their role is to initiate and regulate the
remodeling of the spiral arteries, but also limiting trophoblastic invasion process through growth factors:
vascular endothelial growth factor, placental growth factor and cytokine growing immunological tolerance:
IL-10 or IL-8.
MATERIAL AND METHOD
The study included patients who addressed the I Gynecology Clinic Cluj-Napoca between the 1st of January
2009 and the 31st of December 2012. The study group included: patients diagnosed with recurrent pregnancy
loss in which no etiologic factor was detected, therefore diagnosed with idiopathic recurrent miscarriage, and
control group which included women with at least one birth at term, without spontaneous pregnancy loss.
The peripheral lymphocyte immunophenotyping was performed in all patients.
RESULTS
The study included 72 patients, 22 in the study group and 50 patients in the control group. The types of
lymphocytes for which the statistically significant differences were obtained were: cytotoxic T lymphocytes
and NK cells were increased in the study group and regulatory lymphocytes were increased in the control
group. Total CD3 + Tlymphocytes, Thelper CD3 + CD4 +lymphocytes and CD19 + B lymphocytes were similar
in both groups, no statistically significant differences were determined.
Cytotoxic T cells are significantly higher in the study group compared to controls, t (70) = 0.17, with the mean
value 75.34% and 95% CI [73.57; 77.11]; mean value 68.82% in the control group and 95% CI [66.67; 70.87],
p<0.05.
CD3-CD16 + CD56 + NK lymphocytes are significantly higher in the study group, compared to controls, t (70)
= 2.34. Mean value in the study group is 27.46% IC [26.27, 28.65] and in the control group was 22.5% , IC
[20.8; 24.17], p <0.05.
CD8 + CD28- regulatory lymphocytes are significantly higher in the control group compared to study group, t
(70) = - 4.08. Mean value in the study group was 20.92%, with IC [19.54; 22.3] and in the control group the
mean value was 31.59 with IC [29.23; 33,95] p <0.001
CONCLUSION
This study is to our knowledge the only one in Romania achieving lymphocyte immunophenotyping analysis
assessing preconceptuale immunological status of patients with idiopathic recurrent pregnancy loss
compared with patients without this condition. It has been shown that there is an increase in the percentage
of NK cells, cytotoxic lymphocytes CD3 +/ CD8+, and a decrease of regulatory lymphocytes compared to the
control group. These observations support the idea of immunological activation of NK cells and T lymphocyte
subpopulations involved in the etiopathogenesis of recurrent pregnancy loss.
 6. STUDY 4. AUTOIMMUNITY IMPACT IN PATIENTS WITH RECURRENT PREGNANCY LOSS:
ANTITHYREOGLOBULIN ANTIBODIES, THYROID ANTIPEROXYDASE, LUPIC
ANTICOAGULANT, ANTICARDIOLIPINIC ANTIBODIES, ANTI BETA-2-GLICOPROTEIN-1

INTRODUCTION
The study assessed the antithyroid and antiphospholipidic antibodies in patients diagnosed with recurrent
pregnancy loss, compared to women without this pathology
MATERIAL AND METHOD
130 patients who addressed the I Gynecology Clinic Cluj-Napoca between the 1st of January 2009 and the 31st
of December 2012 were included in the study, from which 81 were included in the study group and 49 in the
control group. Patients in the study group were diagnosed with recurrent pregnancy loss, the women in the
control group had at least one term birth, and no spontaneous pregnancy loss.

RESULTS
Antithyroid autoantibodies were statistically increased in patients with recurrent miscarriage, but the
number of positive antibodies was low overall, so that more extensive studies are needed to obtain a valid
conclusion. 11.1% of 108 patients with recurrent miscarriage had at least 1 positive type of antiphospholipid
autoantibody detected for a period of 12 weeks.
Antithyroid autoantibodies (antithyroglobuline, thyroid antiperoxidase) were found elevated in patients
with recurrent miscarriage compared to controls (p <0.05) due to patients with 3 or more miscarriages.
Between the values of thyroid autoantibodies in patients with two miscarriages and those of the control
group, no statistically significant differences were determined.
No statistically significant difference was determined between the prevalence of antithyroid antibodies due to
type of recurrent abortion, primary or secondary.
CONCLUSION
The results show a more frequent detection of antithyroid antibodies in patients with recurrent abortion than
in healthy women without a history of miscarriage. The study confirms the possibility that even subclinical
impairment of thyroid function (subclinical hypothyroidism) is involved in the pathogenesis of recurrent
pregnancy loss. The results suggest that routine investigation of antithyroid autoimmunity with thyroid
status screening should be performed in women with recurrent miscarriage, especially those with 3 or more
pregnancy losses.

7. STUDIUL 5. FASTING INSULINEMIA AND INSULIN RESISTANCE MAY BE CORELATED TO

RECURRENT IDIOPATIC PREGNANCY LOSS. CASE-CONTROL STUDY

INTRODUCTION
The study discusses insulinemia and insulin resistance in patients with recurrent miscarriage. Peripheral
insulin resistance causes an increase in the activity of PAI-1 and ovarian production of androgens, by
subtracting the binding protein of insulin-like growth factors, the expression of glicodelin and endometrial
integrin. Insulin-resistance was quantified by an index called HOMA-IR which is calculated based on fasting
blood glucose and fasting insulinemia.
MATERIAL AND METHOD
The selection of patients was made as follows: in the study group were included patients diagnosed with
idiopathic recurrent miscarriage, excluding patients with diabetes or micropolycystic ovary syndrome,
conditions in which the peripheral insulin resistance is known to be high. The control group included patients
with at least one birth at term without known pathology. After fasting for 12 hours, peripheral venous blood
was collected and fasting glycemia was determined by oxido-reductase method and also fasting insulinemia
was determined by an immunoenzymatic method.
 RESULTS
Between the two groups that included 65 patients in the study group and 53 patients in the control group,
there were no statistically significant differences regarding age or body mass index. Fasting plasma glucose
was significantly higher in the control group compared to the group of cases (79.8 ± 10.1 mg / dL vs. 85.6 ±
13.1 mg / dl, p <0.01); HOMA-IR index was higher in the study group, with statistical significance (2.98 vs.
1.69, p <0.05).
CONCLUSION
It is recommended that not only fasting glucose but also fasting insulinemia should be assessed in patients
diagnosed with recurrent miscarriage, given the benefit that these patients might have of metformin.

GENERAL CONCLUSIONS

1. The diagnosis of immunological recurrent miscarriage is most often a diagnosis of exclusion.

2. Using hierarchical multiple regression, we propose a predictive equation for the number of miscarriages,
having as important factors in terms of statistical significance the maternal age, the number of spontaneous
pregnancy loss of and number of cigarettes smoked.

3. Frequency of abnormal tests in patients with two versus three or more miscarriages is statistically similar,
so we propose start investigating patients after two pregnancy losses.

4. In patients with idiopathic recurrent miscarriage average total lymphocytes, total CD3 + T lymphocytes,
helper T lymphocytes CD3 + CD4 +, CD19 + B-cells are not significantly increased compared to the control
group.

5. Cytotoxic T lymphocytes are significantly higher in the group of patients with idiopathic recurrent
miscarriage compared with the control group, t (70) = 0.17, p <0.05.

6. CD8 + CD28- regulatory lymphocytes are significantly higher in the control group compared to the group of
patients with idiopathic recurrent miscarriage, t (70) = - 4.08, p <0.001.

7. NK CD56 +CD3-CD16 + lymphocytes are significantly higher in the group of patients with idiopathic
recurrent miscarriage compared to the control group, t (70) = 2.34, p <0.05.

8. IL-6 is significantly higher in the group of patients with idiopathic recurrent pregnancy loss than the
control group, t (69.62) = 3.12 (2.84 ± 2,27pg / ml vs 1.61 ± 1, 06pg / ml, p <0.01).

9. TNF-alpha is significantly higher in the group of patients with idiopathic recurrent pregnancy loss than the
control group, t (70) = 2.56, (1.75 ± 1,43pg / ml vs 1.09 ± 0,66pg / ml ; p <0.05).

10. TNF-alpha / IL-10 in the group of patients with idiopathic recurrent pregnancy loss is significantly higher
than in the control group, t (57.67) = 2.55, p <0.05.
11. TNF alpha / IL-4 in the group of patients with idiopathic recurrent pregnancy loss is significantly higher
than the control group, t (54.19) = 2.77, p <0.01.

12. The TNF-alpha / IL-10 and TNF-alpha / IL-4 reports were significantly higher in the group of cases, the
activation demonstrated a predominance of the Th1 to Th2.
13. Antithyroid autoantibodies were found elevated in patients with recurrent pregnancy loss compared to
controls (p <0.05) due to patients with 3 or more pregnancy losses. No significant differences were
determined between the values of these autoantibodies in patients with two miscarriages and those of the
control group.

14. No statistically significant difference was determined between the prevalence of antithyroid antibodies in
terms of type of recurrent abortion, primary or secondary.
15. In women with idiopathic recurrent pregnancy loss, insulinemia and insulin resistance are increased
compared to women with miscarriages, but randomized clinical trials are needed to confirm these
hypotheses. We recommend that to all women diagnosed with recurrent pregnancy loss the fasting glicemia
and fasting insulinemia should be measured.

16. On the basis of international investigation and treatment protocols and the results of the thesis, we
propose a protocol for investigating the patients with recurrent pregnancy loss.