Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Cea mai importantă trăsătură a ipotezei Watson-Crick din punct de vedere genetic, este
fundamentarea faptului că, cele două catene ale ADN dublu-helix sunt complementare şi că replicarea
fiecăreia în catene complementare noi, conduce la formarea a două macromolecule de ADN duplex fiice,
care prezintă în structură câte o catenă de la macromolecula de ADN parental, proces, numit
replicare semiconservativă.
Experimentele realizate de către M. S. Meselson şi F. W. Stahl în anul 1957 au demonstrat că
macromoleculele de ADN se replică prin modelul semiconservativ, model postulat de Watson şi Crick. Astfel,
aceștia au reuşit să identifice o metodă de separare a acizilor nucleici în funcţie de greutatea lor moleculară
prin ultracentrifugare în gradient de CsCl (clorură de cesiu). Au utilizat şi o metodă de marcaj radioactiv a
nucleotidelor, cu izotopi ai azotului: 14N (este izotopul normal al azotului, prezent în natură) şi 15N (azotul
greu). Moleculele marcate cu 15N diferă extrem de puţin ca și greutate moleculară, faţă de moleculele
normale, care conţin 14N. Această diferenţă însă, poate fi pusă în evidenţă, prin ultracentrifugare, când
aceste molecule vor migra în zone diferite ale gradientului de densitate.
1.1. Celule de Escherichia coli au fost cultivate pe un mediu normal, în care toţi compuşii cu N
conţineau 14N.
Ulterior, ADN-ul acestor celule a fost separat, purificat de proteine şi ARN şi ultracentrifugat în gradient
de CsCl. În tubul de centrifigă s-a obţinut o migrare a ADN până în zona unde densitatea acestuia
era egală cu densitatea soluţiei de CsCl.
1.2. Alte celule bacteriene din aceeaşi specie, au fost cultivate pe un mediu în care toţi compuşii cu
N, aveau 15N. ADN-ul acestor celule a fost izolat, purificat şi ultracentrifugat în gradient de CsCl. În acest
caz, migrarea ADN s-a realizat în altă poziţie comparativ cu primul experiment, demonstrându-se că
acest ADN (care coţine 15N) este mai greu.
1
Ulterior, experimentul a fost continuat
2.1. Celule de Escherichia coli au fost cultivate pe un mediu greu (cu 15N) timp de mai multe generaţii,
până cînd toate componentele celulare (inclusiv ADN-ul) care conţineau azot, au devenit marcate cu
15N.
2.2. Această cultură de bacterii marcate radioactiv, a fost trecută pe un mediu cu 14N, apoi au fost lăsate
să efectueze o singură diviziune, adică să sufere o singură rundă de replicare a ADN. De la aceste
celule, a fost izolat ADN, purificat şi ultracentrifugat. Banda de ADN obţinută, a avut o poziţie
intermediară între poziţia de migrare a ADN uşor (cu 14N) şi ADN greu (cu 15N). Deci, greutatea
moleculară a acestui ADN era intermediară, deoarece fiecare macromoleculă de ADN avea o catenă
grea şi una uşoară.
2.3. S-a efectuat încă un experiment asemănător cu experimentul 2.2., dar celulele au fost lăsate să se
dividă de două ori pe mediul uşor, deci să-şi replice ADN-ul de două ori. După izolarea şi purificarea
ADN-ului, în urma ultracentrifugării s-au obţinut două benzi: una de poziţie intermediară (similar
experimentului 3) şi una în poziţie similară poziţiei de migrare a ADN-ului uşor.
2.4. Continuând experimentul, rezultatele au fost identice, doar că banda corespunzătoare
moleculelor de ADN uşor, era din ce în ce mai bogată în ADN.
2
Rădăcinile au fost puse într-o soluţie nutritivă cu adaos de timidină tritiată (timidină marcată cu
tritiu –
3H) timp de aproximativ 8 ore. Ulterior, rădăcinile au fost transferate într-o altă soluţie nutritivă fără
timidină marcată, unde au avut loc mai multe diviziuni mitotice. Pentru a determina câte diviziuni celulare s-
au realizat după transferarea rădăcinilor din mediul cu timidină marcată în mediul normal, s-a adăugat
colchicină, care inhibă formarea fusului mitotic, nepermiţând astfel cromosomilor să migreze la cei doi
poli celulari.
Experimentul lui Taylor-Woods-Hughes, prin care demonstrează modelul de replicare semiconservativă a ADN în rădăcinile de
Vicia faba.
Celulele noi rezultate din diviziune vor avea 2n = 4X = 24 cromosomi. Astefel, numărul de cromosomi
observaţi în metafază indică numărul de diviziuni care au avut loc în mediul „rece”: 24 de cromosomi după
două diviziuni, 48 de cromosomi după trei diviziuni etc. Ulterior, s-au făcut preparate microscopice prin
metoda autoradiografiei, demonstrâdu-se că în metafaza primei diviziuni (12 cromosomi), care urmează
după trecerea rădăcinilor în mediul nemarcat radioactiv, ambii cromosomi ai unei perechi au acelaşi grad de
radioactivitate. În metafaza celei de doua diviziuni (24 cromosomi) în fiecare pereche de cromosomi
apare un cromosom radioactiv şi unul neradioactiv. În metafaza celei de treia diviziuni (48 cromosomi) se
constată că 24 cromosomi sunt radioactivi şi 24 nu sunt marcați. Pe baza acestor experimente la nivel
cromosomial, s-a concluzionat că şi la eucariote, replicarea ADN se realizează după modelul
semiconservativ.
Deoarece sinteza ADN se realizează după tipul semiconservativ, în care cele două catene servesc
drept model (template) pentru catenele nou sintetizate şi informaţia genetică este
3
transmisă fidel noilor macromolecule, procesul de biosinteză al ADN a primit denumirea de
replicare.
Printre cele mai relevante experimente, privind forma cromosomului bacterian şi direcţia de replicare
a acestuia au fost realizate prin autoradiografie, urmărindu-se marcarea radioactivă a cromosomilor din celule
de Escherichia coli în diferite etape ale procesului de replicare. Celulele de Escherichia coli au fost cultivate
pe un mediu conţinând timidină tritiată, utilizatăă de bacterii în timpul replicării ADN, fiind încorporată în
cromosomi.
Macromoleculele de ADN purificat, erau întregi şi marcate radioactiv. Prin expunerea unui film
fotografic, sensibil la emisia radioactivă (3H produce scintilaţii) s-a obţinut imaginea acestor macromolecule
Modelul propus al replicării cromosomului circular bacterian a fost cel de tip (teta), datorită
formei pe care o ia cromosomul bacterian în timpul replicării.
4
Autoradiografia unei macromolecule deADN, circulară, completreplicată,delaEscherichia coli (d. Cairns, 1963)
La Escherichia coli, cromosomul are peste 400.000 de răsuciri (ture), necesare pentru
împachetarea strânsă a cromosomului, deoarece în stare relaxată ar fi mult mai lung decât celula. În plus,
acest ADN formează şi bucle. Pentru a se putea replica, fiecare catenă trebuie să se desprindă una de
cealaltă şi apoi să se dezrăsucească, fiind obligatorie apariția unei zone care să permită desfacerea întregii
structuri. Pentru a fi posibilă dezrăsucirea dublului helix, apar clivaje (tăieturi) pe una dintre catene, care
sunt reparate imediat după ce s-a efectuat derularea. Enzimele implicate în producerea clivajului
(tăieturilor) catenelor de ADN cât şi în repararea breşelor se numesc topoizomeraze Identificate atât la
procariote cât şi la eucariote.
Locul de la nivelul căruia debutează replicarea, se numeşte origine de replicare, notată ORI, iar
regiunea în care catenele parentale sunt separate şi servesc ca template, este denumită furcă de replicare.
Procesul prin care este produsă o nouă furcă de replicare în acelaşi cromosom, se numeşte iniţierea
replicării.
La virusuri, bacterii şi eucariote inferioare originea de replicare este unică, în timp ce la
eucariotele superioare, pe toată lungimea cromosomului, există mai multe origini de replicare.
Procesul de replicare al ADN circular, este declanşat de secţionarea într-un anumit punct al unei
catene, capătul liber astfel format începând o mişcare de rotaţie în jurul catenei intacte, pe măsură ce
replicarea avansează. După ce zona respectivă este replicată, catena secţionată va fi reparată şi
respiralizată de topoizomeraze.
Referitor la sensul replicării ADN, s-a concluzionat faptul că replicarea de la un singur punct de
iniţiere este bidirecţională. Ambele catene ale ADN circular parental sunt astfel replicate simultan, până
când cele două puncte de creştere se întâlnesc. În acest punct, cele două macromolecule bicatenare de
ADN se separă.
5
Replicarea bidirecţională a ADN circular la Escherichia coli
6
Replicarea conform modelului cercului rotativ este inițiată de proteina Rep, care se leagă la punctul de originea bicatenară (DSO).
Proteina clivează una dintre catene și rămâne legată la capătul 5'-fosfat liber. Capătul 3'-hidroxil este eliberat și servește drept situs de
recunoaștere pentru ADN polimeraza III. La nivelul catenei neclivate este inițiat procesul de replicare, concomitent cu deplasarea
monocatenei clivate. O dată cu finalizarea replicării monocatenei circulare, capătul 5' atașat la Rep și capătul 3' sunt unite prin
acțiunea unei fosfotransferaze. De asemeni, molecula bicatenară circulară este închisă când ADN-polimeraza ajunge în situsul
DSO. Replicarea monocatenei clivată este inițiată în punctul de origine al replicării ADN monocatenar (single-strand origin (SSO)), când
separarea de catena inițială este aproape completă. În situsul SSO, ARN polimeraza sintetizează un primer de ARN recunoscut de
ARN polimeraza III care va iniția procesul de polimerizare. După sinteză, ADN polimeraza înlocuiește primerul ARN, iar ADN-ligaza
unește capetele catenei nou sintetizate.
7
Replicarea cromosomilor eucariotelor necesită prezenţa unor factori citoplasmatici solubili, care
au rolul de a iniţia replicarea prin disocierea histonelor şi a altor proteine de la nivelul ADN-ului.
origini de replicare
5`
ADN 3`
3` 5`
unitate replicativă
5` 3` 5` 3` 5` 3` 5`
3`
ADN 5` 3` 5` 3` 5` 3`
3` 5`
5` 3` 5` 3` 5` 3` 5`
3`
ADN 5` 3` 5` 3` 5` 3`
3` 5`
5` 3`
ADN 3` 5`
5` 3`
ADN
3` 5`
Procesul de replicare al ADN este început de către proteinele iniţiatoare care se leagă de ADN şi
separă cele două catene, rupând punţile de hidrogen dintre baze (Figura 75). Deşi legăturile de
hidrogen conferă stabilitate helixului de ADN, individual, sunt considerate legături slabe.
Regiunile în care dublul helix de ADN este desfăcut de către proteina de iniţiere, se numesc
origini de replicare. Originile de replicare se caracterizează printr-o secvenţă specială de nucleotide, bogată
de perechi de baze A=T care sunt mai uşor de clivat, comparativ cu perechile G≡C. Dispozitivul de replicare
se deplasează de-a lungul macromoleculei de ADN desfăcând dublul helix, pentru a folosi fiecare
catenă ca template, în vederea sintezei unei catene complementare.
Un genom bacterian – care conţine o singură macromoleculă de ADN circular cu câteva milioane
de nucleotide, are o singură origine de replicare. Genomul uman, care este mult mai mare, are
aproximativ 10.000 origini de replicare. De aceea, la om, ca în cazul tuturor
8
eucariotelor, replicarea ADN este inițiată în mai multe puncte în acelaşi timp, ceea ce scurtează durata
replicării.
5'
3'
Situs de replicare
5'
3'
5'3'
3'
Fragmente Okazaki 5'
la nivelul catenei antisens 3' 5'
Catena sens
5'
3'
Polaritatea catenelor de ADN
Fragmentele Okazaki sunt sintetizate numai în direcţia 5'3', iar după ce au fost sintetizate
mai multe asfel de fragmente, acestea sunt legate între ele de ADN-ligază. La eucariote fragmentele
Okazaki au lungimea de 100-200 de nucleotide.
Catena de ADN care este sintetizată discontinuu (prin sinteza fragmentelor Okazaki), este numită
catenă antisens, sau revers (engl. lagging strand), iar catena de ADN sintetizată continuu, fără întreruperi se
numeşte catenă directă (engl. leading strand) sau sens.
Sinteza catenei antisens rămâne întotdeauna în urma sintezei catenei sens, deoarece
fragmentele Okazaki pot fi polimerizate, numai după ce furca replicativă s-a desfăcut cu un număr de nucleotide
egal cu lungimea acestor fragmente. Sinteza fragmentelor Okazaki se realizează în sens invers sintezei
catenei sens, însă tot în direcţia 5'3', de aceea pentru replicarea ADN este necesar un singur tip de ADN-
polimerază.
9
3.2. Enzime cu rol în replicarea ADN
Condiţia esenţială pentru replicarea ADN este desfacerea celor două catene ale helixului şi formarea
furcii de replicare, care, temporar trebuie să aibă stabilitate, procese catalizate de enzime şi proteinele
neenzimatice, care formează o structură multiproteică denumită replizom.
ADN-helicaza
5` 3`
3` 5`
3`
3` 5`
3`
3` 5`
3`
3` 5`
10
monocatena de ADN cu formare de
ADN polimeraza regiuni bicatenare de tip hair pin
3`
5` OH
3` 5`
monomeri de proteine
helix-destabilizatoare
3`
5` OH
3` 5`
4. ADN-polimerazele sunt enzime capabile să sintetizeze noile catenele de ADN pe baza catenelor
inițiale (template). La procariote, ADN-polimeraza III este implicată în replicare, în timp ce la eucariote este
prezentă ADN-polimeraza . ADN-polimerazele nu pot iniţia formarea catenei de ADN. Ele au
capacitatea numai de a extinde o catenă preexistentă pornind de la un primer de ADN sau ARN, motiv
pentru care se impune existenţa unei primaze.
5. ADN-ligaza, catalizează formarea unei legături fosfodiesterice între gruparea 3'-OH de la un capăt
al unei catene de ADN şi gruparea 5'-fosfat de la capătul celeilalte catene a dublului helix. Această reacţie
este endergonică, sursa de energie fiind NAD+ la bacterii şi ATP la
11
bacteriofagi şi eucariote. Legarea capetelor ADN este esenţială pentru sinteza macromoleculelor normale de
ADN, în cazul mecanismelor de reparare al ADN lezat, cât şi pentru tăierea catenelor de ADN în cazul
proceselor de recombinare genetică.
Lanţurile de ADN legate de către ADN-ligaza, trebuie să aparţină aceleiaşi macromolecule de ADN
dublu catenară, deoarece enzima nu poate lega două macromolecule de ADN, într-o macromoleculă
unică.
Toate aceste proteine, care formează dispozitivul de replicare se deplasează sub formă de
complex pe macromlecula de ADN, permiţând celor două catene de ADN să fie sintetizate în mod
coordonat.
ADN primaza
ADN polimeraza III fragmente Okazaki proteine
nou sintetizate helix-destabilizatoare
12
Pentru sinteza catenei sens, este necesar un singur primer ARN, numai pentru a iniția replicarea din
punctul de origine. ADN-polimeraza III (la procariote), respectiv ADN-polimeraza (la eucariote), poziţionată
iniţial la nivelul furcii replicative începe sinteza unei noi catene, în prezenţa primerului ARN, întrucât
enzima are mereu la dispoziție un capăt 3'-OH cu baze împerecheate, pe măsură ce se desface furca
replicativă.
Duplexul ADN aflat în fața locului de fixare a ADN-polimerazei III, respectiv a ADN-
polimerazei a fost în prealabil despiralizat de către ADN-helicază, în prezenţa ATP-ului. Proteinele
SSB legate la catena de ADN, păstrează starea despiralizată, extinsă şi accesibilă, asfel încât ambele lanţuri
ADN despiralizate să poată îndeplini roluri de template. În aceste condiţii, catena directă este sintetizată în
mod continuu prin acţiunea ADN-polimerazei III, respectiv a ADN-polimerazei , în direcţia 5'3'.
Sinteza catenei antisens, se realizează în salturi, la fiecare salt fiind necesar un nou primer ARN. Aceşti
primeri se sintetizează la intervale regulate și reprezintă punctele de plecare pentru sinteza fragmentelor de
ADN. Sinteza fiecărui fragment de ADN (fragment Okazaki) se termină în momentul în care ADN-
polimeraza întâlneşte capătul 5' al primerului ARN din fragmentul anterior, deja sintetizat.
ARN-primaza determină sinteza unui segment scurt de ARN primer, care la rândul lui permite
sinteza unui fragment de ADN (fragment Okazaki) sub acţiunea ADN-polimerazei III, respectiv ADN-
polimerazei . În momentul când acest fragment de ADN nou sintetizat are 1000- 2000 de
dezoxiribonucleotide la procariote şi 100-200 de nucleotide la eucariote, intervine ADN- polimeraza I, care
având activitate 5'3' exonucleazică, hidrolizează şi îndepărtează primerul de ARN. Deoarece ARN-primaza
nu are activitate de corectare a erorilor, primerii de ARN conţin un procent mare de erori, sunt marcaţi ca fiind
„copii suspecte” și sunt îndepărtaţi. Îndepărtarea fragmentelor de ARN din catena aflată în creştere lasă
anumite goluri între fragmentele Okazaki. Golurile dintre aceste fragmente sunt umplute cu
dezoxiribonucleotide corespunzătoare sub acţiunea ADN-polimerazei I. În final, intervine ADN-ligaza
pentru a lega între ele fragmentele Okazaki prin legături fosfodiesterice.
După finalizarea replicării intervine ADN-giraza, enzimă care conferă macromoleculelor nou
sintetizate starea superspiralizată negativă, necesară îndeplinirii funcțiilor biologice.
La eucariote, replicarea ADN se realizează în etapa S a interfazei, iar la procariote este continuă,
pe tot parcursul ciclului celular, în codiţii optime de cultivare.
Proteinele de pliere (chaperone) descrise atât la procariote cât şi la eucariote, reprezintă o clasă
specială de proteine cu capacitate de autopliere, având multiple funcţii esenţiale pentru menţinerea vieţii
celulare. Numeroase proteine din această clasă sunt proteine de șoc termic, care sunt sintetizate ca
răspuns la stresul termic, oxidativ sau alte forme de stres celular. Printre aceste funcţii a fost evidenţiat şi
rolul în replicarea ADN.
La procariote, în celula bacteriană de Escherichia coli s-a descris complexul de proteine
chaperone Hsp70/DnaK, cu rol în iniţierea replicării fagului (lambda).
La eubacterii au fost evidenţiate proteinele chaperone HV cu rol în stimularea transcrierii şi a
reacţiilor de recombinare specializate (transpoziţie).
13
La eucariote au fost descrise proteinele chaperone HMG1-D şi NHP 6 (la drojdii şi
nevertebrate) şi HMG1 şi HMG2 (la vertebrate) cu rol în reglarea transcrierii şi în replicarea ADN. Aceste
proteine contribuie la realizarea unei stări de suprarăsucire stabilizată a macromoleculei de ADN, necesară
proceselor de transcripție, replicare şi recombinare.
Studii recente au demonstrat că structura suprahelicală a ADN-ului este stabilizată într-o anumită
configuraţie mai mult sau mai puţin răsucită, datorită prezenţei unor proteine chaperone, atât în
celula procariotă, cât şi în cea eucariotă.
Macromolecula de ADN este macromolecula cea mai stabilă din organism. Restul structurilor
din organism se află într-un proces permanent de schimbare şi degradare, fiind permanent înlocuite.
Reînnoirea continuă a substanţelor uzate reprezintă un „sistem de compensare a degradării”
cunoscut în biologie sub numele de turnover.
14
CODUL GENETIC
În prezent, dogma nu mai este acceptată integral, deoarece au fost decoperite şi procese care
mediază alte sensuri de transmitere a informaţiei genetice.
Primul amendament la această dogmă, a fost făcut în anul 1970, când s-a descoperit fenomenul de
reverstranscripţie, fenomen prin care o matriţă de ARN este folosită pentru sinteza unei catene
complementare de ADN:
Reversranscripție
ADN ARN Proteină
Fenomenul de reverstranscripţie a fost descoperit la ARN viral şi anume la virusul HIV, care îşi introduce
genomul ARN în celula gazdă, celulă care serveşte pentru sinteza unei catene de ADN care va fi integrată în genomul
gazdei. Procesul este catalizat de reverstranscriptază – enzimă codificată de genele virale.
Reverstranscriptaza are aplicaţii largi în genetica moleculară:
Ex: se cunoaşte o proteină, însă nu se cunoaşte gena responsabilă de sinteza acesteia. Pentru
identificarea respectivei gene, se află secvenţa aminoacizilor din proteină, apoi, pe bază de
complementaritate se alcătuieşte ARNm specific proteinei cunoscute. ARNm extrage din celulă, iar cu
ajutorul reverstranscriptazei, se sintetizează secvența ADN corespunzătoare genei.
O altă neconcordanță a dogmei geneticii moleculare, o constituie descoperirea prionilor - care se manifestă ca
proteine infecţioase şi se transmit, producând degenerescenţa spongiformă a masei nervoase.
În anul 1953, lacâteva luni după descoperirea structurii macromoleculei de ADN, s-a elaborat ipoteza existenţei unui
cod genetic, care asigură traducerea informaţiei genetice din caractere specifice de acid nucleic în caractere
specifice aminoacizilor.
Se ştie că proteinele sunt alcătuite din lanţuri polipeptidice, avand la bază 20 aminoacizi diferiţi, dispuşi într-o
succesiune specifică, în funcţie de tipul de proteină. Pe de altă parte, macromoleculele de ADN sunt alcătuite din 4
tipuri de nucleotide.
1
Dacă realizăm combinații ale cele 4 simboluri câte trei (43), se obţin 64 de combinaţii, ceea ce este mai mult
decât suficient pentru codificarea celor 20 de aminoacizi. Această grupare de baze a fost denumită cod triplu.
Crick (1961-1963) aduce confirmări privind realitatea codului genetic triplu. Grupul de câte trei baze azotate
(nucleotide) care codifică poziţia unui aminoacid în lanţul polipeptidic, a primit denumirea de codon.
Codul genetic a fost definit drept un limbaj prin care secvenţa nucleotidică a unei gene este tradusă prin
intermediul ARNm, în secvenţa de aminoacizi a unui lanţ polipeptidic.
Cercetările ulterioare au adus numeroase dovezi experimentale privind codificarea informaţiei genetice,
deci a relaţiei nucleotide – aminoacizi.
Descifrarea codului genetic s-a realizat pe două căi:
- prin utilizarea unor sisteme acelulare şi ARNm artificial, cu secvenţa bazelor
cunoscută, ceea ce a permis studierea secvenţei aminoacizilor din lanţurile
polipeptidice obţinute;
- prin studiul comparativ al proteinelor normale şi mutante apărute sub influenţa
unor factori mutageni cu efect cunoscut asupra bazelor azotate ale acizilor nucleici.
Primul codon a fost descifrat folosind ARNm artificial, alcătuit numai din uracil (poli U). Experimentele au constat în
utilizarea unui extract acelular, alcătuit din ARNt, ribosomi şi enzime de Escherichia coli, un amestec de aminoacizi
cărora li s-a adăugat un ARNm artificial cu baze cunoscute, denumit poliuracil. S-a constatat că are loc sinteza unui
lanţ polipeptidic artificial format numai din fenilalanină. Concluzia experimentului a fost că aminoacidul
fenilalanină este codificat de codonul (tripleta) UUU.
În cazul în care ARNm artificial a fost acidul poliadenilic (poli A) a avut loc sinteza unui polipeptid format
numai din lizină, iar în cazul unui ARNm de tipul poli C (acid policitidilic) a rezultat un lanţ polipeptidic alcătuit
numai din prolină. S-a experimentat similar cu celelalte nucleotide, apoi în combinaţii de două, trei şi patru nucleotide,
stabilindu-se codonii (tripletele) pentru toţi cei 20 de aminoacizi proteinogeni. De exemplu, poli AG determină
încorporarea lizinei, iar poli CG, încorporarea alaninei, argininei şi prolinei în lanţul polipeptidic.
După stabilirea componenţei diferiţilor codoni funcţionali s-a urmărit descifrarea exactă a ordinii
nucleotidelor (bazelor) în codon (tripletă).
Crick a propus alcătuirea unui tabel în care să fie trecuţi codonii şi aminoacizii corespunzători (Tabel 1). Acest
tabel reprezintă dicţionarul codului genetic, în care codonii din ARNm determină poziţionarea aminoacizilor în lanţul
polipeptidic. Astfel, sunt prezentaţi cei 64 de codoni din ARNm, întrucât ARNm copie informaţia genetică şi o
transportă la locul de decodificare al acesteia, adică la ribosomi. Deci, codonii din ARNm sunt în mod direct
decodificaţi în procesul de translaţie.
Codul genetic cuprinde 64 de codoni, din care doar 61 specifică diferiţi aminoacizi (Tabel 2). Ceilalţi trei codoni:
UAA, UAG şi UGA sunt codoni STOP, necodificând aminoacizi, având doar rolul de a marca terminarea sintezei
unui lanţ polipeptidic.
Doi dintre cei 61 de codoni codificatori de aminoacizi, marchează începutul sintezei unui lanţ polipeptidic,
fiind numiţi codoni START (iniţiatori). Aceştia sunt: AUG şi GUG care specifică metionina. De aceea, toate lanţurile
polipeptidice de la eucariote şi procariote încep cu acest aminoacid.
2
Tabel 1 Codul genetic înscris în ARNm
A doua nucleotide
Prima A 3-a
nucleotidă U C A G nucleotidă
- - - -
- - - -
UUU Phe UCU Ser UAU Tyr UGU Lys U
U
UUC Phe UCC Ser UAC Tyr UGC Lys C
-
UUA Leu UCA Ser UAA STOP UGA STOP A
-
UUG Leu UCG Ser UAG STOP UGG Trp G
CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg U
C
CUC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg C
-
CUA Leu CCA Pro CAA Gln CGA Arg A
-
CUG Leu CCG Pro CAG Gln CGG Arg G
AUU Ile ACU Thr AAU Asn AGU Ser U
A
AUC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser C
-
AUA Ile ACA Thr AAA Lys AGA Arg A
-
AUG Met/START ACG Thr AAG Lys AGG Arg G
GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly U
G
GUC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gly C
-
GUA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gly A
-
GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly G
3
3. Principiile sintezei macromoleculelor biologice, ca bază pentru codul genetic
Conform dogmei centrale a geneticii, ADN direcţionează sinteza ARN, iar ARN direcţionează sinteza proteinelor
(Figura 1).
Toate cele trei categorii de molecule (ADN, ARN și proteine) sunt polimeri, iar sinteza lor se realizează după câteva
pricipii generale comune:
1. Acizii nucleici şi proteinele sunt macromolecule formate dintr-un număr limitat de tipuri de subunităţi
monomerice.
2. În timpul sintezei, monomerii se leagă unul câte unul, rezultând în final polimerul. Polimerii biologici ar
putea fi sintetizaţi prin alinierea prealabilă a subunităţilor într-o ordine corectă şi apoi legarea simultană a acestora. Însă,
în celula vie, procesul nu se desfăşoară în această manieră. Asamblarea acizilor nucleici pe de o parte şi a proteinelor
pe de altă parte este un proces care se desfăşoară „treaptă cu treaptă”, într-o singură direcţie chimică. Sinteza
acizilor nucleici începe la capătul 5' şi se continuă spre capătul 3', iar sinteza proteinelor începe la capătul amino-
terminal şi se continuă spre capătul carboxil.
3. Întotdeauna există un punct specific de pornire a sintezei, iar creşterea macromoleculei are loc într-o singură
direcţie, până la un punct terminus. Aceasta presupune existenţa unui semnal start şi a unui semnal stop.
4. Produsul primar sintetizat, de regulă este modificat. Forma funcţională a unui acid nucleic sau a unei
molecule proteice este extrem de rară, deoarece lanțul iniţial, polimeric, este în general inactiv sau incomplet. Pentru
ca lanţul respectiv să devină funcţional / activ, acționează enzime specifice. Atât catenele de ARN cât şi cele
polipeptidice, de obicei sunt scurtate, iar catenele de ADN rezultate sunt legate între ele.
Ribozomi
4
4. Cadrul de citire al codului genetic
În procesarea ARNm ţinându-se cont de faptul că ARNm primar poate să nu fie tăiat întotdeauna, în cursul
procesului de matisare, exact la nivelul graniţei dintre exon şi intron, ci cu o bază mai înainte sau mai înapoi, pot rezulta,
în final, pornind de la aceeaşi macromoleculă de ARNm primară, macromolecule de ARNm mature cu diferite secvenţe
codificatoare. De aceea, teoretic se admite că fiecare secvenţă de ARNm matur (gata procesat) poate fi tradusă
(translaţionată) în trei variante de citire (Figura 2).
Fiecare asociere de trei nucleotide poate juca rol de codon codificând un anumit aminoacid.
În principiu, o secvenţă de ARNm poate fi tradusă în oricare dintre cele trei „cadre de citire”, în funcţie de
locul unde începe procesul de decodare. Numai un singur cadru de citire codifică proteina necesară.
Din cele trei cadre de citire posibile, fiecare poate determina sinteza unei proteine, dintre care: fie numai una
singură este proteină funcţională, fie toate trei proteinele sunt funcţionale, având funcţii asemănătoare, dar nu
identice.
Figura 2 Posibilitatea sintezei unor proteine înrudite, pe baza aceluiași fragment de ADN, prin modificarea cadrului
de citire
Gln = glutamina, Thr = treonina, Ala = alanina, Ser = serina, Arg = arginina, Pro = prolina, Asp = acid aspartic, Leu = leucina
Astfel, prin tăierea transcriptului ARNm primar în diferite moduri și implicit modificarea cadrului de citire, se
explică posibilitatea sintezei unui set de proteine înrudite prin origine (pornind de la aceeași secvență codificatoare),
dar nu identice.
5
5. Caracteristicile codului genetic
1. Coliniaritatea – este corespondenţa directă dintre codonii ARNm şi secvenţele de aminoacizi din lanţul
polipeptidic sintetizat.
2. Codul genetic este degenerat – numeroşi codoni sunt sinonimi, codificând acelaşi aminoacid. Prin urmare:
2 aminoacizi: metionina şi triptofanul sunt codificaţi de câte un codon
9 aminoacizi (fenilalanina, tirozina, histidina, glutamina, asparagina, acidul aspartic, lizina, acidul
glutamic, cisteina) sunt codificaţi de câte doi codoni;
1 aminoacid (izoleucina) este codificat de trei codoni;
5 aminoacizi (valina, glicocolul, prolina, treonina, alanina) sunt codificaţi de câte patru codoni;
3 aminoacizi (leucina, serina, arginina) sunt codificaţi de câte şase codoni.
Caracteristica de cod genetic degenerat, mai este cunoscută şi sub denumirea de redundanţă. Redundanţa
constă dintr-un exces de informaţie într-un sistem, pentru a asigura transmiterea corectă a informaţiei.
3. Codul genetic este universal – aceiași codoni corespund aceloraşi aminoacizi la toate
organismele. Acest fapt a fost dovedit prin studiul proteinelor biosintetizate în sisteme celulare libere, provenite de
la bacterii şi de la mamifere, sub influenţa unor molecule de ARN sintetizate artificial. Concluzia a fost că indiferent
de originea sistemului celular, se obţin aceleaşi proteine, fapt ce constituie un argument important că aminoacizii ce
intră în alcătuirea proteinelor respective sunt codificaţi de aceiaşi codoni.
Mesajul genetic al unei specii, conţinut de acizii nucleici, este capabil să inducă sinteza proteinelor specifice într-
un sistem celular liber de la o altă specie. Toate acestea dovedesc universalitatea codului genetic, acesta fiind identic
atât la procariote, cât şi la eucariote. Astfel, universalitatea codului genetic demonstrează vechimea şi stabilitatea
sa în timp.
4. Codul genetic este nesuprapus şi fără virgule. Prin urmare, codul genetic este format din codoni care nu se
suprapun (non overlaping code), adică doi codoni succesivi nu au nici o nucleotidă comună. De asemenea, între
codoni nu există semne de separare care să marcheze începutul şi respectiv sfârşitul unui codon. Un astfel de cod se
numeşte fără virgule (commaless). Deci, codonii reprezintă unităţi de sine stătătoare, nesuprapuse. Pe de altă
parte, între sfârşitul unui codon şi începutul codonului următor, nu există nucleotide izolate.
5. Codul genetic este ambiguu – un codon poate codifica doi aminoacizi diferiţi. De pildă, codonul start AUG
codifică formil-metionina la procariote şi metionina la eucariote. Deci, un codon, uneori codifică mai mulţi aminoacizi cu
proprietăţi asemănătoare. Această însuşire a codului genetic reprezintă un avantaj evolutiv, deoarece înlocuirea
unui aminoacid cu altul printr-o mutaţie într-un lanţ polipeptidic este mai puţin dăunătoare, dacă cei doi
aminoacizi au proprietăţi asemănătoare.
6
6. Excepţii de la codul genetic universal
7
Puteau fi codificaţi astfel, toţi cei 20 de aminoacizi proteinogeni naturali.
Se constată că, actualul cod genetic este o structură foarte veche, fiind considerat drept cod degenerat
pentru că are 64 de posibilităţi pentru numai cei 20 de aminoacizi diferiţi.
Prin diferite experimente, s-a dovedit că pot să apară erori de translaţie a informaţiei de la codul genetic la
proteine, obţinându-se proteine modificate (mutante). Un codon de tip UUU ce codifică fenilalanina, poate fi
implicat într-o mutaţie, deoarece poate determina apariţia în catena polipeptidică, în loc de fenilalanină, a leucinei
care este codificată de UUG.
Astfel, poziţia a treia din codon poate fi afectată cel mai frecvent de astfel de erori, ea fiind ultima în evoluţia
codului, deci cea mai labilă.
Poziţia unu din codon este de asemenea labilă, ocupând locul doi în inducerea de mutaţii.
Poziţia a doua din codon are stabilitatea cea mai mare, putând induce mai rar mutaţii. Dacă acestă poziţie este
afectată, pot apare urmări grave de transmitere a informaţiei genetice, cu apariţia de forme moleculare letale. Cei care
se nasc cu astfel de mutaţii, mor în primii doi ani de viaţă. Bolile lizozomale sunt exemple de astfel de mutaţii.
S-a constatat că în evoluţia moleculară a mecanismului de transmitere a informaţiei genetice, există o fază
decisivă în care funcţia ARN este preluată de ADN. Aceasta a dus la un mare succes evolutiv, deoarece ADN are
anumite caracteristici structurale şi funcţionale, superioare macromoleculei de ARN în privinţa transmiterii
informaţiei. Astfel, ADN-ul conţine timină, mai stabilă faţă de uracil.
De asemenea, ADN-ul conţine dezoxiriboză în loc de riboză. Dezoxiriboza nu are gruparea HO din poziţia 2,
care induce o sensibilitate la hidroliză, motiv pentru care ADN este mai stabil comparativ cu ARN.
ADN-ul este dublu catenar, ceea ce permite şi repararea rapidă a macromoleculei proprii, în cazul unei
modificări moleculare.
Cea mai importatntă caracteristică a ADN-ului constă în faptul că el conţine întregul set de gene care codifică
informaţia, precum şi sistemele de control pentru sinteza moleculelor complexe, atât pentru propria structură, cât şi
pentru ARN, proteine şi alte structuri moleculare.
Pentru transmiterea informaţiei de la ADN la alte structuri este necesară o moleculă adaptor,
reprezentată de ARN transportor care are două funcţii de recunoaştere:
- recunoaşterea aminoacizilor transportaţi la poliribosomi;
- recunoaşterea codonului din ARNm şi realizarea poziţiei codon-anticodon, ce asigură plasarea corectă a unui
aminoacid în catena polipeptidică.
Astfel, ARNt are o structură moleculară specifică acestei funcţii, ce asigură legarea aminoacidului prin
specificitatea de acceptare şi plasarea lui în catenă, prin specificitatea de transfer de la nivelul anticodonului.
Transmiterea informaţiei genetice implică structuri moleculare precise ce asigură procese succesive ca: replicarea
ADN-ului, transcrierea de la ADN la ARNm, traducerea de la ARNm în proteină.
8
TRANSCRIPŢIA
Transcripţia este procesul prin care regiuni din ADN (gene) sunt copiate în ARNm cu ajutorul enzimelor
ARN-polimeraze. Transcripţia mai este cunoscută şi sub numele de expresie a genelor.
Toate cele trei tipuri de ARN celular (ARNm, ARNr, ARNt) se sintetizează printr-un mecanism complex
cunoscut sub numele de transcripţia ADN. Rolul principal în acest proces biosintetic îl joacă enzima ARN-
polimeraza-ADN-dependentă care necesită în calitate de substrat cei patru ribonucleosid- 5'-trifosfaţi (ATP, GTP, CTP,
UTP), a ionilor de Mg2+ şi Mn2+, precum şi prezenţa în calitate de template a ADN dublu-catenar.
Secvenţele de ARNm sunt în aşa fel prezentate, astfel încât sinteza să se desfăşoare de la stânga la dreapta,
adică în direcţia 5’ 3’ (Figura 1)
ARN-polimerazele sunt molecule proteice mari, unele din ele având molecula alcătuită din mai multe
subunităţi. De exemplu, ARN-polimeraza din Escherichia coli este o enzimă care conţine în moleculă patru
subunităţi, notate cu , , şi , alături de ioni de zinc. Masa moleculară a acestei enzime este de 495.000
daltoni. Se presupune că enzima respectivă recunoaşte situsul start din promotor prin subunitatea .
La eucariote există diferite ARN-polimeraze pentru cele trei tipuri de ARN transcris, în timp ce la
procariote există o singură ARN-polimerază care este implicată în transcrierea celor trei tipuri de ARN.
Deosebirea esenţială dintre cele trei ARN-polimeraze ale eucariotelor, constă în localizarea celulară şi
în funcţiile acestora:
- ARN-polimeraza I este localizată preponderent în nucleol şi catalizează biosinteza ARN ribosomal.
- ARN-polimeraza II este localizată în principal în nucleoplasmă şi este implicată în biosinteza ARN
mesager (ARN informaţional) ce va fi decodificat în procesul translaţiei informaţiei genetice.
- ARN-polimeraza III este localizată în nucleoplasmă şi participă la biosinteza ARN transportor,
precum şi la transcrierea moleculelor foarte mici de ARN 5S, molecule care intră în structura
ribosomilor.
1
Biosinteza ARN sub acţiunea ARN-polimerazei-ADN-dependente se desfăşoară în patru etape:
ARN polimeraza
(RNAP)
RNAP eliberează
RNAP se atașează templateul de ADN și secvență de terminare
la promotor secvență de inițiere a transcriptul primar de ARN a transcripției (TTS) / STOP /
transcripției (TSS) 5'-
secvență transcrisă secvență de inițiere a poliadenilării 3'-
promotor UTR
UTR
ORF intron (UTR) exon (ORF) UTR ORF
5' TATA
3'
3' 5'
-35 -10 -1 +1 +10
codon START
sensul deplasării RNAP 3'
secvențe de recunoaștere
5' poli-A
G
CH3 pre-ARNm
Figura 2 Structura unei unităţi de transcriere TSS=Transcriptional Start Site, TTS=Terminal Transcription Site, ORF=Open
Reading Frame, UTR=untranslated region
- Poziţia bazelor azotate este numerotată în ambele sensuri începând cu situsul start, a cărui primă
nucleotidă primeşte numărul +1. Numărul bazelor azotate este prezentat crescător spre dreapta şi
descrescător spre stânga. Nu există nici o bază căreia să îi fie alocată valoarea 0.
- După legarea la promotor, are loc desfacerea (despiralizarea) dublului helix de ADN, formându- se aşa-
numita buclă de transcripție sau complex deschis (Figura 3), la nivelul căruia punţile de hidrogen
scindează.
- În genom există și secvențe reglatoare ale activității genelor, la nivelul cărora se atașează proteine
activatoare sau represoare. Aceste secvențe reglatoare sunt localizate la distanțe de sute de kilobaze
- Factorii de transcripție sunt reprezentați de un grup de proteine implicate în inițierea și reglarea transcripției.
Acești factori, prezintă domenii de legare la secvențe specifice de ADN, cu rol în dirijarea polimerazei
către situsul start.
2
Figura 3 Formarea buclei de transcripţie şi iniţierea sintezei ARN
- Recunoașterea secvenței TATA-box de către subunitatea TBP (TATA-box binding protein) a factorului
de transcripție TFIID, inițiază asamblarea complexului de transcripție. Următoarele proteine care se
atașează, sunt TFIIA și TFIIB, care stabilizează complexul și direcționează polimeraza II (Pol-II)
asociată cu TFIIF. Ultimul factor de transcripție care va fi atașat la complexul de preinițiere este TFIIH, cu rol
în denaturarea macromoleculei de ADN (Figura 4).
TFIID
TFIIE
TFIIA TBP TFIIB TFIIF
TFIIH
5'
TATA
3'
3' 5'
promotor
RNAP
2. Inițierea biosintezei – din situsul start se iniţiază biosinteza lanţului de ARN când ARN- polimeraza
debutează prin reacţia dintre ATP sau GTP cu o a doua moleculă de ribonucleosid-trifosfat,
rezultând un dinucleotid care mai conţine un radical ortofosfat la capătul 3' (Figura 5). Succesiunea
bazelor azotate din promotor nu este transcrisă în catena de ARN nou sintetizat.
3
A sau G X
+
P P P P P P
OH OH
PPi
A sau G X
P P P P
OH
3. Elongarea catenei de ARN se realizează prin legarea succesivă a câte unui nou ribonucleotid la gruparea
OH liberă din poziţia 3' a dinucleotidului, respectiv a polinucleotidului precedent (Figura 6).
TSS TTS
5'-UTR 3'-UTR
promotor
5'
TATA
3'
3'
3' A
5'
U
C
G
secvențe de recunoaștere
pre-ARNm
TSS TTS
5'-UTR 3'-UTR
promotor
5'
TATA
3'
3'
3' A 5'
U
C
G
secvențe de recunoaștere
pre-ARNm
G
5'
CH3
- Formarea legăturilor fosfodiesterice între ribonucleotide se realizează numai în direcţia 5'3', ceea ce
înseamnă că ARN-polimeraza începe să acţioneze la capătul 3' al catenei de ADN ce urmează a fi
transcrisă. Catena template de ADN formează cu catena de ARN aflată în creştere un hibrid molecular
ADN-ARN temporar, prin intermediul punţilor de hidrogen ce se stabilesc între bazele azotate
complementare (Figura 7). Deci, catena de ARN nou sintetizată este complementară catenei
antisens de ADN.
4
- ARN-polimeraza înaintează, despiralizează helixul ADN și expune succesiv alte baze, astfel încât
macromolecula de ARN se extinde cu câte o nucleotidă din direcţia 5' spre 3'. Pe parcursul elongării
catenei de ARN, după trecerea polimerazei se reface structura dublu catenară a ADN transcris.
- O dată cu părăsirea situsului exit de eliberare a transcriptului, moleculele de pre-ARNm sunt metilate la
guanozina din capătul 5’, process denumit capping.
regiune de regiune de
spiralizare despiralizare
5'
TATA
3'
3'
3' 5'
AU
C
G
situs de intrare
a ribonucleotidelor
secvențe de recunoaștere
catenă antisens pre-ARNm situs catalitic
G
5'
CH3 situs de eliberare
a pre-ARNm
ADN
ARN ARN
STOP
STOP START
START
1µm
Figura 8 Imagine electronomicroscopică a transcripției – sunt sintetizate molecule multiple de ARN la nivelul aceleiași gene.
START/STOP = situsurile de inițiere/terminare a transcripției. Se observă o diferență graduală de lungime a moleculelor de
transcript ARN din situsurile START către situsurile STOP (modificată după Miller and Beatty, 1969)
4. Terminarea transcripției - elongarea ARN continuă până când polimeraza ajunge la o altă secvenţă
specială de pe ADN, formată din trei nucleotide, numită secvență stop. Unele semnale de terminare sunt
recunoscute de ARN-polimerază, iar altele de aşa-numitul „factor p”, care este o proteină specifică cu
masa moleculară de 200000 daltoni. În momentul în care ARN- polimeraza ajunge în dreptul situsului
stop, ea se desprinde de pe ADN, eliberându-se în acelaşi timp şi molecula de ARN transcris (Figura 9).
- Terminarea transcripției în cazul polimerazelor I și II este dependentă de complexe proteice implicate în
clivajul ARNm – ADN și procesele de poliadenilare la capătul 3’. În cazul polimerazei III, terminarea
transcripției este independentă de acești factori (Figura 9).
5
secvență de terminare
a transcripției (TTS) / STOP /
secvență de inițiere a
secvență de inițiere a poliadenilării 3'-
transcripției (TSS) 5'-
secvență transcrisă UTR
promotor UTR
ORF intron (UTR) exon (ORF) UTR ORF
5' TATA
3'
3' 5'
-35 -10 -1 +1 +10
codon START 3'
Viteza de polimerizare a ARN este de 40 nucleotide / secundă, la 37C. De exemplu, o catenă de ARN
având în structură 5000 de nucleotide se sintetizează în aproximativ 2 minute.
Macromoleculele de ARN astfel sintetizate sunt apoi supuse maturării post-trascripţionale.
Există şi ARN-polimeraze care acceptă ca template, o catenă de ARN. Aceste ARN-polimeraze sunt
dependente de ARN, deoarece în lipsa acestuia nu au potenţialul de a cataliza procesul de polimerizare.
Aceste enzime care au fost denumite ARN-polimeraze-ARN-dependente, sau replicaze.
Cele două tipuri de enzime: ARN-polimeraza-ADN-dependentă şi ARN-polimeraza-ARN- dependentă
(replicaza) au un impact considerabil asupra lumii vii, fiind puncte nodale în circulaţia informaţiei genetice, în
derularea proceselor de transcripţie şi de translaţie, de asemenea şi în procesul multiplicării ribovirusurilor.
Alături de cele două tipuri de ARN-polimeraze, în boisinteza ARN mai este implicată o enzimă, numită
poliribonucleotid-fosforilaza. Poliribonucleotid-fosforilaza a fost descoperită de M. Grunberg- Manago şi S. Ochoa în
anul 1955. Această enzimă este precursorul ARN-polimerazelor. Există şi o polidezoxiribonucleotid-
fosforilază, care este precursorul ADN-polimerazelor.
Prima modificare constă în aplicarea la capătul 5' (capăt care este primul sintetizat în timpul transcripţiei) a
unei molecule de 7-metil guanozin trifosfat. Acest proces se numeşte 5'-capping. Capătul 5'-metilat are un rol foarte
important în iniţierea sintezei proteice, precum şi de a asigura protecţia împotriva degradării enzimatice a
macromoleculei de ARN.
6
A doua modificare are loc la capătul 3' al moleculei de ARN, imediat după ce ARN-polimeraza a depăşit
regiunea terminator a genei transcrise. La această extremitate a ARN, se ataşează o secvență poliadenilică formată
din 50 – 250 de nucleotide cu adenină (acid adenilic). Respectivul proces este realizat de către o polimerază
numită polimeraza poli-A.
A treia modificare constă în acoperirea întregului lanţ de ARNm cu un strat de proteine care îl protejează
de ataculendonucleazelor.
Splicing – Intronii care trebuiesc înlăturaţi au mărimi variabile, cuprinse între 80 şi 10 000 de nucleotide.
Singurele secvenţe importante din structura intronilor sunt, cele implicate în excizia prin splicing. Aceste secvenţe
acţionează ca markeri, sunt localizate la cele două capete ale fiecărui intron, fiind denumite secvenţe de consens.
Secvenţa specifică de la capătul 5' al intronului poartă numele de situs donor, iar cea de la capătul 3' se numeşte
situs acceptor.
În timpul procesării ARN transcris primar, are loc ruperea catenei de ARN la nivelul secvenţelor de consens
ale intronului, îndepărtarea întregului intron şi unirea celor doi exoni care erau despărţiţi iniţial de intronul excizat.
În nucleul celulelor există o serie de complexe macromoleculare formate din proteine şi ARN cu secvenţă
foarte scurtă, de aproximativ 250 de nucleotide. Aceste complexe, notate cu U1, U2, U3, ... U12, sunt denumite
ribonucleoproteine mici (snRNP- small nuclear ribonucleoprotein particles), cu un rol esenţial în procesarea
ARN transcris primar.
În timpul procesării, moleculele de snRNP (U1 şi U2) se leagă la situsul donor şi respectiv la situsul
acceptor, apoi asociindu-se cu alte molecule de snRNP, formează complexe moleculare mari, numite
spliceosomi. Aceste particule de mărimea unui ribosom, apropie şi unesc cele două capete ale intronului, astfel
încât să poată avea loc excizia intronilor. snRNP prezintă subunități ARN cu rol de a recunoaşte secvenţele de
nucleotide care marchează începutul şi sfârşitul fiecărui intron (situsurile donor şi acceptor). După asamblarea
spliceosomului procesul de excizie a intronului decurge în două trepte (Figura 10):
- în prima etapă are loc ruperea lanţului ARN la nivelul situsului donor şi legarea capătului liber 5' la o
adenină din apropierea situsului acceptor, formându-se astfel o buclă;
- în etapa a doua are loc ruperea ARN la nivelul situsului acceptor şi legarea capetelor libere
ale exonilor.
snRNP snRNP
U1 U2
Adăugarea de snRNP
și activarea unităților de splicing
snRNP snRNP
U1 U2
7
clivajul intronului
5' exon (ORF) exon (ORF) 3' 5' 3'
la nivelul situsului
donor
ARNm matur
Figura 10 Mecanismul de excizie a intronilor şi de îmbinare a exonilor pentru formarea ARNm matur
După realizarea acestor modificări, toţi intronii sunt îndepărtaţi, iar exonii se îmbină unii cu alţii, rezultatul
fiind o macromoleculă de ARN mult mai scurtă, care conţine o secvenţă informaţională continuă. La sfârșitul
acestei etape, rezultă ARNm matur sau funcţional, care poate părăsi nucleul pentru a iniţia translaţia.
În cazul eucariotelor, se cunoaște fenomenul de splicing alternativ sau diferențial, cu rol în creșterea
diversității proteinelor codificate la nivel de genom. În cazul omului, se consideră că 95% dintre genele
multiexonice prezintă acest proces de splicing alternativ. Este un proces reglat în timpul expresiei genelor, care
permite includerea sau excluderea anumitor exoni din transcriptul final de ARNm. Astfel, proteinele sintetizate
din diferitele variante de ARNm, vor prezenta diferențe în secvențele de aminoacizi și în funcțiile biologice. Prin
splicing alternativ, genomul uman este capabil să sintetizeze mult mai multe proteine, decât ar fi posibil prin prezența
celor aproximativ 20.000 de gene codificatoare.
Procariote Eucariote
8
Figura 11 Transcripţia la eucariote (stânga) şi la procariote (dreapta)
Procariote şi Eucariote
copierea unei singure catene din segmentul de ADN care reprezintă gena
9
Translația informației genetice
Proteinele sunt macromolecule liniare, alcătuite din aminoacizi. Secvenţa aminoacizilor din proteină
– numită structură primară – este determinată de structura unei gene specifice.
La baza procesului complex de biosinteză a proteinelor stă principiul sintezei complementare pe (template)
matriţă, principiu întâlnitt atât la replicarea ADN cât şi la biosinteza ARN. În procesul de biosinteză a proteinelor se
foloseşte drept matriţă ARNm,
În sens strict, prin translaţia informaţiei genetice se înţelege traducerea secvenţei de nucleotide din ARNm, într-o
secvenţă de aminoacizi, acesta din urmă constituind structura primară a unei anumite proteine.
Procesul propriu-zis de biosinteză a proteinelor se realizează la nivelul ribosomilor, în mai multe etape:
activarea aminoacizilor, iniţierea translaţiei, elongarea, terminarea translaţiei şi modificarea post- translaţională a
proteinelor.
1. Activarea aminoacizilor: Această etapă constă în faptul că, fiecare tip de aminoacid din citoplasmă recunoaşte
prin intermediul unei enzime specifice, un ARNt specific, alături de care formează un complex activ de tipul aminoacil-
ARNt. Această recunoaştere este înalt specifică în sensul că fiecărui aminoacid proteinogen îi corespunde un anumit
ARNt şi se realizează datorită înaltei specificități de substrat a enzimei aminoacil-ARNt-sintetaza care
catalizează această reacţie.
Deci, codul genetic este translatat de două seturi de adaptori, care acţionează secvenţial şi cu mare specificitate:
aminoacil-ARNt-sintetaza care leagă un anumit aminoacid la ARNt corespunzător şi molecula de ARNt care se
ataşează prin anticodon, la codonul corespunzător din secvenţa ARNm.
Formarea complexului aminoacil-ARNt debutează prin activarea aminoacidului cu ajutorul energiei din ATP,
procesul având loc sub acţiunea aceloraşi aminoacil-ARNt-sintetaze. Se formează deci complexul hiperreactiv dintre
enzimă şi două din cele trei substrate, adică aminoacidul şi molecula de ATP. Acest complex interacţionează apoi cu
cel de-al treilea substrat care este ARNt specific al aminoacidului activat. Sub această formă, aminoacizii sunt apţi de a
intra în procesul propriu-zis de biosinteză al proteinelor (Figura 1).
legătură
macroergică
ATP AMP
triptofan
ARNtTrp
subunitate mică
Un ribosom conţine patru situsuri: unul pentru macromolecula de ARNm şi trei numite A – aminoacil-
ARNt, P - peptidil-ARNt şi E - exit.
Situsul A, numit şi situs acceptor sau situs de intrare, ţine legată o macromoleculă de ARNt care corespunde
codonului ARNm ataşat de ribosom. Înainte ca aminoacil-ARNt să intre, acest situs expune codonul care
reprezintă următorul aminoacid ce trebuie să fie adăugat la lanţul polipeptidic.
Situsul P, numit şi situs donor, sau situs peptidilic, leagă primul aminoacil-ARNt în momentul iniţierii sintezei proteinei
și ulterior va rămâne legat de lanţul polipeptidic în creştere.
Situsul E marchează locul de eliberare a ARNt din ribosom.
Situsul de legare al ARNm, situat pe subunitatea mică, asigură asocierea ARNm cu ribosomul în aşa fel încât, doi
codoni succesivi din ARNm să fie dispuşi exact în dreptul situsurilor A şi P.
Iniţierea biosintezei proteice debutează prin asocierea moleculei de ARNm la suprafaţa subunităţii
mici a ribosomului, într-un punct situat la aproximativ 10 nucleotide de capătul 5 al catenei, deoarece
„citirea” codului genetic stocat în ARNm se realizează în sensul 5 3.
Translaţia ARNm începe de la codonul AUG, iar pentru iniţierea translaţiei este necesar un ARNt special,
numit ARNt iniţiator. În cazul eucariotelor, ARNt iniţiator poartă întotdeauna o metionină, iar la bacterii, ARNt iniţiator
poartă formil-metionina. De aceea, lanţurile polipeptidice au întotdeauna metionina, respectiv formil-
metionina ca prim aminoacid al capătului aminoterminal.
Subunitatea ribosomală încărcată se leagă la capătul 5 al unui ARNm care este recunoscut datorită acoperirii sale
de către 7 metil-guanozin trifosfat. Subunitatea mică se mişcă în direcţia 5 3 de-a lungul ARNm căutând prima secvenţă
AUG (secvenţa START). Când a întâlnit AUG, factorii de iniţiere se disociază de subunitatea ribosomală mică făcând loc
subunităţii ribosomale mari, care se asamblează cu cea mică formând ribosomul funcţional.
eIF2
Met GTP
ARNt inițiator
UAC subunitate ribosomală mică cuplată cu
ARNt inițiator
3`
GTP
Met
Met
3`
3`
GTP
Met
3`
3`
La bacterii, mecanismul pentru selectarea unui codon start este diferit. ARNm bacterian nu are un capăt 5
acoperit care să semnaleze ribosomului de unde să înceapă translaţia, însă, prezintă secvenţe specifice pentru
legarea ribosomilor, secvenţe cu o lungime de şase nucleotide care sunt localizate cu câteva nucleotide înaintea
codonului AUG de la care începe translaţia.
Spre deosebire de ribosomul eucariot, ribosomul procariot se poate lega direct de un codon start din interiorul
ARNm, dacă acesta este precedat de câteva nucleotide faţă de situsul de legare al ribosomilor. ARNm procariot este
policistronic, adică deține informaţia necesară pentru sinteza mai multor proteine diferite care pot rezulta din aceeaşi
macromoleculă de ARNm. Spre deosebire de procariote, ARNm de la eucariote poartă informaţia pentru sinteza
unei singure proteine, deci este monocistronic.
3. Elongarea lanţului polipeptidic
Procesul elongării lanţului polipeptidic pe ribosom, poate fi considerat ca un ciclu în care se succed trei etape:
1. În prima etapă, o moleculă de aminoacil-ARNt se leagă la situsul A liber de pe ribosom (adiacent situsului P
ocupat), prin formarea bazelor perechi dintre ARNt (anticodonul) şi cele din codonul de pe ARNm expus în acest
situs.
Met
legarea
aminoacil-ARNt
3`
legarea
aminoacil-ARNt
Met
3`
legarea
aminoacil-ARNt
Met Phe
Thr
3` P A
Ala Gln
E
A A
ARNm U G C C G UG U U
5` A U G U U U A C G G C A C A A U A A 3`
2. În etapa a doua, reacţia catalizată de peptidil-transferază este însoţită de alunecarea subunităţii mari, faţă de
subunitatea mică. Prin această alunecare cei doi ARNt se deplasează în situsurile P şi E ale subunităţii mari, iar situsul
A rămâne liber, legând un nou aminoacil-ARNt corespunzător codonului ARNm expus în acest situs. Capătul carboxil (-
COOH) al lanţului polipeptidic este decuplat de pe ARNt din situsul P şi legat printr-o legătură peptidică la gruparea
amino liberă a aminoacidului care vine din situsul A.
3. În etapa a treia, subunitatea mică se deplasează exact cu trei nucleotide în lungul lanţului ARNm spre capătul
3 şi se alătură la subunitatea mare, iar ARNt părăseşte situsul E.
Acest ciclu în trei etape se repetă de fiecare dată când un aminoacid este adăugat în lanţul polipeptidic
care creşte de la capătul amino la capătul carboxil, până când întâlneşte un nou codon.
4. Terminarea sintezei lanţului polipeptidic
Sinteza unui lanţ polipeptidic este oprită printr-un semnal determinat de prezenţa codonilor STOP: UAA, UAG,
AGA. Aceştia nu pot fi recunoscuţi de nici un ARNt şi nu specifică un aminoacid. Rolul codonilor stop este de a
semnaliza ribosomului să oprească translaţia. Proteinele numite factori de eliberare se leagă de codonul stop care
ajunge în situsul A al ribosomului. La procariote sunt doi factori de eliberare, notaţi: RF1 şi RF2. Factorul RF1
recunoaşte codonii UAA şi UAG, iar factorul RF2 recunoaşte codonii UAA şi UGA. Există și un factor de disociere
RF3 care contribuie la disocierea RF1/RF2 după eliberarea polipeptidului. Celulele eucariote conţin doar un
singur factor de terminare notat eRF1 care recunoaşte toţi cei trei codoni stop, însă și în acest caz există un factor de
eliberare a polipeptidului, eRF3 care este o GTP-ază.
Ribosomul eliberează ARNm şi se disociază în cele două subunităţi, care se pot asambla pe o altă moleculă
de ARNm pentru a începe un nou ciclu de sinteză proteică.
ARNm poate fi tradus simultan de mai mulţi ribosomi, atât la celulele eucariote, cât şi la cele procariote.
Odată ce un ribosom s-a deplasat de pe situsul de iniţiere, un alt ribosom se poate lega de ARNm şi poate începe
sinteza unui nou lanţ polipeptidic. Astfel, un ARNm este tradus de o serie de ribosomi aşezaţi la intervale de 100-
200 de nucleotide. Grupul de ribosomi ataşaţi la o macromoleculă de ARNm este numit poliribosom sau polisom.
Fiecare ribosom din grup funcţionează independent pentru a
Met Phe
Thr Ala
UG C
C G UG U U
A U G U U U A C G G C A C A A U A A 3`
eRF1
Met Phe
Thr
Ala
ARNm
5`